cTfh細(xì)胞及相關(guān)miR—146a在乙肝疫苗記憶性免疫應(yīng)答中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及關(guān)聯(lián)研究

余祖衛(wèi)　李玉蓮　陳麗華　尹明娟　黃玲鳳　張艷

[摘要]目的 檢測(cè)乙肝疫苗記憶性免疫應(yīng)答過(guò)程中miR-146a與外周血濾泡輔助性T細(xì)胞（cTfh）動(dòng)態(tài)表達(dá)水平，分析miR-146a、Tfh與乙肝疫苗免疫應(yīng)答之間的相關(guān)性。方法 于2017年7月招募大朗社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心已完成3針乙肝疫苗標(biāo)準(zhǔn)程序的健康成人接種1針乙肝疫苗，收集12例健康志愿者的外周血標(biāo)本。在疫苗接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，采用ELISA法測(cè)定血清中乙肝表面抗體（HBsAb）濃度；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞的比例；采用熒光定量PCR檢測(cè)miR-146a的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 cTfh在疫苗接種后第7天達(dá)到最高（P=0.001），HBsAb水平在疫苗接種后第14天達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞成負(fù)相關(guān)（r=-0.426，P=0.03），漿細(xì)胞與HBsAb成正相關(guān)（r=0.330，P=0.04）。miR-146a與cTfh、HBsAb均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論 Tfh細(xì)胞可能參與乙肝疫苗記憶性免疫應(yīng)答過(guò)程，但未能證明miR-146a與乙肝疫苗免疫應(yīng)答存在相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]miR-146a；濾泡輔助性T細(xì)胞；乙肝疫苗；免疫應(yīng)答；相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）7（b）-0012-04

[Abstract] Objective To detect the dynamic expression levels of miR-146a and circulating T follicular helper （cTfh） cell during immune response of hepatitis B vaccination， and then analyze the association between miR-146a， cTfh cell and the immune response of hepatitis B vaccination. Methods In July 2017， a group of healthy adults who had completed the standard procedure for the hepatitis B vaccination in Community Health Service Center of Dalang Country were recruited to receive one dose of hepatitis B vaccination， and peripheral blood samples were collected from 12 volunteers at different time points after vaccination， ELISA method was used to measure the concentration of Hepatitis B surface antibody （HBsAb） in serum； Flow cytometry was used to detect the proportion of Tfh cells， B cells， plasma cells， and memory B cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of miR-146a. Results cTfh cell reached the highest level （P=0.001） on the 7th day after vaccination， and the HBsAb reached the highest level on the 14th day after vaccination， and the difference was statistically significant （P<0.001）. There was a negative correlation between the Tfh cells and B cells （r=-0.426， P=0.03）， and a positive correlation between the plasma cells and HBsAb （r=0.330， P=0.04）. There was no significant correlation between the expression level of miR-146a， cTfh cell and HBsAb （P>0.05）. Conclusion Tfh cells might play a role in the immune response to hepatitis B vaccination， but not demonstrate the association between miR-146a and the immune response of hepatitis B vaccination.

[Key words] miR-146a； T follicular helper cell； Hepatitis B vaccination； Immune response； Association

乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年約有100萬(wàn)人死于乙肝感染，迄今并無(wú)特效治療方法。世界衛(wèi)生組織（WHO）指出接種乙肝疫苗是控制HBV感染最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。研究表明按標(biāo)準(zhǔn)程序接種后仍有5%～10%的健康人群不能產(chǎn)生保護(hù)性的抗體水平，處于無(wú)/弱應(yīng)答狀態(tài)（<10 IU/ml為無(wú)應(yīng)答者，10～100 IU/ml為弱應(yīng)答者），該人群仍對(duì)HBV易感[1]。

乙肝疫苗弱應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，乙肝疫苗免疫應(yīng)答的機(jī)制研究可以為乙肝疫苗弱應(yīng)答機(jī)制研究提供思路。濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh細(xì)胞）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)主要輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群，對(duì)B細(xì)胞增殖與分化、高親和力抗體的產(chǎn)生、抗體的類別轉(zhuǎn)換、免疫記憶的發(fā)生是不可或缺的[2]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道外周血中ICOS+CXCR3+CXCR5+CD4+T細(xì)胞與流感疫苗免疫應(yīng)答相關(guān)[3]，Crotty[4]報(bào)道了增加Tfh細(xì)胞可以增強(qiáng)狂犬疫苗的保護(hù)效果，而Tfh細(xì)胞是否參與乙肝疫苗免疫應(yīng)答尚不清楚。

miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)在Tfh細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[5]。在這些與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNAs中，多個(gè)研究證明miR-146a是調(diào)控Tfh細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵性miRNA[6-7]。在Tfh細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平明顯高于其他效應(yīng)T細(xì)胞，miR-146a可以直接靶向作用Tfh細(xì)胞上的ICOS，對(duì)Tfh細(xì)胞分化起制約作用，防止過(guò)度免疫反應(yīng)發(fā)生[8]。

本研究旨在探討Tfh細(xì)胞及其miR-146a與乙肝疫苗免疫應(yīng)答是否存在關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步闡明乙肝疫苗弱應(yīng)答發(fā)生機(jī)制提供理論參考。

1資料與方法

1.1一般資料

于2017年7月招募東莞市大朗社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心健康志愿者12例，男、女各6例，年齡23～36歲，體重42～68 kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：①愿意全程參與實(shí)驗(yàn)，并服從實(shí)驗(yàn)安排；②無(wú)基礎(chǔ)疾病，未感染過(guò)HBV；③最近1年內(nèi)未接種過(guò)乙肝疫苗。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)疫苗存在過(guò)敏反應(yīng)；②實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生其他感染性疾病。告知研究對(duì)象研究?jī)?nèi)容與目標(biāo)，簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器

重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）供應(yīng)商為葛蘭素史克生物制劑公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；鼠抗人CD19-PE、鼠抗人CD-27-FITC、鼠抗人CD38-BV421均購(gòu)自BD公司；鼠抗人CD4-PerCP、鼠抗人CXCR5-PE均購(gòu)自eBioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液、EasySepTM human CD4+ T-cell enrichment kit均購(gòu)自STEMCELL公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogene公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit、FastStartUniversal SYBR Green Master試劑均購(gòu)自Roche公司。儀器主要有多功能酶標(biāo)儀（購(gòu)自BioTekInstruments 公司）、流式細(xì)胞儀（BD公司）、基因擴(kuò)增儀（Eppendorf公司）、PikoREAL熒光定量PCR（Thermo公司）。

1.3方法

1.3.1乙肝疫苗接種 所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象在大朗社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心預(yù)防接種門(mén)診接種乙肝疫苗，接種部位與方式為上臂外側(cè)三頭肌，肌內(nèi)注射。接種乙肝疫苗后，預(yù)約安排采血時(shí)間，于接種疫苗前和接種后第7、14、28天采集受試者晨起空腹靜脈血。采血部位為肘前靜脈，采血量為20 ml左右。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)血清中HBsAb濃度 將采血管室溫靜置30 min，待有血清析出，每管收集200 μl血清-80℃保存、備用。ELISA法檢測(cè)血清中HBsAb濃度（具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)），多功能酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞的比例變化 利用淋巴細(xì)胞分離液通過(guò)梯度離心法分離外周靜脈血單核細(xì)胞（PBMC）。取兩管1×106外周血單核細(xì)胞，用1 ml Buffer液重懸細(xì)胞300 g，室溫離心10 min，棄上清，再用100 μl重懸細(xì)胞，一管加流式抗體CD4-PerCP、CXCR5-PE，另一管加入流式抗體CD19-PE、CD27-FITC、CD38-BV421，用移液器輕輕吹打混勻，避光室溫孵育30 min，孵育結(jié)束后加入1 ml Buffer，重懸細(xì)胞300 g，室溫離心10 min，棄上清，用400 μl 2%多聚甲醛固定細(xì)胞，所得樣品使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果以“%”表示。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-146a相對(duì)表達(dá)量 在PBMC細(xì)胞基礎(chǔ)上用免疫磁珠法富集人外周血中CD4+細(xì)胞。用500 ulTRIzol裂解CD4+細(xì)胞，提取總RNA，使用miR-146a莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列詳見(jiàn)表1，以U6為內(nèi)參測(cè)定miR-146a的mRNA表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 15.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和相關(guān)性分析，不同時(shí)點(diǎn)均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，相關(guān)性采用雙變量相關(guān)性分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HBsAb濃度動(dòng)態(tài)變化

用ELISA方法檢測(cè)血清中的HBsAb濃度，結(jié)果顯示接種疫苗后HBsAb濃度顯著增高，于第14天達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.3，P<0.001）（表2）。

2.2外周血中Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化

通過(guò)熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Tfh細(xì)胞（CXCR5+CD4+T細(xì)胞）、B細(xì)胞（CD19+）、漿細(xì)胞（CD19+CD27+CD38+）、記憶性B細(xì)胞（CD19+CD27+CD38-）比例。流式分析圈門(mén)策略見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示接種乙肝疫苗后Tfh細(xì)胞增高，于第7天達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.46，P=0.001）；接種乙肝疫苗后B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞均減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.24，P=0.869；F=1.37，P=0.285）；接種乙肝疫苗后漿細(xì)胞增高，于第28天達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.24，P=0.009）（表2）。

2.3 CD4+細(xì)胞中miR-146a表達(dá)水平

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)CD4+細(xì)胞中miR-146a mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示接種乙肝疫苗后miR-146a處于動(dòng)態(tài)變化，均于第14天表達(dá)量達(dá)到最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.88，P=0.003）（表2）。

2.4相關(guān)性分析

分別對(duì)miR-146a與Tfh細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-146a與Tfh細(xì)胞無(wú)相關(guān)性（r=-0.068，P=0.71）（圖2-A）；將miR-146a與HBsAb進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-146a與HBsAb無(wú)相關(guān)性（r=-0.085，P=0.64）（圖2-B）；將Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞、漿細(xì)胞與HBsAb進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞成負(fù)相關(guān)（r=-0.426，P=0.03），漿細(xì)胞與HBsAb成正相關(guān)（r=0.330，P=0.04）（圖2-C、圖2-D）。

3討論

目前，乙肝疫苗弱應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制尚未明確，但由于乙肝疫苗激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)是T細(xì)胞依賴的，所以國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，T細(xì)胞的輔助作用是乙肝疫苗弱應(yīng)答發(fā)生的關(guān)鍵。自乙肝疫苗推廣使用以來(lái)，輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）一直是乙肝疫苗弱應(yīng)答發(fā)生機(jī)制研究的熱點(diǎn)[9-10]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Tfh細(xì)胞才是主要輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群，而miRNA廣泛參與T細(xì)胞激活及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。目前，Tfh細(xì)胞及相關(guān)miR-146a是否與乙肝疫苗免疫應(yīng)答存在關(guān)聯(lián)未見(jiàn)報(bào)道。因此，明確Tfh細(xì)胞及相關(guān)miRNA在乙肝疫苗免疫應(yīng)答中的作用，對(duì)進(jìn)一步闡明其在乙肝疫苗弱應(yīng)答發(fā)生機(jī)制有重要參考價(jià)值，并為新型乙肝疫苗佐劑研制、HBV感染的防控提供科學(xué)依據(jù)。

由于人體接種乙肝疫苗后外周血中CXCR5+CD4+T細(xì)胞（cTfh）也具有Tfh細(xì)胞相同的表型特征，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上與Tfh細(xì)胞有共同之處，且同樣具有輔助B細(xì)胞功能[11]。在人的淋巴組織樣本難以獲得情況下，采用cTfh細(xì)胞作為替代物是目前普遍且可行的研究方法。研究結(jié)果顯示，接種乙肝疫苗之后cTfh細(xì)胞構(gòu)成比于第7天達(dá)到最高，提示其參與乙肝疫苗免疫應(yīng)答的過(guò)程。體液免疫過(guò)程中，漿細(xì)胞可以合成、分泌抗體，結(jié)果顯示接種疫苗之后漿細(xì)胞的比例增高，HBsAb表達(dá)水平增高，提示接種乙肝疫苗之后Tfh細(xì)胞數(shù)量增多，增強(qiáng)乙肝疫苗免疫應(yīng)答。此外，相關(guān)性分析顯示cTfh細(xì)胞與B細(xì)胞成負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，而漿細(xì)胞與抗體成正相關(guān)趨勢(shì)，提示在乙肝疫苗免疫應(yīng)答過(guò)程中cTfh細(xì)胞增高可以輔助B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，促進(jìn)免疫應(yīng)答。而相關(guān)性分析顯示，miR-146與cTfh細(xì)胞、HBsAb均無(wú)相關(guān)性，提示miR-146可能并不參與乙肝疫苗的免疫應(yīng)答過(guò)程。

綜上所述，Tfh細(xì)胞可能在乙肝疫苗免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，而miR-146并不能通過(guò)調(diào)控Tfh細(xì)胞參與乙肝疫苗免疫應(yīng)答的過(guò)程。Tfh細(xì)胞是否參與乙肝疫苗弱應(yīng)答發(fā)生過(guò)程以及作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-04-12 本文編輯：閆 佩）