不同寄主大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的比較及致病力分化的分析

陳志榮，趙小強(qiáng)，孫琦，王元杰，黃家風(fēng)

（新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是世界性的土傳植物病原真菌，寄主范圍廣泛，可侵染660多種雙子葉植物，引起棉花、茄子、向日葵、馬鈴薯、苜蓿、番茄、萵苣和大豆等多種經(jīng)濟(jì)作物的黃萎病，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大危害[1-2]。

王克榮等[3]研究表明大麗輪枝菌在人工培養(yǎng)條件下菌落培養(yǎng)性狀具有明顯差異，并將大麗輪枝菌在PDA平板上形成的菌落培養(yǎng)性狀分為A型（野生型）、B型（絨毛型）、C型（菌膜型）和D型（矮化型）4種類型；朱荷琴等[4]將全國(guó)主要棉區(qū)的棉花黃萎病菌在 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀分為5個(gè)類型，并發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江流域棉區(qū)菌株培養(yǎng)性狀變異最大，其次是黃河流域，新疆棉區(qū)的變異最小。更多的研究將大麗輪枝菌在PDA平板上形成的菌落分為菌核型、菌絲型和中間型3種類型[5]。培養(yǎng)性狀的差異反映了不同菌株之間生長(zhǎng)發(fā)育或營(yíng)養(yǎng)需求的不同。大麗輪枝菌在寄生階段，其生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源主要由寄主提供，不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在與其寄主長(zhǎng)期適應(yīng)、協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中形成了特定的營(yíng)養(yǎng)需求，但是有關(guān)不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌有何營(yíng)養(yǎng)差異卻缺乏相關(guān)研究。

大麗輪枝菌變異性強(qiáng)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，由于病菌異核現(xiàn)象的產(chǎn)生和生態(tài)環(huán)境差異的影響，常發(fā)生生理分化，產(chǎn)生新的生理型或致病型[6]。但是有關(guān)大麗輪枝菌致病類型的劃分一直以來(lái)卻沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。研究最多的是引起棉花黃萎病的棉花大麗輪枝菌（即棉花黃萎病菌），其致病類型劃分早在1977-1978年，我國(guó)棉花黃萎病菌生理型聯(lián)合試驗(yàn)組對(duì)8省（區(qū)）的 10個(gè)黃萎病菌系用9個(gè)鑒別寄主接種鑒定后，將黃萎病菌分為 3個(gè)生理型，分別為致病力強(qiáng)的生理型Ⅰ、致病力弱的生理型Ⅱ、致病力中等的生理型Ⅲ[7]；美國(guó)學(xué)者根據(jù)棉花黃萎病菌的不同菌系對(duì)棉花致病的嚴(yán)重程度和癥狀類型，將棉花黃萎病菌劃分為落葉型和非落葉型2種致病型，并且普遍認(rèn)為落葉型致病力比非落葉型致病力強(qiáng)[8]。而對(duì)于番茄大麗輪枝菌，根據(jù)是否介導(dǎo)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗性分為1號(hào)生理小種和2號(hào)生理小種[9]；并且通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Ave1基因只存在于1號(hào)生理小種，由其編碼的Ave1效應(yīng)子蛋白才能激發(fā)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗性，2號(hào)生理小種因不含Ave1基因，不能激發(fā)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致發(fā)病[10]。對(duì)于其它寄主來(lái)源的大麗輪枝菌，其致病型是否也可以按照棉花大麗輪枝菌和番茄大麗輪枝菌的歸類依據(jù)進(jìn)行劃分，以及不同的劃分標(biāo)準(zhǔn)之間是否存在相關(guān)性目前并不明確。

為此，本研究針對(duì)不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌，通過(guò)培養(yǎng)性狀的觀察和對(duì)不同碳源和氮源的利用情況分析了營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)大麗輪枝菌生物學(xué)性狀的影響，通過(guò)生理小種、落葉型或非落葉型的分子鑒定及對(duì)棉花的致病力，對(duì)不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌的致病型進(jìn)行鑒定，從而為大麗輪枝菌致病型的科學(xué)劃分提供依據(jù)和有效防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試大麗輪枝菌菌株，V592和S4分別分離自新疆棉花，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；S1分離自內(nèi)蒙古向日葵，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)景嵐教授饋贈(zèng)；S2分離自新疆馬鈴薯，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)李克梅副教授饋贈(zèng)；S3分離自新疆茄子、V30和V31分離自寧波茄子、Vnu分離自寧波紅花、Vtr分離自寧波番茄，均由寧波動(dòng)植物出入境檢驗(yàn)檢疫局段維軍饋贈(zèng)。所有菌株均經(jīng)過(guò)單孢分離得到其純化的單孢菌系。

1.1.2 植物材料

本實(shí)驗(yàn)室所用的植物材料為高感黃萎病菌棉花品種軍棉1號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 ITS序列擴(kuò)增及測(cè)序

將-80℃保存的甘油菌在冰上解凍，吸取50-100 μL菌液均勻涂抹在PDA（馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)7 d左右。利用真菌DNA提取試劑盒分別提取8個(gè)菌株的DNA，用引物ITS1 （5'-TCCUTAUUTUAACCT-CUCUU-3'） 和 ITS4（5'-TCCTCCUCTTATTUATAT-GC-3'）[11]對(duì)菌株的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀的觀察

用接種針蘸取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5 d的菌株分生孢子，接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，22℃暗培養(yǎng)20 d，根據(jù)各菌株在 PDA培養(yǎng)基上的微菌核產(chǎn)量以及菌落特性觀察菌落性狀：菌核型菌株培養(yǎng) 2周后產(chǎn)生大量黑色微菌核，菌落呈黑色；菌絲型菌落表面呈白色或淺黃色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，培養(yǎng) 2周后仍未出現(xiàn)黑色微菌核；中間型菌株培養(yǎng) 2周時(shí)，僅菌落中部有大量的微菌核產(chǎn)生，微菌核產(chǎn)量明顯少于菌核型。在菌落生長(zhǎng)的第10 d和第20 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落生長(zhǎng)速度。

菌落生長(zhǎng)速度=（第20 d菌落直徑-第10 d菌落直徑）÷10。

每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，每次菌落直徑的測(cè)量為3次重復(fù)的平均值。

1.2.3 產(chǎn)孢量及分生孢子萌發(fā)率的測(cè)定

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株用10 mm的打孔器取10塊菌餅，放入察氏液體培養(yǎng)基中搖培 3 d[12]，用高溫滅菌過(guò)的4層紗布過(guò)濾收集分生孢子，再用高溫滅菌過(guò)的蒸餾水調(diào)整孢子濃度至106cfu/mL。取100 μL的孢子懸浮液加入100 mL的察氏培養(yǎng)基中，22℃、200 r/min搖培，分別在2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d取樣進(jìn)行孢子濃度的測(cè)定；每個(gè)菌株重復(fù)3次，測(cè)量結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。吸取1 mL上述的孢子懸浮液裝入2 mL的離心管中，分別在 0 h、6 h、24 h、48 h、72 h 及 1 周觀察孢子萌發(fā)情況；每個(gè)菌株重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。

1.2.4 碳源和氮源對(duì)大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

1.2.4.1 碳源對(duì)大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

根據(jù)察氏固體培養(yǎng)基中碳源蔗糖的分子質(zhì)量，算出30 g蔗糖含碳量為12.62 g，然后分別用含碳量為12.62 g的葡萄糖、麥芽糖和甘油3種碳源替代蔗糖，無(wú)碳源處理作為對(duì)照。

在無(wú)菌條件下將分生孢子接種到上述的培養(yǎng)基平板上，置于22℃的恒溫條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔5 d觀察菌落形態(tài)并測(cè)量菌落直徑，每次菌落直徑的測(cè)量為3次重復(fù)的平均值，利用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4.2 氮源對(duì)大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

根據(jù)察氏固體培養(yǎng)基中硝酸鈉的分子質(zhì)量，算出2.0 g硝酸鈉的含氮量為0.33 g，然后分別用含氮量為0.33 g的氯化銨、硫酸銨和蛋白胨替代硝酸鈉，無(wú)氮處理作為對(duì)照。

在無(wú)菌條件下將分生孢子接種到不同氮源的培養(yǎng)基平板上，置于22℃的恒溫條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每隔5 d觀察菌落形態(tài)并測(cè)量菌落直徑，每次菌落直徑的測(cè)量為3次重復(fù)的平均值，利用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 致病類型的分子檢測(cè)

利用BiospinFungusGenomicDNAExtraction Kit（BioFlux）試劑盒分別提取9個(gè)菌株的基因組。分別以大麗輪枝菌落葉型（D-1/D-2）和非落葉型（ND-1/ND-2）特異引物[13]及1號(hào)生理小種（VdAve1F/VdAve1R[10]和 Trl/Tr2[14]）和 2 號(hào)生理小種（VdR2F/VdR2R）[15]（引物見(jiàn)表1）對(duì)9個(gè)大麗輪枝菌菌株進(jìn)行致病類型的分子檢測(cè)。

PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，Taq 聚合酶 0.5 μL，Taq酶緩沖液 2.5 μL，dNTP 2.0 μL、引物 1.0 μL、模板1.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 致病類型分子檢測(cè)所用的PCR引物Tab.1 Primers used for molecular detection of pathotype

1.2.6 對(duì)棉花致病力的測(cè)定

將PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌株用10 mm的打孔器取10塊菌餅，放入察氏液體培養(yǎng)基中22℃，200 r/min搖培 3 d，4層紗布過(guò)濾收集各菌株的分生孢子，用清水調(diào)整孢子濃度至107cfu/mL，浸根接種法接種兩葉一心期棉花幼苗[16]。

開(kāi)始發(fā)病后，采用 5級(jí)分級(jí)法進(jìn)行病情調(diào)查，病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別為0級(jí)：健株；1級(jí)：子葉出現(xiàn)病狀；2級(jí)：1-2片真葉嚴(yán)重發(fā)病；3級(jí)：3片以上真葉表現(xiàn)病狀；4級(jí)：植株生長(zhǎng)點(diǎn)死亡或全株枯死[17]；每隔3 d記錄病情指數(shù)，

病情指數(shù)＝[（1×1級(jí)發(fā)病株數(shù)）＋（2×2級(jí)發(fā)病株數(shù)）＋（3×3級(jí)發(fā)病株數(shù)）＋（4×4級(jí)發(fā)病株數(shù)）]×100÷[總株數(shù)×4（即最高病級(jí)）]。

每個(gè)菌株重復(fù)3次，測(cè)量結(jié)果取3次的平均值，利用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果及序列分析

測(cè)序結(jié)果表明：8個(gè)菌株的rDNA-ITS區(qū)序列大小均為482 bp，相互之間的序列相似性為96.00%-99.45%。再將它們?cè)贜CBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：8個(gè)菌株的序列均與大麗輪枝菌具有高的序列相似性，其中與登錄號(hào)為EU835817.1的大麗輪枝菌的同源性達(dá)95.87%-98.69%。分子鑒定的結(jié)果表明：供試的8株菌株均為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）菌株。

2.2 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌在PDA上的培養(yǎng)性狀

按照培養(yǎng)14d時(shí)微菌核的相對(duì)數(shù)量及菌落特性可將8個(gè)菌株在PDA平板上的培養(yǎng)性狀分為2種類型（圖 1 A）：V592、V31、S1、S2和 S3菌株為菌核型，V30、Vnu和Vtr菌株為中間型。5個(gè)菌核型菌株中，V592和V31菌株菌落形態(tài)相似，黑色菌落邊緣具明顯的白色圓環(huán)，中央分布極少的氣生菌絲；其它3個(gè)菌株雖然都產(chǎn)生大量微菌核，但菌絲分布卻不相同，S1菌株產(chǎn)生少量輻射狀菌絲，在菌落中間形成明顯的灰白色凸起；S2菌株產(chǎn)生少量絮狀菌絲，均勻分布；S3菌株也產(chǎn)生少量絮狀菌絲，但集中于菌落中間。3個(gè)中間型菌株中，V30菌株產(chǎn)生放射狀分布的微菌核，菌落中間有少量灰白色菌絲。Vnu和Vtr菌株只能從平板背面才能觀察到黑色微菌核，Vnu菌株的菌絲發(fā)達(dá)，白色絨毛狀，蓬松凸起；Vtr菌株的菌絲也很發(fā)達(dá)，白色匍匐狀，無(wú)明顯凸起。另外，8個(gè)菌株的菌落生長(zhǎng)速度也存在明顯差異（圖1 A，圖1 B），S3菌株的平均生長(zhǎng)速度最慢，其次是Vnu菌株，Vtr菌株的平均生長(zhǎng)速度最快，因此培養(yǎng)20 d時(shí)S3菌株形成的菌落最小，Vtr菌株形成的菌落最大。由此表明，不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀具有明顯差異，并且來(lái)自同一種寄主（茄子）的不同菌株（V31、S3和V30）培養(yǎng)性狀也具有明顯差異。

圖1 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Fig.1 Cultural characteristics of V.dahliae strains from different plants on PDA media

2.3 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的測(cè)定結(jié)果

由圖2可知：所有供試菌株的產(chǎn)孢量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，從第4 d起各菌株產(chǎn)孢量開(kāi)始表現(xiàn)差異，其中Vnu菌株的產(chǎn)孢量顯著高于其它菌株的產(chǎn)孢量。第7 d時(shí)，Vnu菌株的產(chǎn)孢量最大，孢子濃度高達(dá)105.45×106cfu/mL，其次是V592菌株，孢子濃度為78.95×106cfu/mL，Vtr菌株的產(chǎn)孢量最低，孢子濃度是61.23×106cfu/mL。

分生孢子萌發(fā)率的測(cè)定結(jié)果顯示：不同菌株的孢子萌發(fā)率達(dá)到最大值的時(shí)間存在差異（圖3 A），S3、V31和Vnu菌株在第3 d時(shí)孢子萌發(fā)率最大，而V592、S1、V30和Vtr菌株則在第5 d時(shí)孢子萌發(fā)率最大；S2菌株由于孢子萌發(fā)率低，第7 d時(shí)孢子萌發(fā)率仍處于持續(xù)增長(zhǎng)階段，表現(xiàn)為第7 d時(shí)萌發(fā)率最大。比較各菌株分生孢子的平均萌發(fā)率（圖3 B）可知：各菌株之間也存在差異，Vnu菌株的孢子萌發(fā)率最高，其次是V31、S3和V592，S2菌株的孢子萌發(fā)率最低。不同菌株在產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率方面存在差異，表明不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌具有不同的繁殖力。

圖2 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌菌株的產(chǎn)孢量Fig.2 Sporulation quantity of V.dahliae strains from different palnts

圖3 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌菌株的分生孢子的萌發(fā)率Fig.3 Germination rate of conidia of V.dahliae strains from different plants

2.4 碳源和氮源對(duì)大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

2.4.1 碳源對(duì)不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用葡萄糖、麥芽糖和甘油取代察氏培養(yǎng)基中的蔗糖充當(dāng)碳源，比較不同菌株對(duì)無(wú)機(jī)碳及有機(jī)碳的利用情況。從菌落的生長(zhǎng)情況看，8個(gè)菌株在4種碳源培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，表明對(duì)4種碳源都能利用。比較菌落形態(tài)，S2、S3和V30在蔗糖、葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生的微菌核量明顯多于在甘油培養(yǎng)基上的量（圖4）；S1在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同于在蔗糖和甘油培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（圖4），說(shuō)明不同的碳源種類對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)發(fā)育具有不同的影響作用。比較菌落直徑，在4種碳源培養(yǎng)基上，Vtr菌株形成的菌落直徑最大，其次是Vnu和V592菌株，S1形成的菌落直徑最?。▓D4，圖5），說(shuō)明Vtr對(duì)4種碳源的利用明顯優(yōu)于其它菌株，S1對(duì)4種碳源的利用能力最差。

圖4 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在4種碳源培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Fig.4 Cultural characteristics of V.dahliae strains from different plants on four kinds of carbon media

圖5 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在4種碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑Fig.5 Colony diameters of V.dahliae strains from different plants on four kinds of Carbon media

上述結(jié)果表明：不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌對(duì)不同碳源的利用存在明顯差異。

2.4.2 氮源對(duì)不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀的影響

以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用蛋白胨、氯化銨和硫酸銨代替察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉充當(dāng)?shù)?，比較不同菌株對(duì)無(wú)機(jī)氮及有機(jī)氮的利用情況。從菌落的生長(zhǎng)情況看，8個(gè)菌株在4種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，表明對(duì)4種氮源都能利用（圖6）。Vtr菌株在4種氮源培養(yǎng)基上形成的菌落直徑均明顯大于其它菌株的菌落直徑（圖 6，圖 7），表明Vtr對(duì) 4種氮源的利用明顯優(yōu)于其它菌株。S2菌株以硝酸鈉和蛋白胨為氮源時(shí)產(chǎn)生大量均勻分布的黑色微菌核，而以氯化銨和硫化銨為氮源時(shí)只在菌落中心產(chǎn)生極少的微菌核（圖6）；Vnu菌株以硝酸鈉和蛋白胨為氮源時(shí)產(chǎn)生的菌落直徑明顯大于以氯化銨和硫化銨為氮源時(shí)的直徑（圖6），表明S2和Vnu菌株對(duì)不同氮源的利用存在明顯差異。另外，在同一種氮源培養(yǎng)基上菌株之間也存在明顯差異，如在蛋白胨培養(yǎng)基上，V592、S2、V30和V31都能產(chǎn)生微菌核，但產(chǎn)生的菌核量及菌落形態(tài)明顯不同；S1、S3、Vnu和 Vtr菌株不能產(chǎn)生微菌核，但菌落表面的氣生菌絲卻呈現(xiàn)完全不同的分布（圖 6）。

綜合上述結(jié)果表明：不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌對(duì)不同氮源的利用存在顯著差異。

圖6 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在4種氮源培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Fig.6 Cultural characteristics of V.dahliae strains from different plants on four kinds of nitrogen media

圖7 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在4種氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑Fig.7 Colony diameters of V.dahliae strains from different plants on four kinds of nitrogen media

2.5 致病類型的分子生物學(xué)檢測(cè)

2.5.1 落葉型和非落葉型致病類型的PCR鑒定

以棉花黃萎病菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株S4做對(duì)照，分別利用落葉型和非落葉型特異引物對(duì)不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌進(jìn)行了致病類型的PCR鑒定，結(jié)果（圖8）顯示：利用落葉型特異引物可從向日葵上的S1菌株、馬鈴薯上的S2菌株、茄子上的S3菌株上擴(kuò)增到約500 bp的目標(biāo)條帶（圖8 A），表明S1、S2、S3與V592一樣是落葉型菌株；用非落葉型特異引物可從茄子上的V30和V31菌株上擴(kuò)增到了約1500 bp的目標(biāo)條帶（圖8 B），表明V30、V31與S4一樣是非落葉型菌株。Vnu和Vtr菌株用2對(duì)引物都不能擴(kuò)增到相應(yīng)的目標(biāo)條帶。因此可以得出：除棉花黃萎病菌外，向日葵、馬鈴薯和茄子上的大麗輪枝菌也可以用落葉型和非落葉型進(jìn)行致病類型的劃分。

圖8 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌致病類型的PCR鑒定Fig.8 Identification of pathotype of V.dahliae strains from different plants by PCR

2.5.2 生理小種的PCR鑒定

生理小種的鑒定結(jié)果如圖9所示。

圖9 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌生理小種的PCR鑒定Fig.9 Identification of physiological race of V.dahliae strains from different plants by PCR

由圖9可知：

實(shí)驗(yàn)所用的厚萼凌霄種子取自江蘇省連云港境內(nèi)。選取的種子均發(fā)育良好、籽粒飽滿。實(shí)驗(yàn)所用的海水取自連云港周邊海域，海水鹽度為27.3%。

用2對(duì)1號(hào)小種的特異引物只能從紅花上的Vnu菌株中分別擴(kuò)增到680 bp和 900 bp的目標(biāo)條帶（圖9 A和9 B）；用2號(hào)小種的特異引物可以從 V592、S4、S1、S2、S3、V30 和 V31 菌株中擴(kuò)增到約250 bp的目標(biāo)條帶（圖9 C）；而 Vtr菌株分別用3對(duì)引物均擴(kuò)增不到相應(yīng)的目標(biāo)條帶。

PCR鑒定結(jié)果表明Vnu菌株為1號(hào)生理小種，V592、S4、S1、S2、S3、V30 和 V31 為 2 號(hào)生理小種，Vtr菌株不能用該方法鑒定致病型。

2.6 不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌對(duì)棉花的致病力測(cè)定

以棉花黃萎病菌落葉型菌株V592為對(duì)照，將不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌分別接種棉花并測(cè)定其致病力，結(jié)果（圖 10，11）顯示：

（1）與對(duì)照V592一樣，S2和S3菌株接種后15 d開(kāi)始表現(xiàn)萎蔫癥狀，但是發(fā)病后的病情指數(shù)顯著高于 V592（圖 10）。接種 25 d時(shí)（圖 10），V592菌株表現(xiàn)萎蔫的葉片增多，病情指數(shù)為34.4；S3菌株導(dǎo)致病株萎蔫、葉片脫落，病情指數(shù)達(dá)86.5；S2菌株導(dǎo)致葉片脫落、整株死亡，病情指數(shù)達(dá)100。這說(shuō)明S2和S3菌株對(duì)棉花的致病力比棉花黃萎病菌V592強(qiáng)。

（2）與對(duì)照V592相比，其它5個(gè)菌株接種棉花后發(fā)病明顯延遲，V30菌株在接種23 d后病株才表現(xiàn)萎蔫癥狀，V31、Vtr、Vnu和 S1菌株直到接種 25d時(shí)植株才開(kāi)始表現(xiàn)萎蔫癥狀（圖11）；接種35 d時(shí)調(diào)查病情指數(shù)，V592的病指已達(dá)93.2，而其它5個(gè)菌株導(dǎo)致發(fā)病的病指范圍是21.0-37.3（圖11）。這說(shuō)明其它 5 個(gè)大麗輪枝菌 （V30、V31、Vtr、Vnu 和S1）對(duì)棉花的致病力明顯比棉花黃萎病菌V592弱。

（3）上述致病力測(cè)定結(jié)果表明：不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌對(duì)棉花的致病力具有顯著差異。

圖10 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌對(duì)棉花致病力的測(cè)定Fig.10 Pathogenicity of V.dahliae strains from different plants on cotton seedlings

圖11 不同寄主來(lái)源大麗輪枝菌對(duì)棉花的致病力的測(cè)定Fig.11 Pathogenicity of V.dahliae strains from different plants on cotton seedlings

3 結(jié)論與討論

（1）本文研究結(jié)果表明，8個(gè)不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌在PDA上的培養(yǎng)性狀存在明顯差異，這種差異不僅表現(xiàn)在不同寄主的菌株之間，也表現(xiàn)在同一種寄主的菌株之間，來(lái)自茄子的S3和V31產(chǎn)生菌核型菌落，而V30產(chǎn)生中間型菌落；喻秀秀等[18]將茄子上的10株大麗輪枝菌在PDA上的培養(yǎng)性狀分為菌核型、菌絲型和中間型3種，研究結(jié)果表明同一種寄主來(lái)源的大麗輪枝菌培養(yǎng)性狀存在變異，與本研究結(jié)果一致，朱荷琴[4]也得出同一寄主來(lái)源的棉花大麗輪枝菌在 PDA上的培養(yǎng)性狀存在5個(gè)類型。因此，不同寄主或同一種寄主來(lái)源的大麗輪枝菌，其培養(yǎng)性狀存在多樣性可能與大麗輪枝菌與各自的寄主種類或品種長(zhǎng)期適應(yīng)所形成的營(yíng)養(yǎng)要求有關(guān)。

（2）產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果顯示來(lái)自紅花的Vnu菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率都明顯高于其它菌株，具有最強(qiáng)的繁殖力，其它菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率之間雖然沒(méi)有相關(guān)性，但菌株之間在產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率方面具有顯著差異，表明菌株之間具有不同的繁殖力。

（3）本文研究結(jié)果表明，不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌具有不同的營(yíng)養(yǎng)需求，這種營(yíng)養(yǎng)需求的差異是否與寄主選擇有關(guān)還有待深入研究。黃薇等[19]研究表明不同鉀鈉比的察氏培養(yǎng)基明顯影響大麗輪枝菌的菌核產(chǎn)量和致病力，而本研究用氯化銨和硫酸銨代替察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉充當(dāng)?shù)磿r(shí)，所有菌株在氯化銨和硫化銨培養(yǎng)基上都不形成黑色微菌核，該現(xiàn)象產(chǎn)生是否與培養(yǎng)基中缺乏鈉離子有關(guān)還需要進(jìn)一步明確。

（4）除紅花上的Vnu和番茄上的Vtr菌株外，來(lái)自棉花、向日葵、馬鈴薯和茄子上的7個(gè)菌株都可以用落葉型和非落葉型進(jìn)行致病類型的劃分。茄子上的S3為落葉型菌株，V30和V31為非落葉型菌株，這與江蘇茄子上的鑒定結(jié)果不一致，喻秀秀等的檢測(cè)結(jié)果顯示江蘇茄子上的所有大麗輪枝菌均為非落葉型菌株[18]，沒(méi)有落葉型菌株，因此對(duì)茄子大麗輪枝菌致病型的鑒定還需要在全國(guó)范圍內(nèi)采集更多的茄子黃萎病菌進(jìn)行確定。

（5）紅花上的Vnu菌株為1號(hào)生理小種，表明該菌株基因組含有無(wú)毒基因Ave1，因此對(duì)于該類病原最有效的防治方法就是利用和培育含Ve1抗病基因的品種[9]；棉花、向日葵、馬鈴薯和茄子上的7個(gè)菌株均為2號(hào)生理小種，表明這些菌株的基因組中都沒(méi)有無(wú)毒基因Ave1，這與劉琳琳和喻秀秀等對(duì)于棉花大麗輪枝菌和茄子大麗輪枝菌的研究結(jié)果一致[18，20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，只有鑒定為2號(hào)生理小種的菌株才可以進(jìn)一步劃分為落葉型和非落葉型，該結(jié)論是否具有普遍性還需要更多菌株的驗(yàn)證。對(duì)于番茄大麗輪枝菌，根據(jù)是否介導(dǎo)含Ve1基因的番茄產(chǎn)生抗性分為1號(hào)生理小種和2號(hào)生理小種，只有1號(hào)小種含有Ave1基因[9]，而本研究發(fā)現(xiàn)番茄上的Vtr菌株用2種分子檢測(cè)方法都不能進(jìn)行鑒定，既不屬于落葉型和非落葉型，也不能確定生理小種，其致病類型如何劃分還需進(jìn)一步研究。

（6）本文研究結(jié)果顯示，馬鈴薯上的S2菌株和茄子上的S3菌株對(duì)棉花的致病力明顯比棉花黃萎病菌V592強(qiáng)，而其它菌株對(duì)棉花的致病力明顯比V592弱，且延遲發(fā)??；喻秀秀等[18]也發(fā)現(xiàn)茄子上分離的大麗輪枝菌對(duì)棉花的致病力強(qiáng)于棉花黃萎病菌。

大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，在進(jìn)行作物布局和輪作時(shí)應(yīng)考慮此類致病力加重的問(wèn)題。

（7）有研究表明，棉花黃萎病菌的培養(yǎng)類型、致病類型與其致病力沒(méi)有相關(guān)性[18]。本研究結(jié)果也表明，不同寄主來(lái)源的大麗輪枝菌的培養(yǎng)類型、致病類型與其致病力沒(méi)有相關(guān)性。