錳脅迫對甜菜幼苗光合色素含量及碳氮代謝相關(guān)酶活性的影響

吳旭紅，張 超

（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

錳作為植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素，由于其直接參與水的光解和電子傳遞，并可在葉綠體中與蛋白質(zhì)結(jié)合形成酶蛋白，因此在光合作用中發(fā)揮重要功能；同時錳是多種酶的活化劑，起調(diào)節(jié)植物體內(nèi)氧化還原狀況，促進(jìn)種子萌發(fā)、幼苗生長及刺激代謝等多方面的作用。另一方面，隨著錳在很多工業(yè)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，促使硫酸錳生產(chǎn)工業(yè)迅速發(fā)展，產(chǎn)生的硫酸錳渣也日益增多，錳渣的滲濾液可以進(jìn)入土壤環(huán)境而帶來污染。除重金屬的開采、提煉等污染源外，不合理的灌溉、其它工業(yè)污染物的排放、大量酸性和生理酸性肥料的施用，都加劇了土壤酸化。pH值的降低，可以促使土壤中錳的釋放。pH5.0左右，土壤中可給態(tài)錳的含量大幅提高，會造成其他營養(yǎng)元素如鐵和鈣的吸收障礙[1]。鑒于在酸性條件下作物錳毒害經(jīng)常發(fā)生，因而已有一些關(guān)于錳毒的研究報道，受高錳灌溉的水稻，孕穗期會發(fā)生黑根、死苗、減產(chǎn)20%～30%；在高錳土壤中生長的菠蘿，由于吸收過量錳，造成體內(nèi)多種酶系統(tǒng)及功能組織的損傷，從而影響其生長發(fā)育[2-4]。甜菜作為大面積栽培的經(jīng)濟作物，錳污染的研究未見報道。本試驗主要針對硫酸錳污染對甜菜幼苗的早期碳、氮代謝的生理響應(yīng)進(jìn)行研究，對光合色素含量及碳氮代謝相關(guān)酶活性及其相互關(guān)系進(jìn)行了探討，對不同基因型的甜菜不同強度、不同劑量的錳毒的敏感性和耐受性做出初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為KWS9419和甜單301甜菜種子，由齊齊哈爾市種子公司提供。

取2種甜菜種子，分別用70%的酒精消毒1min及5%的次氯酸鈣溶液浸泡2h后，用無菌水沖洗干凈，再用無菌水浸泡10h，之后將處理過的種子播于細(xì)砂經(jīng)清水浸泡1h，高溫滅菌（130℃，3h）定量稱重的花盆中（50粒/盆），于人工氣候培養(yǎng)箱中（25℃/20℃±1℃，光照13h、黑暗11h循環(huán)，相對濕度70%～80%）控制培養(yǎng)。待子葉展平時，用1/2Hongland營養(yǎng)液澆灌，3d后換成全營養(yǎng)液。當(dāng)兩對真葉完全展開時（苗期），將預(yù)先配制的含0、0.2、0.5、0.8 mmol/L MnSO4的 Hongland 營養(yǎng)液調(diào)至 pH 5.5，于每天 8：00—9：00 進(jìn)行處理，每盆用 200mL 含相應(yīng)濃度的錳營養(yǎng)液分2次澆透，每隔3d處理1次，次日8：00—9：00時稱重，測定每盆失水量后以水補足，分別于處理后的3d、6d、9d和12d取全展的功能葉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 生理生化指標(biāo)的測定

取 0.5g 幼葉，于 5mL 由 Tris-HCl（50mmol/L pH 8.0）、甘油（12.5%v/v）和巰基乙醇（5%v/v）組成的介質(zhì)中制備勻漿，離心20min（15000r/min），上清液用來測定Rubisco的含量。Rubisco含量及蛋白水解酶活性參照Makino的方法測定[5]；NR和GS測定采用李彩鳳的方法[6]；光合色素含量的測定參照《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》[7]。

2 結(jié)果

2.1 錳污染對甜菜幼苗葉片光合色素含量的影響

錳污染明顯影響甜菜葉片光合色素含量。表1中可以看出，KWS9419和甜單301幼苗在0.2mmol/L錳脅迫濃度時，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)高于對照，此后隨脅迫程度加強而下降的趨勢。特別是甜單301，最高錳脅迫處理的葉綠素含量比對照減少了42.11%，類胡蘿卜素含量比對照減少了57.27%，說明錳污染對葉綠素含量有負(fù)面影響。從光合色素種類比較，葉綠素a和類胡蘿卜素降幅較大，0.5mmol/L錳脅迫處理，KWS9419的葉綠素a比對照下降28.06%、類胡蘿卜素降幅為11.34%，而葉綠素b比對照高出6.5%；最高錳處理時，則分別比對照降低46.87%、31.09%，而葉綠素b僅有小幅（3.36%）下降。甜單301錳污染對葉綠體色素的破壞程度分別為，中等強度脅迫（0.5mmol/L）葉綠素a比對照下降46.31%、類胡蘿卜素降幅為19.38%，葉綠素b比對照低7.66%；最高錳處理時，則分別比對照降低51.86%、57.27%，葉綠素b比對照下降12.91%。品種間比較，KWS9419除對照外，在對應(yīng)的各處理濃度下，葉綠素a、b和葉綠素a+b及類胡蘿卜素含量都高于甜單301。隨處理濃度加大，各指標(biāo)含量降幅低于甜單301。類胡蘿卜素既是光合色素，又是內(nèi)源性抗氧化劑，可以淬滅活性氧而防止膜過氧化[3]。高錳脅迫下，2種甜菜幼苗類胡蘿卜素含量均顯著降低，但KWS9419降幅小，說明類胡蘿卜素有效發(fā)揮了抗氧化作用。2種甜菜幼苗葉綠素a/b變化趨勢相同，均隨錳污染強度的加大而減小。中錳污染時，甜單301的葉綠素a/b有一個驟降，此后與KWS9419維持相同水平。葉綠素a/b值的逐漸降低，說明錳污染加速了植物葉片的衰老進(jìn)程；也說明KWS9419在色素方面耐受性更強，有較強的光保護(hù)能力。

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2.2 不同濃度錳污染對甜菜幼苗葉片Rubisco含量和蛋白水解酶活性的影響

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶Rubisco既參與植物的光合作用又參與光呼吸過程，是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵酶。Rubisco含量的高低直接影響植物的凈光合產(chǎn)量。圖1顯示，除0.2mmol/L錳處理的KWS9419葉片Rubisco含量有一個小幅上升外，兩個甜菜品種Rubisco含量均隨錳污染濃度的加大和處理時間的延長呈下降趨勢。品種間比較，0.2mmol/L及0.5mmol/L錳處理6d時，KWS9419和甜單301 Rubisco含量都維持在相對較高的水平，且變幅較小，各處理之間差異不顯著；0.8mmol/L錳處理，則分別降至對照的86.73%和75.89%；處理達(dá)到12d時，兩個品種Rubisco含量均呈現(xiàn)較大幅度下降。0.2mmol/L錳處理與對照比差異不顯著，但相對中等強度 （0.5mmol/L）錳處理，KWS9419和甜單301 Rubisco含量分別降至對照的84.49%和64.60%；高強度（0.8mmol/L）錳污染，甜單301 Rubisco含量已經(jīng)比對照降低了44.89%，達(dá)到相同處理強度的KWS9419 Rubisco含量的81.18%。品種之間和污染強度之間均呈顯著差異。兩個品種在高錳污染下Rubisco含量的變化趨勢相同，但甜單301在中度和重度錳脅迫下，Rubisco含量陡然下降，降幅比KWS9419大。

從總趨勢上看（見圖2），蛋白水解酶活性隨錳污染強度的增加和時間的延長明顯上升。6d錳污染處理時，0.2mmol/L和0.5mmol/L脅迫濃度之間蛋白水解酶活性差異不顯著，品種之間蛋白水解酶活性也未達(dá)差異顯著水平，但高錳處理下兩品種與中度及重度錳污染處理濃度之間均達(dá)差異顯著水平，但品種之間差異不顯著。錳污染達(dá)12d時，中等強度處理KWS9419蛋白水解酶活性是對照的1.23倍，甜單301已達(dá)對照的1.84倍；高錳處理時，兩品種酶活性分別是對照的1.44倍和2.12倍。由此可見，甜單301比KWS9419蛋白水解酶活性上升速度快、增幅高。對比圖1、圖2在現(xiàn)有錳污染劑量和時間條件下，Rubisco含量和蛋白水解酶活性之間存在一定的相關(guān)性，經(jīng)統(tǒng)計分析表明，蛋白水解酶活性隨Rubisco含量的降低而升高，兩者之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r2=0.9381，y=-158.26x+882.9。

2.3 錳污染對甜菜幼苗葉片NR活性的影響

NR是一種黃素蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中，與存在于葉綠體中的亞硝酸還原酶共同作用，將NO3-還原為NH4+，是植物氮素代謝中的關(guān)鍵酶。從功能葉片NR活性變化規(guī)律來看，較低濃度錳污染（0.2mmol/L），KWS9419和甜單301的NR活性都有不同程度的增加，尤其是甜單301，處理9d和12d時，NR活性分別是對照的1.79倍、1.64倍，而KWS9419 NR活性分別是對照的1.55倍、1.58倍，各時點的測定值都低于甜單301。中度污染強度下，兩品種的NR活性呈先升后降的趨勢，除第3d外，KWS9419的NR活性都高于甜單301。高錳處理，隨污染時間的延長，NR活性明顯下降。品種間比較，處理3d時，NR活性品種間差異不顯著。隨處理時間加長，甜單301的NR活力急劇下降，9～12d時，分別比KWS9419降低了32.97%和24.48%，已達(dá)對照的59.0%和51.43%。處理與對照之間及兩品種之間達(dá)到差異顯著水平。這說明較低濃度和中等強度短時錳污染，有提高NR活力、刺激甜菜前期氮代謝的作用，隨污染劑量加大和時間延長，有抑制NR活力的作用；同時也表現(xiàn)出不同甜菜品種對高錳污染的耐受性差異。

2.4 不同濃度錳污染對甜菜幼苗葉片GS活力的影響

在葉綠體中發(fā)生的由GS和GOGAT構(gòu)成的GS-GOGAT途徑是高等植物將氨同化為有機氮化物的重要途徑。功能葉片GS活性動態(tài)變化顯示（圖5～6），較低濃度的錳，對酶活刺激效應(yīng)明顯，甜單301在0.2mmol/L錳處理3d和9d時，分別比對照高56.52%和54.54%，是KWS9419的1.86倍和1.73倍，說明甜單301對環(huán)境錳的敏感性較KWS9419強。隨處理濃度加大，抑制效應(yīng)顯現(xiàn)，兩品種GS均呈下降態(tài)勢，但兩品種的變化趨勢有所不同。0.5mmol/L錳污染，KWS9419除處理第12d的GS低于對照外，其余處理均高于對照；而甜單301除處理第3d的GS高于KWS9419，其它各處理GS活性均低于KWS9419。KWS9419在0.8mmol/L錳處理9～12d時低于對照，而甜單301各處理均顯著低于對照，且6～12d處理的GS維持在相對穩(wěn)定的較低水平，動態(tài)變幅縮小。高錳處理9～12d，甜單301的GS活性已降至KWS9419的57.78%和60.60%。顯示甜單301對錳脅迫的耐受性較KWS9419低。中等和重度錳污染，兩品種GS活力達(dá)差異顯著水平。

3 討論

錳作為植物必需的微量營養(yǎng)元素，在生長發(fā)育中起著不可替代的作用，其缺乏和過量都會對植物產(chǎn)生顯著影響[8]。本試驗研究表明，中度尤其在重度錳污染條件下，甜菜幼苗期葉片中光合色素含量呈顯著下降趨勢。葉綠素含量降低與合成葉綠素所需的酶受重金屬破壞有關(guān)[9]，錳作為重金屬離子，當(dāng)被甜菜吸收和隨時間累積到一定程度，會誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而加速膜脂過氧化作用。膜脂過氧化作用中產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，它能連續(xù)誘發(fā)脂質(zhì)的過氧化作用，且又可以使蛋白質(zhì)脫氫而產(chǎn)生蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生鏈?zhǔn)骄酆希瑥亩辜?xì)胞膜變性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。錳污染使甜菜幼苗期葉片中光合色素含量降低的可能原因就是在逆境條件下體內(nèi)自由基累積，加劇了葉綠體膜脂過氧化，使葉綠體膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞；此外，錳逆境脅迫在細(xì)胞內(nèi)的累積，可能作用于葉綠體色素合成過程中-SH基酶的活性巰基，從而抑制其酶活性。2品種甜菜幼苗葉綠素a/b變化趨勢表明，錳污染加速了植物葉片的衰老進(jìn)程。

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）既可催化羧化反應(yīng)，又可以催化加氧反應(yīng)，是催化光化學(xué)合成和光呼吸早期反應(yīng)的關(guān)鍵酶。光呼吸是植物的綠色細(xì)胞在光照下吸收氧氣釋放CO2的反應(yīng)，這種反應(yīng)需葉綠體參與，在大氣中，光呼吸與光合作用同時進(jìn)行、伴隨發(fā)生，CO2和O2競爭Rubisco同一個結(jié)合位點，光合作用可為光呼吸提供O2，而光呼吸釋放的CO2又可作為光合作用的底物。通過在不同甜菜品種幼苗中測定錳污染對Rubisco含量的影響，發(fā)現(xiàn)伴隨著葉綠體色素含量的下降，出現(xiàn)了Rubisco的同步降解。說明在錳逆境下，光合放氧的加氧反應(yīng)和光呼吸釋放CO2的羧化反應(yīng)均受到不同程度的抑制。同時也與在逆境脅迫下，ROS含量的增加可以誘發(fā)Rubisco的降解有關(guān)。

在甜菜的發(fā)育過程中，碳、氮代謝相互協(xié)調(diào)決定甜菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。在生育前期主要以氮代謝為主，中期兩者并重，后期主要以碳代謝為主[10]。通過錳處理對甜菜蛋白水解酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在甜菜兩個品種幼苗中呈現(xiàn)相似的趨勢；并且隨Rubisco的降低，蛋白水解酶活性升高。這說明由于在錳逆境下Rubisco的降低、葉綠體色素合成的受阻，光合碳同化能力下降，可能造成甜菜早期分化和發(fā)育的物質(zhì)和能量不足以滿足器官建成和代謝的需要，而強烈誘導(dǎo)蛋白水解酶基因的表達(dá)，使蛋白水解酶活性大幅提高。其結(jié)果不僅加速了原有組織蛋白的大量分解，還可造成保護(hù)酶系統(tǒng)的破壞和抗逆境蛋白的減少，從而影響抗性基因的表達(dá)。其機理有待進(jìn)一步研究。

硝酸還原酶（NR）是植物體內(nèi)重要的誘導(dǎo)酶，是氧化態(tài)氮形成還原態(tài)氮的轉(zhuǎn)化酶，酶活性的高低與其對土壤中無機氮的利用密切相關(guān)。谷氨酰胺合成酶（GS）是參與氨同化過程的關(guān)鍵酶。兩者對于甜菜的早期氮代謝起重要作用，直接影響苗期發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明，錳污染尤其是重度污染大幅度降低了兩個甜菜品種的NR和GS活性，抑制了對土壤中硝酸鹽的利用和氨的進(jìn)一步同化。但較低濃度和中等強度短時錳污染，有提高NR活力、刺激甜菜前期氮代謝的作用，隨污染劑量加大和時間延長，有抑制NR活力的作用。從光合色素含量和碳、氮代謝相關(guān)酶活性變化趨勢可見，不同甜菜品種對高錳污染的耐受性有差異，0.2mmol/L錳脅迫濃度，甜單301比KWS9419光合色素含量的增加和NR、GS活性的刺激效應(yīng)明顯，但在中度和重度錳污染下，上述指標(biāo)均大幅下降，兩品種已達(dá)差異顯著水平（p＜0.05）。說明甜單301對錳的敏感性高于KWS9419，而KWS9419對錳的耐受性優(yōu)于甜單301。

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