腦特異性新生血管抑制因子1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

魏建昌　胡鶴　王強(qiáng)

[摘要] 目的 探究腦特異性新生血管抑制因子1（BAI1）在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。 方法 2016年5月～2017年7月，購(gòu)買(mǎi)包含有208個(gè)結(jié)直腸癌和8個(gè)正常結(jié)腸組織及其臨床信息的組織芯片。查詢癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，內(nèi)含192例結(jié)直腸癌患者的mRNA表達(dá)信息。通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織芯片正常結(jié)腸組織與結(jié)直腸癌組織中BAI1表達(dá)的情況，檢測(cè)BAI1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法和Log-rank秩檢驗(yàn)方法進(jìn)行生存曲線。最后使用Cox回歸模型進(jìn)行單變量分析和多變量分析，判斷BAI1對(duì)預(yù)后的判斷價(jià)值。 結(jié)果 BAI1在結(jié)直腸癌組織中的含量較正常組織顯著上升（P < 0.001）。高BAI1表達(dá)與臨床分期（P = 0.004）和腫瘤浸潤(rùn)（P = 0.006）相關(guān)。癌癥基因組圖譜（TCGA）中結(jié)直腸癌患者的BAI1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步提示了較晚的臨床分期（P = 0.027）、較嚴(yán)重的腫瘤浸潤(rùn)（P = 0.021）的結(jié)直腸癌中BAI1表達(dá)水平更高。Kaplan-Meier生存曲線提示BAI1 mRNA高表達(dá)的患者比低表達(dá)水平的患者總生存期明顯減少（P = 0.02）。BAI1 mRNA的高表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素（HR = 2.895，95%CI：1.012～8.281，P = 0.047）。 結(jié)論 BAI1與結(jié)直腸癌的惡性相關(guān)。BAI1的高表達(dá)可能提示結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] 腦特異性新生血管抑制因子1；結(jié)直腸癌；臨床病理學(xué)特征；獨(dú)立預(yù)后因素

[中圖分類(lèi)號(hào)] R442.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）07（b）-0008-04

Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 in colorectal cancer and its correlations with clinicopathological features of colorectal cancer patients

WEI Jianchang* HU He* WANG Qiang CHEN Zhuanpeng YANG Ping ZHANG Tong CAO Jie

Digestive Disease Center， the First People′s Hospital of Guangzhou City， Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To explore the roles of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 in colorectal cancer and its correlations with clinicopathological features and prognosis of CRC patients. Methods Fom May 2016 to July 2017， tissue microarray with 208 CRC， 8 normal colon tissues and the clinical information was purchased. The cancer genome atlas （TCGA） dataset is a publicly available dataset with 192 primary CRC patients and the mRNA expressions. BAI1 in TMA of CRC and benign glandular epithelium cells was checked by immunohistochemistry. The exlpore the connection between the express of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 with clinicopathological features. Overall survival curve was analyzed by Kaplan-Meier method and Log-rank test. Univariate analysis and multivariate analyses were analyzed with Cox proportional hazards regression to assess the prognostic value of high BAI1 expression for CRC patients. Results BAI1 was localized in the cytoplasm of CRC and benign glandular epithelium cells， showing higher protein levels in CRC tissues compared with normal colon samples （P < 0.001）. High BAI1 protein expression was associated with high pathological grade （P = 0.039）， advanced clinical stage （P = 0.004） and enhanced tumor invasion （P = 0.006）. The cancer genome atlas （TCGA） mRNA expression further showed that BAI1 was upregulated in CRC with advanced clinical stage （P = 0.027） and enhanced tumor invasion （P = 0.021）. Kaplan-Meier survival curves revealed that CRC patients with higher BAI1 mRNA levels had shorter overall survival than those with lower expression （P = 0.02）. High BAI1 mRNA expression was an independent influence of factor for prognosis of CRC （HR = 2.895； 95%CI： 1.012-8.281； P = 0.047）. Conclusion BAI1 ralates to aggressive CRC. High BAI1 expression may predict poor prognosis of CRC patients.

[Key words] Brain-specific angiogenesis inhibitor 1； Colorectal cancer； Clinicopathological features； Independent prognostic factor

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見(jiàn)的消化惡性腫瘤，在全球癌癥相關(guān)死亡排名中排名第四[1]。目前雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與CRC進(jìn)展密切相關(guān)[2-3]，但是完整的分子機(jī)制仍是不確定。因此，有必要尋找新的標(biāo)志物，并進(jìn)一步闡明CRC的生物學(xué)特性，從而改善治療效果，改善患者預(yù)后。

腦特異性血管生成抑制因子1（brain-specific angiogenesis inhibitor 1，BAI1）主要表達(dá)于人腦，位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜當(dāng)中，當(dāng)以基因轉(zhuǎn)染的方式在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，主要表達(dá)在細(xì)胞膜上[4]，是黏附G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員[5]。作為一種膜蛋白，BAI1的胞外區(qū)域包含有5個(gè)TSP-1型重復(fù)序列和7個(gè)跨膜區(qū)域，由野生型p53誘導(dǎo)生成。其主要功能為抗血管生成[6-7]。幾項(xiàng)研究表明，在包括肺腺癌[8]、胃癌[9]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[10-12]在內(nèi)的幾種癌癥中，BAI1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)了。并且最近有人發(fā)現(xiàn)在腎癌中BAI1 mRNA和蛋白水平降低，且與微血管密度呈負(fù)相關(guān)，這說(shuō)明了BAI1可能可以作為腎癌臨床基因治療的一個(gè)突破口[13-14]。Meisen等[15]還發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，BAI1表達(dá)明顯降低，且高表達(dá)水平與較好的預(yù)后有關(guān)。然而，關(guān)于BAI1在結(jié)直腸癌中的作用仍是不清楚的，本研究探討結(jié)直腸癌中BAI1的表達(dá)及其與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，具體如下：

1 材料與方法

1.1 組織樣本

組織芯片（TMA，Cat No. CO2161）從艾麗娜生物技術(shù)有限公司（西安）購(gòu)買(mǎi)，包含208個(gè)結(jié)直腸癌、8個(gè)正常結(jié)腸組織及對(duì)應(yīng)患者的臨床信息。本研究排除了在手術(shù)前接受化療或放療的患者。癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù)，包含192例結(jié)直腸癌患者的mRNA表達(dá)信息及臨床數(shù)據(jù)（http：//www.cbioportal.org/study.do？cancer_study_id=coadread_tcga_pub）。

1.2 免疫組織化學(xué)測(cè)定

使用DakoEnVision Systems（Dako Diagnostics，Switzerland）進(jìn)行免疫組織化學(xué)測(cè)定。通過(guò)蛋白水解消化和過(guò)氧化物酶處理組織芯片，再使用兔的抗人BAI1多克隆抗體（ab135907，1∶100，Abcam）在4℃的環(huán)境中孵育一晚。用磷酸鹽緩沖液清洗之后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體和底物染色劑，以顯示蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.3 免疫組化評(píng)分

由艾麗娜生物技術(shù)有限公司（西安）掃描組織芯片，使用ImageScopev11軟件（美國(guó)加州Vista，CA）進(jìn)行評(píng)估。由2名病理學(xué)家分別對(duì)染色水平進(jìn)行了半定量評(píng)估。組織的染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色記為0分；弱染色記1分；中度染色記2分；強(qiáng)染色記3分。在同一時(shí)間內(nèi)評(píng)估標(biāo)本的染色百分比：0～25%記1分；>25%～50%記2分；>50%～75%記3分，>75%～100%：記4分。免疫組化評(píng)分（immunoreactivity score，IRS）由強(qiáng)度和染色百分比兩者相乘，0～12分。對(duì)比2名病理學(xué)家給出的評(píng)分，如有不同則二人協(xié)商一致。以此評(píng)價(jià)BAI1表達(dá)水平，并將樣本分為高表達(dá)（IRS> 4分）和低表達(dá)（IRS≤4分）兩組[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法和Log-rank秩檢驗(yàn)方法對(duì)生存曲線進(jìn)行分析；采用Cox回歸模型進(jìn)行單變量分析和多變量分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)腸組織中BAI1表達(dá)水平的比較

對(duì)組織芯片進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)BAI1蛋白水平（圖1A，封三）。如圖1C～E（封三）所示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，BAI1有不同表達(dá)。按IRS將將樣本分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組。193個(gè)CRC樣本中（免疫組化染色后遺失了15個(gè)組織樣本），20例（10.4%）表現(xiàn)為BAI1低表達(dá)，173例（89.6%）為BAI1高表達(dá)。8例正常結(jié)腸組織中，7例（87.5%）表現(xiàn)為BAI1低表達(dá)，1例（12.5%） 為BAI1高表達(dá)。結(jié)直腸癌組織中的BAI1水平高于正常結(jié)腸組織（P < 0.001）（圖1B，封三）。

2.2 組織芯片中結(jié)直腸癌組織中BAI1高表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床分期以及腫瘤浸潤(rùn)的關(guān)系

將組織芯片結(jié)直腸癌樣本按臨床病理特征分類(lèi)，進(jìn)一步評(píng)估BAI1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征是否有關(guān)。BAI1高表達(dá)與臨床分期（P = 0.004）以及腫瘤浸潤(rùn)（P = 0.006）有關(guān)。見(jiàn)表1。

2.3 臨床病理學(xué)特征與男性結(jié)直腸癌患者BAI1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系

為了進(jìn)一步驗(yàn)證組織芯片的發(fā)現(xiàn)，本研究分析了來(lái)自TCGA的原發(fā)結(jié)直腸癌患者的mRNA表達(dá)情況。202例男性結(jié)腸癌患者，排除其中10例臨床資料不完整者。結(jié)直腸癌組織中，較晚的臨床分期（P = 0.027）和較深層次的腫瘤浸潤(rùn)（P = 0.021）對(duì)應(yīng)的BAI1 mRNA表達(dá)水平更高。男性樣本較女性而言，BAI1 mRNA表達(dá)水平更高（P = 0.036）。見(jiàn)表2。

2.4 BAI1高表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

為了解BAI1高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，取TCGA的數(shù)據(jù)庫(kù)里BAI1表達(dá)水平均值為（13.72±29.59），以此為標(biāo)準(zhǔn)將病例為高、低BAI1表達(dá)組[2]，用Kaplan-Meier曲線來(lái)比較BAI1 mRNA水平高和低的患者的臨床結(jié)果之間的不同（圖2）。高低BAI1表達(dá)組手術(shù)后的總生存期分別為（36.367±4.362）、（36.367±4.827）個(gè)月。與低表達(dá)組比較，高表達(dá)組結(jié)直腸癌患者總生存期較短（Log-rank= 5.44，P = 0.02）。采用Cox回歸模型處理TCGA組數(shù)據(jù)，檢測(cè)BAI1與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。單變量分析提示BAI1是結(jié)直腸癌一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后因子（HR = 3.147，95%CI：1.136～8.716；P = 0.027）。多變量分析進(jìn)一步確定BAI1高表達(dá)是CRC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子（HR = 2.895，95%CI：1.012 ～8.281；P = 0.047）。見(jiàn)表3。

3 討論

BAI1是腫瘤抑制因子TP53[6]的目標(biāo)基因，結(jié)構(gòu)中有一個(gè)胞外區(qū)域，由5個(gè)TSP-1型重復(fù)序列和7個(gè)跨膜區(qū)域構(gòu)成[5]，3個(gè)TSP-1重復(fù)序列構(gòu)成的重組多肽具有抗血管生成活性[6]。并且BAI1被認(rèn)為可能是p53的抗血管生成作用的旁分泌效應(yīng)的受體[16]。

也有一些研究表明，BAI1在癌組織中表達(dá)下調(diào)了，并且BAI1主要起到了血管生成抑制劑的作用[17-18]。Fukushima等[19-20]于1998年首次在結(jié)直腸癌中檢測(cè)到BAI1，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)被下調(diào)，并與血管侵襲、轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，故認(rèn)為BAI1可能抑制了結(jié)直腸癌的血管生成和轉(zhuǎn)移。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。如前所述，BAI1主要存在于結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與正常的結(jié)腸組織相比，其表達(dá)是升高的。且BAI1的表達(dá)上調(diào)與臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)有關(guān)。通過(guò)對(duì)TCGA中結(jié)直腸癌患者的BAI1 mRNA表達(dá)情況的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，確定了較晚的臨床分期和腫瘤浸潤(rùn)增強(qiáng)與BAI1上調(diào)有著重要關(guān)聯(lián)。本研究觀察到BAI1高表達(dá)與CRC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移沒(méi)有相關(guān)性，這可能與M1組樣本容量有限有關(guān)。

進(jìn)一步比較TCGA中不同BAI1表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的總生存期，BAI1高表達(dá)的患者總生存期較短。通過(guò)Cox回歸模型可知BAI1高表達(dá)可能是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上所述，本研究可得出BAI1與結(jié)直腸癌的惡性相關(guān)，BAI1高表達(dá)可能是CRC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。但在CRC中，BAI1的作用仍是有爭(zhēng)議的，具體機(jī)制尚不明確，對(duì)其進(jìn)一步研究是必要的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al. Global cancer statistics，2012 [J]. CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108 .

[2] Yang P，Wei J，Li W，et al. High expression of growth factor receptor-bound protein 14 predicts poor prognosis for colorectal cancer patients [M]. Biotechnol Lett，2016，38（6）：1043-1047.

[3] He F，Chen H，Yang P，et al. Gankyrin sustains PI3K/GSK-3β/β-catenin signal activation and promotes colorectal cancer aggressiveness and progression [J]. Oncotarget，2016， 7（49）：81 156-81 171.

[4] Mori K，Kanemura Y，F(xiàn)ujikawa H，et al. Brain-specific angiogenesis inhibitor 1（BAI1）is expressed in human cerebral neuronal cells [J]. Neurosci Res，2002，43（1）：69-74.

[5] Cork SM，Van Meir EG. Emerging roles for the BAI1 protein family in the regulation of phagocytosis，synaptogenesis，neurovasculature，and tumor development [J].J Mol Medi，2011，89（8）：743-752.

[6] Nishimori H，Shiratsuchi T，Urano T，et al. A novel brain-specific p53-target gene，BAI1，containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis [J]. Oncogene，1997，15（18）：2145-2150.

[7] Nishizaki M，F(xiàn)ujiwara T，Tanida T，et al. Recombinant adenovirus expressing wildtypep53 is antiangiogenic：a proposed mechanism forbystander effect [J]. Clin Cancer Res，1999，5（5）：1015-1023.

[8] Hatanaka H，Oshika Y，Abe Y，et al. Vascularization is decreased in pulmonary adenocarcinomaexpressing brain-specific angiogenesis inhibitor 1 （BAI1） [J]. Int J Mol Med，2000，5（2）：181-183.

[9] Miyamoto N，Yamamoto H，Taniguchi H，et al. Differential expression of angiogenesis-related genes in human gastric cancers with and those without high-frequency microsatellite instability [J]. Cancer Lett，2007，254（1）：42-53.

[10] Kaur B，Brat DJ，Calkins CC，et al. Brain angiogenesis inhibitor 1 is differentially expressed in normal brain and glioblastoma independently of p53 expression [J]. Am J Pathol，2003，162（1）：19-27.

[11] Nam DH，Park K，Suh YL，et al. Expression of VEGF and brain specific angiogenesis inhibitor-1 in glioblastoma：prognostic significance [J]. Oncol Rep，2004，11（4）：863-869.

[12] Kang X，Xiao X，Harata M，et al. Antiangiogenic activity of BAI1 in vivo：implications for gene therapy of human glioblastomas [J]. Cancer Gene Ther，2006，13（4）：385-392.

[13] Izutsu T，Konda R，Sugimura J，et al. Brain-Specific Angiogenesis Inhibitor 1 is a Putative Factor for Inhibition of Neovascular Formation in Renal Cell Carcinoma [J]. J Urol，2011，185（6）：2353-2358.

[14] Kudo S，Konda R，Obara W，et al. Inhibition of tumor growth through suppression of angiogenesis by brain-specific angiogenesis inhibitor 1 gene transfer in murine renal cell carcinoma [J]. Oncol Rep，2007，18（4）：785-791.

[15] Meisen WH，Dubin S，Sizemore ST，et al. Changes in BAI1 and Nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in Breast Cancer and Provide Opportunities for Dual Targeted Therapies [J]. Mol Cancer Ther，2015，14（1）：307-314.

[16] Van Meir EG，Polverini PJ，Chazin VR，et al. Release of aninhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells [J]. Nat Genet，1994， 8（2）：171-176.

[17] Monk KR，Naylor SG，Glenn TD，et al. A G protein-coupled receptor is essential for Schwann cells to initiate myelination [J]. Science，2009，325（5946）：1402-11405.

[18] Sherman DL，Brophy PJ. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth [J]. Nat Rev Neurosci，2005，6（9）：683-690.

[19] Fukushima Y，Oshika Y，Tsuchida T，et al. Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 expression is inverselycorrelated with vascularity and distant metastasis of colorectal cancer [J]. Int J Oncol，1998，13（5）：967-970.

[20] Yoshida Y，Oshika Y，F(xiàn)ukushima Y，et al. Expression of angiostatic factors in colorectal cancer [J]. Int J Oncol，1999， 15（6）：1221-1225.

（收稿日期：2017-12-18 本文編輯：任 念）