ATF4過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

肖婷焱 段無(wú)暇 許紫薇 周壽紅 曾斌

[摘要] 目的 觀察轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）過(guò)表達(dá)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。 方法 構(gòu)建ATF4表達(dá)質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組和ATF4質(zhì)粒組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量，Western blot檢測(cè)Warburg效應(yīng)蛋白M2型丙酮酸激酶（PKM2）的表達(dá)。 結(jié)果 與空質(zhì)粒組比較，ATF4質(zhì)粒組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量顯著降低，HepG2細(xì)胞中PKM2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（均P < 0.05）。 結(jié)論 過(guò)表達(dá)ATF4促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與抑制Warburg效應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞性肝癌；細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)錄激活因子4；Warburg效應(yīng)；M2型丙酮酸激酶

[中圖分類號(hào)] R34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）07（a）-0012-05

Effect and mechanism of overexpression of ATF4 on the apoptosis of HepG2 cells

XIAO Tingyan1 DUAN Wuxia1 XU Ziwei1 ZHOU Shouhong2 ZENG Bin1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China； 2.Teaching and Research Office of Physiology， Medical College， University of South China， Hu'nan Province， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To observe the effect of overexpression of activating transcription factor 4 （ATF4） on the apoptosis of HepG2 cells and explore the mechanism. Methods ATF4 expression plasmid was built. Hepatocellular carcinoma line HepG2 cells were transfected with ATF4 expression plasmid through liposome. The plasmids were divided into blank control group， empty plasmid group and ATF4 plasmid group. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. The content of lactate in cell culture medium was tested. The expression of Warburg effect protein pyruvate kinase subtype M2 （PKM2） was measured by Western blot. Results Compared with the empty plasmid group， the apoptosis rate of HepG2 cells increased significantly， the content of lactate in cell culture medium decreased significantly and the expression of PKM2 decreased significantly （all P < 0.05）. Conclusion Overexpression of ATF4 promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma line HepG2 cells， the mechanism may be related to inhibition of Warburg effect.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Activating transcription factor 4； Warburg effect； Pyruvate kinase subtype M2

肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱“肝癌”）是原發(fā)性肝癌的主要類型，其發(fā)病率近年來(lái)持續(xù)攀升，已經(jīng)成為全球第二大致命性癌癥[1-2]。轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）是ATF/CREB家族的成員之一，能夠調(diào)控適應(yīng)性關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，參與氨基酸的合成與運(yùn)輸、糖脂代謝及整合應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[3-4]。ATF4通路在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤自噬中起著關(guān)鍵作用[5-6]。Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的能量代謝方式，M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase subtype M2，PKM2）是最重要的一種Warburg效應(yīng)相關(guān)蛋白，在大多腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[7]。本研究旨在探討過(guò)表達(dá)ATF4下調(diào)Warburg效應(yīng)相關(guān)蛋白PKM2表達(dá)及對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試藥

人肝癌細(xì)胞系HepG2（南華大學(xué)微生物研究所）。二甲基亞砜（杭州四季青公司，批號(hào)：171014）；Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1705567）；ATF4質(zhì)粒及空載質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因公司，批號(hào)：170506）；質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生物技術(shù)公司，批號(hào)：1701016）；Loading-Buffer上樣緩沖液（北京碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：ST506）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：G1712）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：p0017s）；流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京聯(lián)科生物技術(shù)公司，批號(hào)：170513）；L-乳酸鹽檢測(cè)試劑盒（北京九強(qiáng)生物有限公司，批號(hào)：170621）；PKM2兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)：170-21）；GAPDH兔抗人單克隆抗體（北京博奧森有限公司，批號(hào)：bs-0061R）；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京博奧森有限公司，批號(hào)：Zbs0175R）；辣根標(biāo)記山羊抗鼠IgG（北京博奧森有限公司，批號(hào)：Zbs0175R）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，培養(yǎng)基含10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。每1～2天進(jìn)行細(xì)胞換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組和ATF4質(zhì)粒組。

1.2.2 ATF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及質(zhì)粒DNA提取 ATF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，載體名稱為GV362。元件順序：CMV-MCS-3FLAG-IRES-EGFP-SV40-Neomycin；克隆位點(diǎn)：XhoI/BamHI；對(duì)照編號(hào)：CON236。ATF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建好后，對(duì)目的基因進(jìn)行陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，證明成功構(gòu)建ATF4表達(dá)質(zhì)粒。以LB粉劑加入一級(jí)水配制成LB液，高壓蒸汽滅菌備用。細(xì)菌操作臺(tái)內(nèi)將卡那霉素加入上述LB培養(yǎng)液中。以含質(zhì)粒（ATF4或空質(zhì)粒）的菌液分別加入LB培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)16 h。按質(zhì)粒小提試劑盒中操作說(shuō)明進(jìn)行提取純化質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞按106個(gè)/孔接種于6孔板中，含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞均勻鋪滿孔板90%時(shí)轉(zhuǎn)染。去培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍。配制轉(zhuǎn)染混合液：A液為4 μg ATF4表達(dá)質(zhì)粒（或空質(zhì)粒載體）用無(wú)血清1640培養(yǎng)基稀釋成250 μL。B液為10 μL Lipofectamine 2000用無(wú)血清1640培養(yǎng)基稀釋成250 μL。B液靜置5 min后，混合A液和B液，混合后靜置20 min后成為轉(zhuǎn)染混合液。將上述轉(zhuǎn)染混合液按分組加入6孔板內(nèi)，輕輕晃動(dòng)混勻，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h后，PBS清洗2遍，加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，并計(jì)算轉(zhuǎn)染率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-PE/7-AAD熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集各組HepG2細(xì)胞于離心管中，離心半徑為55 mm，1000 r/min，離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，將細(xì)胞懸于1×結(jié)合緩沖液中，加5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-ADD，輕輕混勻冰上避光反應(yīng)15 min，加380 μL冷的1×結(jié)合緩沖液，重復(fù)3次，上機(jī)檢測(cè)。每次計(jì)細(xì)胞數(shù)6000個(gè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，流式細(xì)胞儀分析不同DNA含量的細(xì)胞分布，用分析軟件CellQuest檢測(cè)凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)PKM2蛋白表達(dá) HepG2細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30～40 h，離心半徑為30 mm，14 000 r/min離心10 min，收集上清液。BCA法定量蛋白濃度。RIPA裂解液稀釋、配平蛋白，加入Loading-Buffer上樣緩沖液。PCR儀中99℃、10 min煮沸使蛋白變性。配制好SDS-PAGE凝膠，加入適量蛋白樣品至加樣孔后電泳。切出目的膠并裁剪相應(yīng)的PVDF膜，以150 mA恒定電流將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h。一抗anti-ATF4（1∶2000）、anti-PKM2（1∶1000）和anti-GAPDH（1∶2000）孵育過(guò)夜。二抗孵育2 h。顯影。采用Image J軟件處理結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 L-乳酸鹽檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的乳酸分泌量 HepG2細(xì)胞按105個(gè)/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)貼壁，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后備用。分別收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，按乳酸檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)各樣本中的乳酸含量（mmol/L），記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)ATF4的HepG2細(xì)胞系的建立

光鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞形態(tài)正常，具有良好的透光度，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的大片細(xì)胞死亡以及細(xì)胞碎片的形成。熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染組EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到（84.56±5.83）%。見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)ATF4對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

與空質(zhì)粒組比較，ATF4質(zhì)粒組的HepG2細(xì)胞凋亡率顯著升高（P < 0.05），而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)ATF4對(duì)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量的影響

與空質(zhì)粒組比較，ATF4質(zhì)粒組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量顯著減少（P < 0.05），而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 過(guò)表達(dá)ATF4對(duì)HepG2細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)的影響

與空質(zhì)粒組比較，ATF4質(zhì)粒組HepG2細(xì)胞中PKM2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P < 0.05），而空質(zhì)粒組與空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展受肝癌細(xì)胞本身、肝癌與微環(huán)境之間相互作用等多方面因素的影響，肝癌的發(fā)生伴隨著細(xì)胞形態(tài)變化、功能缺失及細(xì)胞代謝的顯著改變等[8-10]。ATF4是一種未折疊反應(yīng)蛋白，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，其主要功能包括氨基酸的合成與運(yùn)輸、能量代謝、糖脂代謝及整合應(yīng)激反應(yīng)等[11]。研究發(fā)現(xiàn)ATF4參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡，影響著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，ATF4過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF4能夠調(diào)節(jié)黃猩猩果蠅細(xì)胞的糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，過(guò)表達(dá)ATF4基因的裸鼠橫紋肌肉瘤成瘤體積小于野生型裸鼠，表明ATF4能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)下游基因ANSN表達(dá)有關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATF4過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。但是ATF4的作用機(jī)制尚不完善，其作為未折疊蛋白因子影響腫瘤細(xì)胞的功能已經(jīng)比較明確，但ATF4在通過(guò)調(diào)節(jié)代謝通路而影響腫瘤方面的作用尚不清楚，因此，ATF4作為腫瘤代謝調(diào)控因子的功能有待進(jìn)一步探討。

Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞代謝的主要標(biāo)志之一，即細(xì)胞在氧充足的條件下仍以糖酵解為主產(chǎn)生大量乳酸。許多腫瘤組織中都能觀察到Warburg效應(yīng)，包括肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等[16]。研究顯示，下調(diào)Warburg效應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。Warburg效應(yīng)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，有氧糖酵解影響腫瘤發(fā)展、遷移及治療等多方面，抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解表型能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。

Warburg效應(yīng)包括丙酮酸激酶等酶基因在內(nèi)的多個(gè)作用靶點(diǎn)，這些作用位點(diǎn)統(tǒng)稱為Warburg效應(yīng)相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)這些酶基因表達(dá)都能直接影響Warburg效應(yīng)。丙酮酸激酶有四種表型，PKM2是其中最主要的腫瘤表型。通常來(lái)說(shuō)，PKM1主要存在于非增生性組織中，而PKM2則為增殖性組織中所特有。PKM1向PKM2表型的轉(zhuǎn)換是PKM2在許多癌癥細(xì)胞中呈高表達(dá)的主要原因，這說(shuō)明Warburg效應(yīng)相關(guān)蛋白PKM2具有致瘤性。研究顯示，PKM2促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移，并且能夠介導(dǎo)Warburg效應(yīng)的建立，是Warburg效應(yīng)的重要標(biāo)志物[19-20]。然而ATF4是否對(duì)腫瘤Warburg效應(yīng)有調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ATF4可下調(diào)HepG2細(xì)胞PKM2的表達(dá)，減少肝癌HepG2細(xì)胞乳酸生成，表明過(guò)表達(dá)ATF4可抑制肝癌HepG2細(xì)胞Warburg效應(yīng)。因此推測(cè)過(guò)表達(dá)ATF4可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制Warburg效應(yīng)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Marquardt JU，Andersen JB，Thorgeirsson SS. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer [J]. Nat Rev Cancer，2015，15（11）：653-667.

[2] 紀(jì)龍珊，孫學(xué)華，周振華，等.肝細(xì)胞核因子4α與肝細(xì)胞癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（2）：32-35.

[3] Teske BF，Wek SA，Bunpo P，et al. The eIF2 kinase PERK and the integrated stress response facilitate activation of ATF6 during endoplasmic reticulum stress [J]. Mol Biol Cell，2011，22（22）：4390-4405.

[4] Rouschop KM，van den Beucken T，Dubois L，et al. The unfolded protein response protects human tumor cells during hypoxia through regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5 [J]. J Clin Invest，2010，120（1）：127-141.

[5] Rozpedek W，Pytel D，Mucha B，et al. The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress [J]. Curr Mol Med，2016，16（6）：533-544.

[6] Chir WB，Maurin AC，Carraro V，et al. The eIF2α/ATF4 pathway is essential for stress-induced autophagy gene expression [J]. Nucleic Acids Res，2013，41（16）：7683-7699.

[7] Liu T，Yin H. PDK1 promotes tumor cell proliferation and migration by enhancing the Warburg effect in non-small cell lung cancer [J]. Oncol Rep，2017，36（1）：193-200.

[8] 周彬，陳志浩，宮緒萌，等.骨髓干細(xì)胞移植治療肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（22）：151-153.

[9] Hutter LH，Rata S，Hochegger H，et al. Interlinked bistable mechanisms generate robust mitotic transitions [J]. Cell Cycle，2017，16（20）：1885-1892.

[10] 孫丹妮，黃洵.NF-κB在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（18）：42-45.