加工番茄的花藥培養(yǎng)技術(shù)

李淑紅，賴黎麗，李淑琴，方珂，朱華國*

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003）

加工番茄是普通番茄中的一種栽培類型，屬于茄科番茄屬，是我國乃至全世界重要的蔬菜作物。加工番茄的主要用途是送入加工廠加工處理，產(chǎn)品主要是番茄醬，另有番茄沙司、番茄汁、番茄丁等產(chǎn)品[1]。隨著世界經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對食品的消費越來越傾向于加工制品，全世界對番茄制品的需求量以每年3%的速度增長，培育優(yōu)良的加工番茄新品種，不僅可以提高產(chǎn)量，還可以提高原料的品質(zhì)、耐貯運輸。因此，國內(nèi)外都十分重視加工番茄新品種的選育。

花藥培養(yǎng)是植物育種中應(yīng)用最廣泛，最有成效的方法之一。通過對番茄花藥培養(yǎng)可加速育種進程，提高選育效率[2]。有關(guān)番茄花藥培養(yǎng)的研究，從20世紀70年代開始，番茄花藥離體培養(yǎng)研究取得了一定進展，Sharp等[3]首次報道了番茄小孢子的胚胎發(fā)生，Gresshoff等[4]通過番茄花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織并分化出單倍體小植株，取得了番茄花藥培養(yǎng)的首次成功，之后，國內(nèi)外相繼開展了一系列的相關(guān)研究，也獲得了單倍體植株[5-6]。但番茄花藥培養(yǎng)受基因型和植物激素影響較大，存在分化率低、再生完整植株難、基因型限制等問題。

本文以2個加工番茄品種的花藥進行試驗培養(yǎng)，通過設(shè)計不同植物激素組合對加工番茄進行花藥培養(yǎng)，以期為加工番茄花藥培養(yǎng)技術(shù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的加工番茄材料有2種，分別為CK3和CK8，由新疆屯河投資股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

在番茄現(xiàn)蕾后，于盛花期上午 9：00-11：00，從健壯植株上摘取大小不同的花蕾，用電子游標卡尺測量花蕾的縱橫徑，然后將花蕾放入卡諾固定液固定后，剝出花藥放在滴有醋酸洋紅液的載玻片上，用鑷子夾碎后去掉殘渣，蓋上蓋玻片，進行染色，吸去周圍多余的染色液，用體視顯微鏡觀察小孢子所處的發(fā)育時期。

取單核期的花蕾置于4℃冰箱預(yù)處理，接種前用0.1%的升汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗3或4次，剝出花藥接種在以MSB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加 20 g/L 蔗糖，2.5 g/L Phytagel，pH 5.8 進行接種培養(yǎng)。

將2個基因型加工番茄的花藥接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基如下：（0.1、0.5 mg/L）2，4-D+（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L）KT、（0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L）6-BA、（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L）ZT、（0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L）TDZ 和（0.5、1.0 mg/L）NAA+（0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L）KT、（0.5、1.0、2.0、5.0mg/L）6-BA、（0.1、0.5、1.0、2.0mg/L）ZT、（0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L）TDZ，考察 2 種材料愈傷組織的誘導(dǎo)率；2，4-D與不同細胞分裂素組合對CK8花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響；NAA與不同細胞分裂素組合對CK8花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。將CK8的花藥 4℃低溫預(yù)處理 2、5 d，接種在 0.1 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中，考察對CK8花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。每皿接種30個左右花藥，用Parafilm膜封口，所有處理均在接種后置于28℃暗培養(yǎng)30 d，然后轉(zhuǎn)至散光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃；從培養(yǎng)開始30 d后統(tǒng)計出愈率，并將愈傷組織繼代于0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；30 d后再將愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2種分化培養(yǎng)基激素處理為0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L KT（1）和 0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L KT（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子發(fā)育時期的測定

番茄小孢子的發(fā)育時期與其花蕾大小有密切關(guān)系，隨著花蕾縱徑和橫徑的增大，小孢由花粉母細胞時期向四分體、單核期發(fā)育（圖1）。

圖1 CK8花蕾大小和小孢子的發(fā)育時期Fig.1 CK8 flower bud size and microspore developmental period

由表1可見：CK8品種小孢子處于花粉母細胞時期，花蕾的縱徑在2.39-3.08 mm，橫徑在1.37-2.02 mm；小孢子處于四分體時期，花蕾的縱徑在3.72-4.15 mm，橫徑在1.60-2.21 mm；發(fā)育到單核中期時，花蕾的縱徑在4.49-5.26 mm，橫徑在2.13-2.34 mm；單核靠邊期，縱徑在5.25-6.19 mm，橫徑在2.09-3.20 mm。品種CK3小孢子處于花粉母細胞時期，花蕾縱徑在2.44-2.96 mm，橫徑在1.48-1.63 mm；四分體時期時，花蕾縱徑在3.32-4.08 mm，橫徑在1.92-2.19 mm；發(fā)育到單核中期時，花蕾縱徑在3.99-5.29 mm，橫徑在2.04-2.33 mm；單核靠邊期時，縱徑在5.34-6.05 mm，橫徑在2.25-3.07 mm。

表1 番茄小孢子發(fā)育時期花蕾縱橫徑變化Tab.1 Relationship between tomato microspore genesis period buds and transverse diameters change

2.2 基因型對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將2個不同基因型加工番茄的花藥接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計出愈率，結(jié)果（表2）表明：2個加工番茄品種花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率均在10%以上，但是出愈率存在一定的差異，其中品種CK8的誘導(dǎo)率為18.63%，品種CK3的誘導(dǎo)率為14.19%。

表2 基因型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effect of different genotype on callus induction

2.3 2，4-D與不同細胞分裂素組合對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表 3可知：0.1 mg/L、0.5 mg/L 2，4-D 分別與不同濃度的 KT、6-BA、ZT、TDZ組合對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。隨著KT、6-BA、ZT濃度的增大，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率均呈先上升后下降的趨勢，而隨著TDZ濃度的增大，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率呈下降趨勢。

0.1 mg/L 2，4-D與不同濃度KT組合，當KT濃度為1.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最大為 31.53%；0.1 mg/L 2，4-D與不同濃度 6-BA組合，在6-BA濃度為2.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最大為56.36%；0.1 mg/L 2，4-D與不同濃度ZT組合，ZT濃度為0.5 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為 38.64%；0.1 mg/L 2，4-D與不同濃度TDZ組合，當TDZ濃度為0.05 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為56.32%，且0.1 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率可達到48.94%。在0.1 mg/L 2，4-D與不同激素組合處理條件下，0.1 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率均達到56%以上，明顯高于其他組合。0.5 mg/L 2，4-D與不同濃度KT組合，KT濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為42.02%；0.5 mg/L 2，4-D與不同濃度6-BA組合，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為35.35%；0.5 mg/L 2，4-D與不同濃度 ZT組合，在ZT濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為13.54%；0.5 mg/L 2，4-D與不同濃度 TDZ組合，在TDZ濃度為0.05 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為56.52%，并且TDZ濃度為0.1 mg/L時，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達52.27%。在0.5 mg/L 2，4-D與不同激素組合處理條件下，0.5mg/L2，4-D+0.05mg/L TDZ的誘導(dǎo)率最高為56.52%，其次是0.5 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率為52.27%，明顯高于其他組合。

綜上所述，0.5 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L TDZ 是最適宜番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合，0.1 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA 與 0.1 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L TDZ也是適宜番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合。

表3 2，4-D與不同細胞分裂素組合對番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of 2，4-D and different cytokinin combinations on the induction of tomato anther callus

表3 續(xù)

2.4 NAA與不同細胞分裂素對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知：0.5、1.0 mg/L的NAA分別與不同濃度的 KT、6-BA、ZT、TDZ組合對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。隨著KT、6-BA、ZT濃度的增大，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率均呈先上升后下降的趨勢，而隨著TDZ濃度的增大，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率呈下降趨勢。

0.5 mg/L NAA與不同濃度KT組合，KT濃度為0.5 mg/L時，番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高為34.00%；0.5 mg/L NAA與不同濃度6-BA組合，當6-BA濃度1.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為33.33%；0.5 mg/L NAA與不同濃度ZT組合，在ZT濃度為1.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最大為20.65%；0.5 mg/L NAA與不同濃度TDZ組合，TDZ濃度為0.05 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為14.04%。在0.5 mg/L NAA與不同激素組合處理條件下，0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為34.00%，其次是0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA對番茄花藥的誘導(dǎo)率為33.33%，誘導(dǎo)率明顯高于其他組合。

表4 NAA與不同細胞分裂素組合對番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effect of NAA and different cytokinin combinations on the induction of tomato anther callus

1.0 mg/L NAA與不同濃度KT組合，當KT濃度為0.5 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為23.08%；1.0 mg/L NAA與不同濃度6-BA組合，6-BA濃度為1.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為23.47%；1.0 mg/L NAA與不同濃度ZT組合，ZT濃度為1.0 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最大為14.29%；1.0 mg/L NAA與不同濃度TDZ組合，當TDZ濃度為0.05 mg/L時，番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為16.13%。在1.0 mg/L NAA與不同激素組合處理條件下，1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為23.47%，其次是1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率為23.08%，對愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯高于其他組合。

綜上所述，0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT是最適宜誘導(dǎo)番茄花藥愈傷組織的激素組合，0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA也是適宜番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合。

2.5 低溫預(yù)處理對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

低溫預(yù)處理對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果見表5。

表5 低溫預(yù)處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.5 Effect of cold pretreatment on the callus induction

由表5可知：加工番茄的花藥經(jīng)4℃低溫預(yù)處理2 d、5 d后的愈傷組織誘導(dǎo)率沒有明顯的差異，說明4℃低溫預(yù)處理花蕾的適宜時間為2-5 d。

2.6 番茄花藥愈傷組織分化誘導(dǎo)

將花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計愈傷組織（圖2A），并將愈傷組織繼代至MSB+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，愈傷組織的生長出現(xiàn)了3種類型。一是愈傷組織呈黃綠色，質(zhì)地松軟（圖2B）；二是愈傷組織呈白色，質(zhì)地致密堅硬（圖2C）；三是愈傷組織呈白色，質(zhì)地松軟（圖2D）。再將愈傷組織繼代至分化培養(yǎng)基，其中品種CK3的花藥經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0.5 mg/L NAA+0.05 mg/L TDZ和繼代培養(yǎng)基MSB+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT培養(yǎng)后，在分化培養(yǎng)基1中有胚性愈傷組織形成（圖2E），而接種在分化培養(yǎng)基2中的愈傷組織均無胚性愈傷組織形成（圖2F）。MSB+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/LKT是適宜誘導(dǎo)番茄花藥愈傷組織分化的培養(yǎng)基。

圖2 番茄花藥愈傷組織的生長狀態(tài)Fig.2 Tomato anther callus growth status

3 討論

3.1 小孢子發(fā)育時期的測定

選擇最適宜發(fā)育時期的小孢子對花藥培養(yǎng)至關(guān)重要，番茄小孢子發(fā)育時期處于單核靠邊期或單核中晚期時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高[7-8]。

（1）本文試驗觀察到小孢子發(fā)育經(jīng)歷小孢子母細胞時期、四分體時期、單核中期、單核靠邊期。小孢子各個發(fā)育時期明顯，并且小孢子各個發(fā)育時期與花蕾的大小密切相關(guān)，可根據(jù)花蕾的大小來判斷番茄小孢子的發(fā)育時期。

（2）本文試驗通過對2個加工番茄品種CK8、CK3進行比較觀察，得出番茄花蕾縱徑為5.25-6.19 mm，橫徑為2.09-3.20 mm，絕大多數(shù)的小孢子發(fā)育時期處于單核靠邊期。

（3）依據(jù)上述試驗的結(jié)果進行花藥培養(yǎng)，可以根據(jù)花蕾的大小來判斷小孢子的發(fā)育時期。

3.2 基因型對番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

基因型是影響花藥培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一，不同基因型的植株花藥愈傷組織誘導(dǎo)率不同[9-10]。本試驗研究表明，2個基因型的加工番茄均通過花藥離體培養(yǎng)獲得了愈傷組織，并且2個基因型材料的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率不同，說明基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)率影響有差異，對花藥愈傷組織的發(fā)生有決定作用，這與前人的研究結(jié)果[11-13]一致。

3.3 不同激素組合及濃度對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

（1）有關(guān)研究表明培養(yǎng)基中的激素配比及其濃度是影響番茄花藥培養(yǎng)的重要因素[14-16]。

本文試驗結(jié)果表明，不同激素組合對加工番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著的差異。2，4-D和NAA分別與不同濃度的KT、6-BA、ZT、TDZ組合，其中以2，4-D與0.05 mg/L TDZ組合對番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，說明2，4-D和TDZ激素組合對番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)有顯著的調(diào)控作用，在選擇適宜的激素配組時，可優(yōu)先考慮2，4-D與TDZ配組，這與前人的研究結(jié)果[17-18]不一致。

（2）花藥愈傷組織分化率低是阻礙番茄花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的重要因素之一，在誘導(dǎo)番茄花藥愈傷組織分化的過程中，植物激素起著重要作用。

本文試驗設(shè)計的2種分化培養(yǎng)基，只有在MSB+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L KT的培養(yǎng)基上形成胚性愈傷組織，這為番茄花藥愈傷組織的分化提供一定的依據(jù)。

3.4 低溫預(yù)處理對加工番茄花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

對番茄的花藥培養(yǎng)來說，低溫冷處理可以提高番茄花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，其原因是低溫預(yù)處理可在一定程度上延緩番茄花藥小孢子退化，提高雄核發(fā)育，并增加參與雄核發(fā)育小孢子的比率[19]。張永華[20]在番茄花藥培養(yǎng)中，將花藥在4℃低溫下預(yù)處理1、2、4、7 d，最高愈傷組織的誘導(dǎo)率比對照增加66.01%，是對照的 5.65倍，相對出愈率較低的處理也比對照的出愈率高。

本文試驗中對花藥采用4℃低溫預(yù)處理2、5 d，結(jié)果表明各處理愈傷組織的形成沒有明顯的差異，說明4℃低溫處理花蕾的最適時期為2-5 d，這與前人的研究結(jié)果[21-22]一致。

4 結(jié)論

（1）2種加工番茄 CK8和 CK3的花蕾縱徑為5.25-6.19 mm，橫徑為 2.09-3.20 mm，絕大多數(shù)的小孢子發(fā)育時期處于單核靠邊期。

（2）0.5 mg/L 2，4-D 與 0.05 mg/L TDZ配組使用的誘導(dǎo)率最高，為56.52%。

（3）品種CK3的花藥經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0.5 mg/L NAA+0.05 mg/L TDZ和繼代MSB+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT培養(yǎng)后，在分化培養(yǎng)基MSB+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L KT上，誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織。

（4）4℃低溫預(yù)處理花蕾的適宜時間是2-5 d。