左西孟旦對豬冠狀動脈微栓塞后心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

王江友 陳涵 宋丹 劉成偉 彭劍 蘇 鄢華 張龍巖

冠狀動脈微栓塞（coronary microembolization，CME）是急性冠狀動脈綜合征及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）圍術(shù)期常見并發(fā)癥，主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導(dǎo)致［1］。研究顯示，CME發(fā)生與冠狀動脈無復(fù)流或慢血流存在直接相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及近遠(yuǎn)期心功能明顯下降，即使心外膜血流恢復(fù)正常，心功能依然進(jìn)行性下降［2］；一旦CME發(fā)生，目前包括藥物及器械相關(guān)保護措施均不能改善患者近、遠(yuǎn)期臨床預(yù)后［3］。因此，PCI圍術(shù)期CME所致并發(fā)癥仍是臨床醫(yī)師所面臨的難題。

既往國外大量研究表明，CME發(fā)生后常伴有大量心肌炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為大量心肌組織中白細(xì)胞浸潤，其中的機制可能是CME誘發(fā)心肌炎癥反應(yīng)，增加心肌組織腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的大量釋放，最終導(dǎo)致心肌損傷及收縮功能惡化［4-7］。前期本研究團隊針對動物實驗發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后，心肌微梗死灶周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，并伴炎性因子的釋放，從而誘發(fā)心肌局部炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致CME后心肌損傷及進(jìn)行性心功能障礙［8-10］。

左西孟丹作為一類新穎的強心藥物，目前適用于傳統(tǒng)抗心力衰竭治療療效不佳，并且需要增加心肌收縮力的急性失代償心力衰竭的短期治療。近年來大量研究證實，左西孟丹在多種組織中能夠抑制促炎癥反應(yīng)因子TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用［11-12］。本研究團隊設(shè)想，是否能夠使用左西孟旦預(yù)處理，降低CME后心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并且闡明其主要通過抑制促炎癥蛋白TNF-α而起保護作用。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，CME后12 h心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰。因此本研究均在成功建立CME模型后12 h作為研究觀察時間，進(jìn)行各組實驗動物指標(biāo)的對比研究。

1 材料與方法

1.1 微栓塞球的制備

取 42 μm 的微栓塞球 10 μl（42 μm Dynospheres，挪威Dyno 公司），放入 1.5 ml EP管中，加生理鹽水至1 ml，配制成20×104個/ml，顯微鏡下計數(shù)；然后取12×104個/0.6 ml，放入60 ml離心管中，加入生理鹽水配成40～45 ml，再次計數(shù)，使用前用超聲震蕩攪勻儀使微栓塞球混合均勻。

1.2 CME 模型建立［4］

12周齡小型豬（雌雄不拘），體重21～25 kg，肌注氯安酮和苯二氮 誘導(dǎo)麻醉后，給予戊巴比妥靜脈維持麻醉，分離右側(cè)股動脈，置入7 F動脈鞘，經(jīng)鞘管給予肝素200 U/kg 以達(dá)到肝素化，此后每延長1 h靜脈注射肝素100 U/kg維持肝素化。然后血管造影（DSA，GE INNOVA 2000）行冠狀動脈造影，送入微導(dǎo)管（3.0/2.8 F ，科迪斯公司）于左前降支（LAD）中段（發(fā)出第一對角支）處，經(jīng)微導(dǎo)管在40 min內(nèi)注入42 μm的微栓塞球45 ml（假手術(shù)組注射等量生理鹽水），再用10 ml生理鹽水沖洗微導(dǎo)管并注入冠狀動脈內(nèi)。

1.3 實驗分組與處理

共15頭小豬，每組5頭。分為假手術(shù)組、CME組、CME+左西孟旦組。CME+左西孟旦組在CME建立前用左西孟旦預(yù)處理，全麻下從耳緣靜脈以0.05 μg/（kg · min）使用 24 h，術(shù)前 60 min 再以0.2 μg/（kg · min）負(fù)荷使用。

1.4 心臟功能測定

所有實驗動物均采用Philips sonos7500型超聲心動圖儀，探頭頻率10 MHz，檢測各組小型豬左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、心排血量（CO）及左心室短軸縮短率（FS）。所有測量指標(biāo)均取三個心動周期的平均值為最終結(jié)果。

1.5 心肌梗死面積測量

蘇木素堿性苦味酸染色（HE染色）是診斷早期心肌缺血壞死的一種重要染色方式，缺血心肌呈紅染，正常心肌細(xì)胞胞漿黃染、胞核藍(lán)染。心肌缺血壞死面積采用DMR+Q550 病理圖像分析儀測定，每張HBFP染色切片隨機選取5個視野（×100倍），使用Leica Qwin分析軟件平面法測量梗死區(qū)域，表示為總分析切片的面積百分比，取平均值［4］。

1.6 以Western-blot檢測心肌組織中TNF-α

檢測促凋亡蛋白TNF-α的表達(dá)。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗心肌組織兩次，勻漿，在4℃以下12000 r/min離心15 min提取心肌組織總蛋白；以95℃10 min，每份標(biāo)本取20 μg蛋白于12%分離膠和5%濃縮膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳；蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；室溫下5%牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，HRP標(biāo)志二抗按l ∶ 2000稀釋室溫下孵育1 h，采用目標(biāo)條帶的積分吸光度值經(jīng)actin校正后（美國Bio-Rad公司，Gel Doc 2000凝膠圖像）用專用軟件分析，TNF-α的活化產(chǎn)物IA值/actin IA值表示其相對活化水平。

1.7 以ELISA法測定血清超敏C-反應(yīng)蛋白（HsCRP）、TNF-α 濃度

按照說明書操作采用ELISA法測定血清HsCRP、TNF-α 濃度。

1.8 心肌損傷標(biāo)記物測定

cTnI測定采用免疫化學(xué)發(fā)光法測定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以（-x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組實驗動物心功能指標(biāo)比較

CME 組術(shù)后 12 h FS［（24.49±2.86）%比（41.28±2.86） %，P=0.023］、LVEF［（49.83±4.64） % 比（66.86±3.97） %，P=0.035］、CO［（2.58±0.42） L/min比（4.32±0.89） L/min，P=0.042］與假手術(shù)組比較均顯著下降，而 LVEDd［（38.26±1.93） mm 比（32.39±1.52） mm，P=0.043］比假手術(shù)組顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。CME+ 左西孟旦組 FS［（32.42±3.98） %比（24.49±2.86） %，P=0.029］、LVEF［（58.42±5.28） %比（49.83±4.64） %，P=0.043］、CO［（3.58±0.92） L/min 比（2.58±0.42） L/min，P=0.038］與 CME 組比較均呈現(xiàn)升高趨勢，LVEDd ［（33.92±1.56） mm比（38.26±1.93） mm，P=0.037］比CME 組呈現(xiàn)降低趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 冠狀動脈微栓塞術(shù)后12 h各組實驗動物心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 冠狀動脈微栓塞術(shù)后12 h各組實驗動物心功能指標(biāo)比較（±s）

注：a，與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b，與CME組比較，P＜0.05；LVEF，左心室射血分?jǐn)?shù)；FS，左心室短軸縮短率；LVEDd，左心室舒張末期內(nèi)徑；CO，心排血量

項目 假手術(shù)組（n=5）CME組（n=5）CME+左西孟旦組（n=5）LVEF （%）66.86±3.97 49.83±4.64a 58.42±5.28ab FS （%）41.28±2.8624.49±2.86a 32.42±3.98ab LVEDd （mm）32.39±1.5238.26±1.93a33.92±1.56b CO （L/min） 4.32±0.89 2.58±0.42a 3.58±0.92ab

2.2 各組實驗動物心肌損傷標(biāo)志物比較

CME 組與假手術(shù)組比較，術(shù)后12 h 肌鈣蛋白 明顯升高［（0.229±0.038）ng/ml 比（0.049±0.009）ng/ml，P=0.025］。CME+ 左 西 孟 旦 組與CME 組比較，肌鈣蛋白 明顯下降［（0.128±0.029）ng/ml比 （0.229±0.038）ng/ml，P=0.048］。

2.3 各組實驗動物血清炎癥指標(biāo)比較

CME 組 術(shù) 后 12 h 血 清 HsCRP［（15.68±8.62）mg/ L 比（3.58±1.68）mg/ L，P=0.018］、TNF-α 濃 度［（82.58±20.35）ng/ L 比（23.65±12.68）ng/ L，P=0.027］均明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。CME+左西孟旦組HsCRP［（7.25±2.98）mg/L 比（15.68±8.62）mg/ L，P=0.038］、TNF-α 濃度［（42.68±18.95）ng/ L 比（82.58±20.35）ng/ L，P=0.029］ 均明顯 低于CME 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 CME 病理學(xué)改變

HE 染色顯示微梗死灶內(nèi)心肌細(xì)胞核消失或溶解，細(xì)胞胞漿呈紅染，梗死灶周邊細(xì)胞變性、水腫，周圍炎性細(xì)胞大量浸潤及紅細(xì)胞滲出（圖1）。HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組未見明顯心肌微梗死灶；CME組和CME+左西孟旦組均可見多處心肌微梗死灶，呈局灶性分布，非透壁性，以內(nèi)膜下和左心室多見（圖2）。CME+左西孟旦組梗死面積占比明顯低于CME組［（6.658±2.897）%比（9.986±3.542）%，P=0.036］。

2.5 心肌組織TNF-α蛋白的表達(dá)

Western blot 定量分析顯示，CME 組與假手術(shù)組比較心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)水平較高（P=0.039）；CME+左西孟旦組與CME 組比較，心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)水平較低（P=0.042），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

3 討論

CME是急性冠狀動脈綜合征及介入治療圍術(shù)期常見并發(fā)癥，主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導(dǎo)致［1］。研究顯示，CME發(fā)生與冠狀動脈無復(fù)流或慢血流存在直接相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及近、遠(yuǎn)期心功能明顯下降，即使心外膜血流恢復(fù)正常，心功能依然進(jìn)行性下降［2］；一旦患者發(fā)生CME后，藥物及器械相關(guān)保護措施均不能改善其近期和遠(yuǎn)期臨床預(yù)后［3］。有動物實驗發(fā)現(xiàn)，在犬的冠狀動脈內(nèi)注入微栓塞球，犬的冠狀動脈血流短暫減少后即刻可恢復(fù)正常，但心肌的收縮功能呈現(xiàn)進(jìn)行性下降現(xiàn)象，表明CME致心肌損傷的機制并非由心外膜血管血流減少所決定［13］。另有動物實驗發(fā)現(xiàn)，微栓塞所致壞死心肌的面積占總心肌面積不到5%，微栓塞所致心肌細(xì)胞壞死不足以完全解釋心肌收縮功能障礙［14］。本研究表明，動物CME模型建立后，心肌缺血壞死面積占比很少，但是心臟功能明顯受到損傷，與既往研究結(jié)果一致。

圖1 冠狀動脈微栓塞后心肌微梗死區(qū)域HE染色（×200） A.CME術(shù)后12 h微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動脈內(nèi)的微栓塞球）；B.CME+左西孟旦組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動脈內(nèi)的微栓塞球），梗死程度及炎癥浸潤幅度明顯少于CME組

圖2 冠狀動脈微栓塞后心肌微梗死區(qū)域HE染色（×100） A.假手術(shù)組心室前壁心肌組織未見明顯微梗死灶；B.CME術(shù)后12 h微梗死灶區(qū)域HE染色（箭頭示微梗死灶染成紅色）；C.CME+左西孟旦組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色（箭頭示微梗死灶染成紅色），梗死面積明顯少于CME組

圖3 Western blot 定量分析

既往研究表明，CME發(fā)生后心肌細(xì)胞TNF-α蛋白明顯升高，與心臟功能明顯相關(guān)，通過TNF-α抗體抑制TNF-α表達(dá)，心功能明顯改善，因此，證實TNF-α與CME所致心功能下降密切相關(guān)［15-16］。另有研究發(fā)現(xiàn)， CME發(fā)生后的缺血心肌組織細(xì)胞中，TNF-α表達(dá)顯著升高并伴有白細(xì)胞浸潤，使用TNF-α抗體和糖皮質(zhì)激素抗炎可防治CME導(dǎo)致的心功能不全，進(jìn)一步證實了CME致心功能不全發(fā)生機制與TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［17］。本研究表明，CME發(fā)生后，在微梗死灶周圍，發(fā)現(xiàn)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，證實其中的機制可能是CME誘發(fā)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，增加心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及收縮功能惡化。

左西孟丹作為一類新型的強心藥物，目前適用于傳統(tǒng)抗心力衰竭治療（如利尿藥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥及洋地黃類）療效不佳，并且需要增加心肌收縮力的急性失代償心力衰竭的短期治療。左西孟丹目前已發(fā)展成在急性心力衰竭或其他心源性需要使用強心藥物時的理想選擇。另外，左西孟旦能夠增加心臟收縮功能而不增加心臟耗能，有改善心室-血管收縮耦合，改善外周血管舒張，增加組織灌注，抗心肌頓抑及抗炎癥反應(yīng)作用［18］。近年來大量研究證實，左西孟丹在多種組織中能夠抑制促炎癥反應(yīng)因子TNF-α的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用［11-12］。Grossini等［11］研究發(fā)現(xiàn)，左西孟旦能夠通過抑制炎癥改善豬急性再灌注肝損傷。Paraskevaidis等［12］研究顯示，左西孟旦能夠通過抑制心肌炎癥及凋亡，改善慢性心力衰竭患者長期預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，左西孟旦預(yù)處理能夠明顯抑制促炎因子TNF-α活化，降低心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善心臟功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后12 h，心肌組織促炎因子TNF-α明顯增高，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)顯著增加，心臟功能明顯下降；然而，通過左西孟旦預(yù)處理，能夠明顯抑制促炎因子TNF-α表達(dá)，降低心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善心臟功能。左西孟旦防治CME致心肌損傷的分子和效應(yīng)機制，為CME所致心肌損傷的防治提供新穎的策略；為未來在PCI圍術(shù)期使用左西孟旦降低心肌損傷，改善心功能及長期預(yù)后提供理論依據(jù)。