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    左西孟旦對豬冠狀動脈微栓塞后心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

    2018-11-09 02:23:58王江友陳涵宋丹劉成偉彭劍鄢華張龍巖
    中國介入心臟病學(xué)雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:孟旦左西心肌細(xì)胞

    王江友 陳涵 宋丹 劉成偉 彭劍 蘇 鄢華 張龍巖

    冠狀動脈微栓塞(coronary microembolization,CME)是急性冠狀動脈綜合征及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)圍術(shù)期常見并發(fā)癥,主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導(dǎo)致[1]。研究顯示,CME發(fā)生與冠狀動脈無復(fù)流或慢血流存在直接相關(guān),進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及近遠(yuǎn)期心功能明顯下降,即使心外膜血流恢復(fù)正常,心功能依然進(jìn)行性下降[2];一旦CME發(fā)生,目前包括藥物及器械相關(guān)保護措施均不能改善患者近、遠(yuǎn)期臨床預(yù)后[3]。因此,PCI圍術(shù)期CME所致并發(fā)癥仍是臨床醫(yī)師所面臨的難題。

    既往國外大量研究表明,CME發(fā)生后常伴有大量心肌炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為大量心肌組織中白細(xì)胞浸潤,其中的機制可能是CME誘發(fā)心肌炎癥反應(yīng),增加心肌組織腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的大量釋放,最終導(dǎo)致心肌損傷及收縮功能惡化[4-7]。前期本研究團隊針對動物實驗發(fā)現(xiàn),CME發(fā)生后,心肌微梗死灶周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤,并伴炎性因子的釋放,從而誘發(fā)心肌局部炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致CME后心肌損傷及進(jìn)行性心功能障礙[8-10]。

    左西孟丹作為一類新穎的強心藥物,目前適用于傳統(tǒng)抗心力衰竭治療療效不佳,并且需要增加心肌收縮力的急性失代償心力衰竭的短期治療。近年來大量研究證實,左西孟丹在多種組織中能夠抑制促炎癥反應(yīng)因子TNF-α的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用[11-12]。本研究團隊設(shè)想,是否能夠使用左西孟旦預(yù)處理,降低CME后心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),并且闡明其主要通過抑制促炎癥蛋白TNF-α而起保護作用。另外,前期研究發(fā)現(xiàn),CME后12 h心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰。因此本研究均在成功建立CME模型后12 h作為研究觀察時間,進(jìn)行各組實驗動物指標(biāo)的對比研究。

    1 材料與方法

    1.1 微栓塞球的制備

    取 42 μm 的微栓塞球 10 μl(42 μm Dynospheres,挪威Dyno 公司),放入 1.5 ml EP管中,加生理鹽水至1 ml,配制成20×104個/ml,顯微鏡下計數(shù);然后取12×104個/0.6 ml,放入60 ml離心管中,加入生理鹽水配成40~45 ml,再次計數(shù),使用前用超聲震蕩攪勻儀使微栓塞球混合均勻。

    1.2 CME 模型建立[4]

    12周齡小型豬(雌雄不拘),體重21~25 kg,肌注氯安酮和苯二氮 誘導(dǎo)麻醉后,給予戊巴比妥靜脈維持麻醉,分離右側(cè)股動脈,置入7 F動脈鞘,經(jīng)鞘管給予肝素200 U/kg 以達(dá)到肝素化,此后每延長1 h靜脈注射肝素100 U/kg維持肝素化。然后血管造影(DSA,GE INNOVA 2000)行冠狀動脈造影,送入微導(dǎo)管(3.0/2.8 F ,科迪斯公司)于左前降支(LAD)中段(發(fā)出第一對角支)處,經(jīng)微導(dǎo)管在40 min內(nèi)注入42 μm的微栓塞球45 ml(假手術(shù)組注射等量生理鹽水),再用10 ml生理鹽水沖洗微導(dǎo)管并注入冠狀動脈內(nèi)。

    1.3 實驗分組與處理

    共15頭小豬,每組5頭。分為假手術(shù)組、CME組、CME+左西孟旦組。CME+左西孟旦組在CME建立前用左西孟旦預(yù)處理,全麻下從耳緣靜脈以0.05 μg/(kg · min)使用 24 h,術(shù)前 60 min 再以0.2 μg/(kg · min)負(fù)荷使用。

    1.4 心臟功能測定

    所有實驗動物均采用Philips sonos7500型超聲心動圖儀,探頭頻率10 MHz,檢測各組小型豬左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、心排血量(CO)及左心室短軸縮短率(FS)。所有測量指標(biāo)均取三個心動周期的平均值為最終結(jié)果。

    1.5 心肌梗死面積測量

    蘇木素堿性苦味酸染色(HE染色)是診斷早期心肌缺血壞死的一種重要染色方式,缺血心肌呈紅染,正常心肌細(xì)胞胞漿黃染、胞核藍(lán)染。心肌缺血壞死面積采用DMR+Q550 病理圖像分析儀測定,每張HBFP染色切片隨機選取5個視野(×100倍),使用Leica Qwin分析軟件平面法測量梗死區(qū)域,表示為總分析切片的面積百分比,取平均值[4]。

    1.6 以Western-blot檢測心肌組織中TNF-α

    檢測促凋亡蛋白TNF-α的表達(dá)。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗心肌組織兩次,勻漿,在4℃以下12000 r/min離心15 min提取心肌組織總蛋白;以95℃10 min,每份標(biāo)本取20 μg蛋白于12%分離膠和5%濃縮膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳;蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜;室溫下5%牛奶封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,HRP標(biāo)志二抗按l ∶ 2000稀釋室溫下孵育1 h,采用目標(biāo)條帶的積分吸光度值經(jīng)actin校正后(美國Bio-Rad公司,Gel Doc 2000凝膠圖像)用專用軟件分析,TNF-α的活化產(chǎn)物IA值/actin IA值表示其相對活化水平。

    1.7 以ELISA法測定血清超敏C-反應(yīng)蛋白(HsCRP)、TNF-α 濃度

    按照說明書操作采用ELISA法測定血清HsCRP、TNF-α 濃度。

    1.8 心肌損傷標(biāo)記物測定

    cTnI測定采用免疫化學(xué)發(fā)光法測定。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以(-x ±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組實驗動物心功能指標(biāo)比較

    CME 組術(shù)后 12 h FS[(24.49±2.86)%比(41.28±2.86) %,P=0.023]、LVEF[(49.83±4.64) % 比(66.86±3.97) %,P=0.035]、CO[(2.58±0.42) L/min比(4.32±0.89) L/min,P=0.042]與假手術(shù)組比較均顯著下降,而 LVEDd[(38.26±1.93) mm 比(32.39±1.52) mm,P=0.043]比假手術(shù)組顯著增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。CME+ 左西孟旦組 FS[(32.42±3.98) %比(24.49±2.86) %,P=0.029]、LVEF[(58.42±5.28) %比(49.83±4.64) %,P=0.043]、CO[(3.58±0.92) L/min 比(2.58±0.42) L/min,P=0.038]與 CME 組比較均呈現(xiàn)升高趨勢,LVEDd [(33.92±1.56) mm比(38.26±1.93) mm,P=0.037]比CME 組呈現(xiàn)降低趨勢,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

    表1 冠狀動脈微栓塞術(shù)后12 h各組實驗動物心功能指標(biāo)比較(±s)

    表1 冠狀動脈微栓塞術(shù)后12 h各組實驗動物心功能指標(biāo)比較(±s)

    注:a,與假手術(shù)組比較,P<0.05;b,與CME組比較,P<0.05;LVEF,左心室射血分?jǐn)?shù);FS,左心室短軸縮短率;LVEDd,左心室舒張末期內(nèi)徑;CO,心排血量

    項目 假手術(shù)組(n=5)CME組(n=5)CME+左西孟旦組(n=5)LVEF (%)66.86±3.97 49.83±4.64a 58.42±5.28ab FS (%)41.28±2.8624.49±2.86a 32.42±3.98ab LVEDd (mm)32.39±1.5238.26±1.93a33.92±1.56b CO (L/min) 4.32±0.89 2.58±0.42a 3.58±0.92ab

    2.2 各組實驗動物心肌損傷標(biāo)志物比較

    CME 組與假手術(shù)組比較,術(shù)后12 h 肌鈣蛋白 明顯升高[(0.229±0.038)ng/ml 比(0.049±0.009)ng/ml,P=0.025]。CME+ 左 西 孟 旦 組與CME 組比較,肌鈣蛋白 明顯下降[(0.128±0.029)ng/ml比 (0.229±0.038)ng/ml,P=0.048]。

    2.3 各組實驗動物血清炎癥指標(biāo)比較

    CME 組 術(shù) 后 12 h 血 清 HsCRP[(15.68±8.62)mg/ L 比(3.58±1.68)mg/ L,P=0.018]、TNF-α 濃 度[(82.58±20.35)ng/ L 比(23.65±12.68)ng/ L,P=0.027]均明顯高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。CME+左西孟旦組HsCRP[(7.25±2.98)mg/L 比(15.68±8.62)mg/ L,P=0.038]、TNF-α 濃度[(42.68±18.95)ng/ L 比(82.58±20.35)ng/ L,P=0.029] 均明顯 低于CME 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.4 CME 病理學(xué)改變

    HE 染色顯示微梗死灶內(nèi)心肌細(xì)胞核消失或溶解,細(xì)胞胞漿呈紅染,梗死灶周邊細(xì)胞變性、水腫,周圍炎性細(xì)胞大量浸潤及紅細(xì)胞滲出(圖1)。HE染色發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組未見明顯心肌微梗死灶;CME組和CME+左西孟旦組均可見多處心肌微梗死灶,呈局灶性分布,非透壁性,以內(nèi)膜下和左心室多見(圖2)。CME+左西孟旦組梗死面積占比明顯低于CME組[(6.658±2.897)%比(9.986±3.542)%,P=0.036]。

    2.5 心肌組織TNF-α蛋白的表達(dá)

    Western blot 定量分析顯示,CME 組與假手術(shù)組比較心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)水平較高(P=0.039);CME+左西孟旦組與CME 組比較,心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)水平較低(P=0.042),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

    3 討論

    CME是急性冠狀動脈綜合征及介入治療圍術(shù)期常見并發(fā)癥,主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導(dǎo)致[1]。研究顯示,CME發(fā)生與冠狀動脈無復(fù)流或慢血流存在直接相關(guān),進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及近、遠(yuǎn)期心功能明顯下降,即使心外膜血流恢復(fù)正常,心功能依然進(jìn)行性下降[2];一旦患者發(fā)生CME后,藥物及器械相關(guān)保護措施均不能改善其近期和遠(yuǎn)期臨床預(yù)后[3]。有動物實驗發(fā)現(xiàn),在犬的冠狀動脈內(nèi)注入微栓塞球,犬的冠狀動脈血流短暫減少后即刻可恢復(fù)正常,但心肌的收縮功能呈現(xiàn)進(jìn)行性下降現(xiàn)象,表明CME致心肌損傷的機制并非由心外膜血管血流減少所決定[13]。另有動物實驗發(fā)現(xiàn),微栓塞所致壞死心肌的面積占總心肌面積不到5%,微栓塞所致心肌細(xì)胞壞死不足以完全解釋心肌收縮功能障礙[14]。本研究表明,動物CME模型建立后,心肌缺血壞死面積占比很少,但是心臟功能明顯受到損傷,與既往研究結(jié)果一致。

    圖1 冠狀動脈微栓塞后心肌微梗死區(qū)域HE染色(×200) A.CME術(shù)后12 h微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色(箭頭所示為微動脈內(nèi)的微栓塞球);B.CME+左西孟旦組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色(箭頭所示為微動脈內(nèi)的微栓塞球),梗死程度及炎癥浸潤幅度明顯少于CME組

    圖2 冠狀動脈微栓塞后心肌微梗死區(qū)域HE染色(×100) A.假手術(shù)組心室前壁心肌組織未見明顯微梗死灶;B.CME術(shù)后12 h微梗死灶區(qū)域HE染色(箭頭示微梗死灶染成紅色);C.CME+左西孟旦組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色(箭頭示微梗死灶染成紅色),梗死面積明顯少于CME組

    圖3 Western blot 定量分析

    既往研究表明,CME發(fā)生后心肌細(xì)胞TNF-α蛋白明顯升高,與心臟功能明顯相關(guān),通過TNF-α抗體抑制TNF-α表達(dá),心功能明顯改善,因此,證實TNF-α與CME所致心功能下降密切相關(guān)[15-16]。另有研究發(fā)現(xiàn), CME發(fā)生后的缺血心肌組織細(xì)胞中,TNF-α表達(dá)顯著升高并伴有白細(xì)胞浸潤,使用TNF-α抗體和糖皮質(zhì)激素抗炎可防治CME導(dǎo)致的心功能不全,進(jìn)一步證實了CME致心功能不全發(fā)生機制與TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[17]。本研究表明,CME發(fā)生后,在微梗死灶周圍,發(fā)現(xiàn)有大量炎癥細(xì)胞浸潤,證實其中的機制可能是CME誘發(fā)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),增加心肌組織TNF-α蛋白表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及收縮功能惡化。

    左西孟丹作為一類新型的強心藥物,目前適用于傳統(tǒng)抗心力衰竭治療(如利尿藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥及洋地黃類)療效不佳,并且需要增加心肌收縮力的急性失代償心力衰竭的短期治療。左西孟丹目前已發(fā)展成在急性心力衰竭或其他心源性需要使用強心藥物時的理想選擇。另外,左西孟旦能夠增加心臟收縮功能而不增加心臟耗能,有改善心室-血管收縮耦合,改善外周血管舒張,增加組織灌注,抗心肌頓抑及抗炎癥反應(yīng)作用[18]。近年來大量研究證實,左西孟丹在多種組織中能夠抑制促炎癥反應(yīng)因子TNF-α的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用[11-12]。Grossini等[11]研究發(fā)現(xiàn),左西孟旦能夠通過抑制炎癥改善豬急性再灌注肝損傷。Paraskevaidis等[12]研究顯示,左西孟旦能夠通過抑制心肌炎癥及凋亡,改善慢性心力衰竭患者長期預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn),左西孟旦預(yù)處理能夠明顯抑制促炎因子TNF-α活化,降低心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),從而改善心臟功能。

    本研究發(fā)現(xiàn),CME發(fā)生后12 h,心肌組織促炎因子TNF-α明顯增高,心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)顯著增加,心臟功能明顯下降;然而,通過左西孟旦預(yù)處理,能夠明顯抑制促炎因子TNF-α表達(dá),降低心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),從而改善心臟功能。左西孟旦防治CME致心肌損傷的分子和效應(yīng)機制,為CME所致心肌損傷的防治提供新穎的策略;為未來在PCI圍術(shù)期使用左西孟旦降低心肌損傷,改善心功能及長期預(yù)后提供理論依據(jù)。

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