維生素E對大鼠心肌缺血—再灌注損傷的影響及機(jī)制探討

陳玲玲　方侃　李龍倜

[摘要] 目的 探討維生素E（Vit E）對大鼠心肌缺血-再灌注損傷（MIRI）的影響及機(jī)制。 方法 選取雄性健康Wistar大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為Vit E組、模型組和對照組，各20只。前兩組在平左心耳下緣2 mm處結(jié)扎左冠脈前降支（LAD），30 min后松解結(jié)扣再灌注，復(fù)制MIRI模型；對照組只用絲線穿過LAD但不結(jié)扎。Vit E組在造模成功即刻肌注Vit E注射液4.5 mg/（kg·d），模型組、對照組術(shù)后肌注生理鹽水4.5 mg/（kg·d），連續(xù)給藥2周。檢測并比較不同干預(yù)對各組抗氧化指標(biāo)、缺血梗死程度及血流動力學(xué)指標(biāo)的影響。 結(jié)果 ①與模型組比較，Vit E組左心室收縮末期壓力（LVESP）明顯升高，而左心室舒張末期壓力（LVEDP）、血漿心鈉素（ANP）明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；②與模型組比較，Vit E組血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）活性/含量明顯升高，而丙二醛（MDA）含量明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；③與模型組比較，Vit E組梗死區(qū)（IA）面積、缺血危險區(qū)（IDA）面積、IA/IDA、IDA/LV均明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。 結(jié)論 Vit E通過抗氧化應(yīng)激、清除氧自由基作用改善大鼠MIRI，增強(qiáng)心臟功能。

[關(guān)鍵詞] 心肌缺血-再灌注損傷；氧化應(yīng)激；維生素E；血流動力學(xué)

[中圖分類號] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（b）-0012-04

Discussion on the influence and mechanism of vitamin E for myocardial ischemia-reperfusion injury of rats

CHEN Lingling1* FANG Kan1* LI Longti2 WANG Ping1 PENG Guihai1 WANG Chongquan1

1.Department of Cardiology， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.Nursing Department， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To discuss the influence and mechanism of vitamin E （Vit E） for myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） of rats. Methods Sixty male health Wistar rats were selected and divided to Vit E group， model group and control group by random number table method， with 20 rats in each group. For the first two groups， the left anterior descending （LAD） in 2 mm near inferior margin of left auricle was ligatured， the knot was released after 30 min and taken reperfusion， then MIRI model was duplicated. For the control group， the silk yarn just was threaded through LAD rather than taken reperfusion. For Vit E group， 4.5 mg/（kg·d） of Vit E injection was injected intramuscularly as soon as the molding was done； for the model group and control group， 4.5 mg/（kg·d） of normal saline was injected intramuscularly after the operation， and the administration was conducted successively for 2 weeks. The influences of different intervention on the antioxidant index， degree of ischemic infarction and hemodynamic index in each group were tested and compared. Results ①Compared with model group， the left ventricular end systolic pressure （LVESP） in Vit E group was significantly increased， while the left ventricular end-diastolic pressure （LVEDP）， atrial natriuretic peptide （ANP） were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）； ②compared with the model group， the contents of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， nitric oxide （NO） activity in Vit E group were significantly increased， while the contents of malondialdehyde （MDA） were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）； ③compared with model group， the area of infarction area （IA） and ischemia risk area （IDA）， IA/IDA， IDA/LV in Vit E group were significantly decreased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Vit E can improve the MIRI of rats and enhance the cardiac function through antioxidant stress， oxygen free radical removal effects.

[Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Vitamin E； Hemodynamics

冠心病（CHD）是冠脈粥樣硬化后高度狹窄導(dǎo)致相應(yīng)心肌急性缺血、壞死而引起的一系列綜合征，其病死率、致殘率較高。心血管介入治療、冠脈旁路移植及藥物溶栓等，是被廣泛運(yùn)用的再灌注方法，也是安全、有效的治療CHD的手段。但是，這些措施在治療的同時存在進(jìn)一步損傷心肌的危險[1-4]，即心肌缺血-再灌注損傷（MIRI），其機(jī)制尚不完全明了。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是MIRI導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡和功能不可逆喪失的主要機(jī)制之一[5-6]。國內(nèi)外研究均證實(shí)，維生素E（Vit E）有較強(qiáng)的抗氧化能力，對心臟疾病有綜合作用[7-9]。本研究通過冠脈前降支結(jié)扎術(shù)復(fù)制MIRI大鼠模型，采用Vit E注射液進(jìn)行干預(yù)性治療，觀察大鼠血流動力學(xué)、血清抗氧化指標(biāo)、血漿心鈉素（ANP）濃度、心肌缺血梗死程度等變化，探討Vit E抗大鼠MIRI的作用機(jī)制，從而有助于為心肌缺血性疾病提供新的治療靶點(diǎn)和防治方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

小動物呼吸機(jī)（Kent scientific，TOPO）；小動物心電圖檢測儀（Softron，SP2006）；體式顯微鏡（Olympus SZX16）；BL-420E生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。Vit E注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，1 mL∶5 mg，批號：E00161103）；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20160723）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號：20160622）、丙二醛（MDA，批號：20160826）、一氧化氮（NO，批號：20160902）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；人ANP檢測試劑盒（Abbott Laboratories，批號：10266FL00）；伊文思藍(lán)（Sigma）；1%氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康Wistar大鼠60只，雄性，SPF級，6～7周，體重（200±20）g，購于湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，質(zhì)量合格證號：NO.42000900000119；造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，自由飲食，每天光照12 h，室溫20～24℃；剔除逃避反應(yīng)明顯遲緩者。

1.3 復(fù)制MIRI模型與分組

用2%的戊巴比妥鈉、按120 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺，接小動物呼吸機(jī)和心電圖機(jī)，在胸骨左緣第4～5肋間隙開胸暴露心臟，在體視顯微鏡下辨認(rèn)左冠脈前降支（LAD）。參照線圈提拉法[3]，用帶6-0線的縫合針，在平左心耳下緣2 mm處，經(jīng)LAD深面穿過心肌表層、套繞LAD，且在結(jié)扎線下墊入兩個線圈。結(jié)扎LAD后，可見左心室前壁下部心肌變白，局部收縮，運(yùn)動受限，左心耳怒張，心電圖顯示ST段呈弓背向上抬高，即心肌缺血制作成功。隨后將兩個線圈的線頭分別置于切口兩側(cè)并留在體外，逐層關(guān)閉胸腔。缺血30 min后，拉出線圈、拉開結(jié)扎線，此時心電圖ST段抬高部分回落，判斷再灌注成功。待大鼠蘇醒后，拔管，置于38℃保溫毯上過夜。MIRI大鼠模型制作成功后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為兩組：Vit E組，模型組。各20只。另取20只大鼠麻醉、開胸后，絲線只穿過冠脈，但不結(jié)扎，確定為對照組。

1.4 給藥

Vit E組造模成功即刻，從大腿后部肌注Vit E注射液4.5 mg/（kg·d）（按成人肌注50 mg/d計(jì)算，大鼠每天等效劑量=50 mg/70 kg×6.3=4.5 mg/kg，按照1.0 mL/kg配制液體），連續(xù)給藥2周；模型組、對照組術(shù)后肌注生理鹽水4.5 mg/（kg·d），連續(xù)給藥2周。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 血流動力學(xué)測試 于造模前及給藥2周時，麻醉動物后，在心電監(jiān)護(hù)下分離左頸總動脈，將連接有壓力換能器、肝素化的PE導(dǎo)管插入左頸總動脈至左心室，分別檢測并記錄左心室收縮末期壓力（LVESP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）。

1.5.2 生化檢測 血流動力學(xué)測試完畢，取大鼠動脈血6 mL，按3000 r/min（離心半徑13.5 cm）、4℃離心10 min，分離出血漿，分裝入不同EP管，置-20℃冰箱保存、待測。①遵循試劑盒說明書操作步驟、檢測血清SOD、GSH-Px、MDA、NO含量；②采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測大鼠血漿ANP濃度，所有操作均按照人ANP檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 伊文思藍(lán)-TTC染色 于取血畢，再次打開胸腔，結(jié)扎冠脈，在心尖注射1%伊文思藍(lán)0.5 mL，此時非缺血區(qū)心肌被染成藍(lán)色，其余心肌即為缺血危險區(qū)（IDA）。立即摘取心臟、沖洗殘血，切除結(jié)扎線以上心肌，置-20℃冰凍30～40 min，取出后沿左心室（LV）長軸的垂直方向切片，厚1 mm，8～10片，浸泡于1% TTC溶液中37℃孵育10 min；此時梗死區(qū)（IA）心肌呈灰白色，缺血區(qū)心肌被染色紅色。在掃描心肌切片后，采用Image Pro Plus 6.0軟件分別計(jì)算LV面積（全部心肌）、IDA面積（紅色+白色）和IA面積（白色）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組間比較運(yùn)用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)對MIRI大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

對照組給藥2周時4項(xiàng)抗氧化指標(biāo)（SOD、GSH-Px、NO、MDA）與造模前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）；而模型組、Vit E組各項(xiàng)指標(biāo)組內(nèi)差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。給藥2周時，與對照組比較，模型組大鼠SOD、GSH-Px活性和NO含量明顯降低，MDA含量升高；與模型組比較，Vit E組大鼠SOD、GSH-Px活性和NO含量明顯升高，MDA含量降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表1。

2.2 不同干預(yù)對MIRI大鼠心肌梗死區(qū)、缺血區(qū)程度的影響

兩組LV面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。給藥2周時，與模型組比較，Vit E組IA面積、IDA面積、IA/IDA、IDA/LV均明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表2。

2.3 不同干預(yù)對MIRI大鼠血流動力學(xué)及血漿ANP含量的影響

給藥2周時，與對照組比較，模型組LVESP明顯降低，而LVEDP、血漿ANP明顯升高；與模型組比較，Vit E組LVESP明顯升高，而LVEDP、血漿ANP明顯降低；差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表3。

3 討論

人體細(xì)胞在正常代謝過程中，不斷地產(chǎn)生自由基，同時也不斷地清除自由基，二者處于動態(tài)平衡之中。在心肌缺血-再灌注狀態(tài)下，氧自由基（ROS）產(chǎn)生過多，可攻擊核酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)等體內(nèi)的生命大分子，使這些物質(zhì)發(fā)生過氧化變性、交聯(lián)和斷裂，且損傷生物膜，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞，甚至細(xì)胞死亡[10-12]。研究表明，心肌缺血-再灌注時，可產(chǎn)生四大病理生理過程，即自由基劇增、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞激活以及微循環(huán)障礙，且均與自由基的產(chǎn)生和作用密切相關(guān)[13-17]。

本研究結(jié)果顯示，給藥2周時，Vit E組血清SOD、GSH-Px、NO活性/含量比模型組明顯升高，而MDA含量明顯降低。這可能是維生素E強(qiáng)力清除自由基的結(jié)果。研究證明，一分子的Vit E提供的電子能與兩分子自由基上未配對的電子結(jié)合，從而清除自由基，阻斷自由基過氧化的連鎖反應(yīng)[14-15]。自由基清除后，對生命大分子物質(zhì)攻擊減少，SOD、GSH-Px活性因而升高；Vit E亦可通過促進(jìn)基因表達(dá)，提升SOD、GSH-Px活性。NO含量升高，與內(nèi)皮細(xì)胞的NO合酶活性增加有關(guān)；NO是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生最重要的舒血管因子，NO水平增加，表明血管內(nèi)皮功能和微循環(huán)功能改善[16]。脂類過氧化中斷，其標(biāo)志物MDA產(chǎn)生減少、含量降低。而SOD、GSH-Px活性提高又可以加強(qiáng)對自由基的清除，形成良性循環(huán)。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，給藥2周時，Vit E組缺血、梗死程度比模型組明顯降低。這是因?yàn)?，?yīng)用外源性Vit E后，中斷了自由基氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)，恢復(fù)了自由基代謝的動態(tài)平衡，從而阻斷自由基對心肌的再損傷；同時血管內(nèi)皮功能增強(qiáng)，微循環(huán)有效灌注增多，由此，心肌缺血梗死狀態(tài)逐漸改善[13-14]。

本研究結(jié)果還顯示，模型組血漿ANP濃度升高，與之相對應(yīng)的心肌舒縮功能降低，左心室ESP下降和EDP升高。血漿ANP水平升高是左心室功能障礙的標(biāo)志[12-18]。使用Vit E后，血漿ANP水平降低，心肌舒縮功能增強(qiáng)，同時左心室ESP升高和EDP下降。說明Vit E在平衡自由基代謝、降低心肌缺血梗死狀態(tài)的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步改善左心室功能[6，19]。

總之，Vit E可能通過對抗氧化應(yīng)激、清除氧自由基，而阻止心肌缺血-再灌注損傷，從而增強(qiáng)心肌功能。然而，其抗炎機(jī)制、抗細(xì)胞凋亡機(jī)制也可能參與其中[20-24]，互相協(xié)助，共同促進(jìn)Vit E效果的表達(dá)。但Vit E準(zhǔn)確而肯定的調(diào)控心肌缺血-再灌注損傷的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2017-11-17 本文編輯：張瑜杰）