甜菜抗氧化性的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究

張婷婷 ，許慶軒 ，孫 暉 ，周 芹 ，吳玉梅

（1.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，哈爾濱150080；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040）

植物提取液抗氧化能力的測定方法很多，其原理總結(jié)起來主要為兩種方式[1]，其一，通過測定樣品抑制脂類物質(zhì)氧化的能力來評定被測物的抗氧化能力；其二，用樣品對人工生成的自由基的清除能力來反映待測物的抗氧化活性。植物中具有抗氧化活性的成分主要有黃酮類、多酚類、維生素類、皂苷類、生物堿類和糖類化合物[2]。由此可以看出，具有抗氧化活性的化合物一般需要含有還原性的官能團(tuán)，使其能夠和氧化劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)；其次要含有使自由基穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，也就是分子中含有共軛體系，有利于其與自由基結(jié)合，從而消除自由基。目前測定抗氧化能力的方法均從宏觀角度檢測植物總提取液的抗氧化性，如果要知道是哪種成分起作用，就需要通過大量提取分離工作，得到單一的化合物，再對這些純化合物進(jìn)行抗氧化性測定。由于植物成分十分復(fù)雜，提取分離工作十分艱巨，并且一些低含量的成分很可能在提取分離過程中損失，采用這種方法常常效果不佳。因此尋找一種快速、簡便的方法對復(fù)雜體系的抗氧化性進(jìn)行研究十分必要。

電噴霧質(zhì)譜可以不經(jīng)過復(fù)雜的前處理就可以對植物提取液直接分析。由于電噴霧電離是軟電離技術(shù)，在電離的過程中沒有碎片產(chǎn)生，每個(gè)峰代表一種化合物，可以同時(shí)檢測提取液中多個(gè)化合物。電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜能夠給出每個(gè)離子的碎片，從而提供了豐富的結(jié)構(gòu)信息[3-6]。與電子轟擊電離方式不同，電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜碰撞能量比較小，一般僅從雜原子處斷裂失去取代基。我們可以利用這一點(diǎn)探索復(fù)雜體系中各種化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即使不能確定這些化合物的結(jié)構(gòu)，也可以通過其所含的取代基推測其抗氧化性。

糖用甜菜的研究主要集中在制糖方面，對其抗氧化性質(zhì)研究比較少。Marijana B.Sakac及其合作者對甜菜渣的抗氧化能力進(jìn)行了系統(tǒng)研究[7]，實(shí)驗(yàn)表明甜菜渣的乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。我們測定了糖甜菜的水提取液和乙醇提取液對DPPH自由基的清除率，發(fā)現(xiàn)其水提取液和乙醇提取液均具有抗氧化性[8]。本文采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜探討糖甜菜的提取液中各種化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，并且將這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與抗氧化性能結(jié)合起來，開創(chuàng)一種研究復(fù)雜體系抗氧化性簡單有效的新方法。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糖甜菜塊根，栽培品種，由中國農(nóng)科院甜菜研究所提供。

1.2 儀器與試劑

儀器設(shè)備：電噴霧質(zhì)譜儀為ThermoFisher LCQ fleet（Thermo Fisher Scientific公司），氦氣為緩沖氣和碰撞氣，使用電噴霧源，正離子模式。 儀器條件優(yōu)化如下，鞘氣（sheath gas，氮?dú)猓┝魉伲?0arbitrary units；噴霧電壓（ion spray voltage）：4.0kV；毛細(xì)管溫度（capillary temperature）：180℃；毛細(xì)管電壓（capillary voltage）：44V；套管透鏡補(bǔ)償電壓（tube lens offset）：50V；注射泵（syringe pump）進(jìn)樣，進(jìn)樣速度為 5μL/min；碰撞能量20%～30%。

主要試劑為甲醇（色譜級，迪馬公司），蒸餾水，乙醇（分析純）。

1.3 糖甜菜的電噴霧質(zhì)譜研究

1.3.1 樣品制備 取糖甜菜鮮樣使用鋸糊機(jī)制成糊狀，分別稱取5g，分別用50mL水和乙醇超聲提取20min，過濾后即得糖甜菜的水和乙醇提取液。

1.3.2 糖甜菜水提取液和乙醇提取液的電噴霧質(zhì)譜研究 分別取糖甜菜的水和乙醇提取液適量，用甲醇稀釋2倍，用0.45μm微孔濾膜過濾。將此溶液直接用于電噴霧質(zhì)譜正離子和負(fù)離子模式檢測，注射泵流速5μL/min。

1.3.3 糖甜菜水提取液和乙醇提取液的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究 根據(jù)1.3.2電噴霧一級質(zhì)譜中產(chǎn)生離子進(jìn)一步進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究，優(yōu)化碰撞能量，以譜圖中母離子存在的前提下使子離子的豐度最強(qiáng)為最佳狀態(tài)，碰撞能量為20%～30%。

2 結(jié)果與討論

由于糖甜菜水提液的電噴霧質(zhì)譜與乙醇提取液的電噴霧質(zhì)譜中所出現(xiàn)的峰質(zhì)荷比相同，只是強(qiáng)度有差別，本研究不涉及定量，因此只以糖甜菜水提取液為研究對象。圖1是糖甜菜水提取液的正離子、負(fù)離子電噴霧全掃描圖。正離子譜圖中出現(xiàn)的m/z 118、156、235離子是甜菜堿加H、K峰，及其二聚物的加H峰。另外，m/z381、365、292峰也有很強(qiáng)的豐度。與正離子譜相比，負(fù)離子譜圖比較簡單，只有m/z341、m/z555和m/z683峰比較強(qiáng)。其中m/z683離子是m/z341離子二聚體，都是蔗糖分子電離所產(chǎn)生的離子。另外，正譜中的m/z365離子和m/z381離子也是蔗糖分子的電離產(chǎn)物，正譜中的m/z365離子為其加鈉離子，m/z381離子是其加鉀離子，蔗糖在電噴霧質(zhì)譜中的表現(xiàn)行為與其含有多個(gè)羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是吻合的。由此可見甜菜提取液的主要成分為甜菜堿和蔗糖，另外還含有一些未知成分。

圖1 糖甜菜水提取液的ESI-MS（a.正離子模式；b.負(fù)離子模式）

為了驗(yàn)證上述推理，對m/z341、365、381這3種離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜研究，如圖2、3、4所示。m/z341離子（圖2）的子離子主要是m/z179和m/z161分別為[葡萄糖或果糖-H]-和[葡萄糖果糖-H2O-H]-。質(zhì)譜給出的都是質(zhì)量數(shù)，對于分子量相同的化合物無法區(qū)分，因此無法說明這兩個(gè)子離子是來自葡萄糖還是果糖，但是在自然界中，尤其對于甜菜，這種二聚糖可以確定為蔗糖。m/z365離子（圖3）的子離子主要是m/z203和m/z185，分別為[葡萄糖或果糖+Na]+和[葡萄糖果糖-H2O+Na]+。m/z381離子（圖4）的子離子主要是m/z219和m/z201離子，分別為[葡萄糖或果糖+K]+和[葡萄糖果糖-H2O+K]+。

除了以上討論的可以解析出結(jié)構(gòu)的化合物，還有一些未知結(jié)構(gòu)的化合物，這些化合物在電噴霧正離子模式下表現(xiàn)為m/z482、292、104和175離子，在電噴霧負(fù)離子模式下表現(xiàn)為m/z555。盡管使用電噴霧質(zhì)譜解決未知化合物的結(jié)構(gòu)十分困難，但是電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜圖比較簡單，便于解析，并且能夠給出多級串聯(lián)質(zhì)譜，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。通過這些信息，我們可以知道這些化合物的大致結(jié)構(gòu)或含有哪些取代基，通過這些取代基可以初步推斷這些化合物的抗氧化性能。這里僅以正離子譜中m/z292和m/z555為例，說明串聯(lián)質(zhì)譜在解釋未知化合物中的應(yīng)用。m/z292在串聯(lián)質(zhì)譜中產(chǎn)生兩個(gè)子離子分別為m/z118和175（如圖5），這兩個(gè)離子在一級譜圖（圖1a）中也存在，說明這個(gè)化合物是由甜菜堿和質(zhì)量數(shù)為174的化合物結(jié)合而成，再對m/z175進(jìn)行三級串聯(lián)質(zhì)譜（譜圖略），發(fā)現(xiàn)丟失18、44Da的碎片，分別對應(yīng)H2O、CO2，說明結(jié)構(gòu)中含有羥基和羧基。m/z555離子在串聯(lián)質(zhì)譜中能夠失去162、180Da的碎片，說明此化合物結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)葡萄糖基。另外m/z104的串聯(lián)質(zhì)譜也產(chǎn)生18、44Da的碎片（譜圖略）。

圖4 m/z381離子的ESI-MS2（正離子模式）

圖5 m/z292離子的ESI-MS2（正離子模式）

圖6 m/z555離子的ESI-MS2（負(fù)離子模式）

3 結(jié)論

從以上討論可知，糖甜菜水提取液主要含有甜菜堿和蔗糖，其它未知的化合物分子結(jié)構(gòu)也含有甜菜堿、葡萄糖基、羥基和羧基。葡萄糖中含有多個(gè)羥基和1個(gè)羰基，具有很高的還原性，具有很好的抗氧化功能。羧基雖然沒還原性，但是它能夠提供共軛體系，使自由基體系的穩(wěn)定增強(qiáng)，為化合物的抗氧化性能提供條件。通過電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對糖甜菜水提取液的研究，可以得知其中的化學(xué)成分均具有抗氧化性，這與DPPH法檢測的結(jié)果一致，說明使用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法研究糖甜菜的抗氧化性十分可靠，可以作為復(fù)雜體系抗氧化性能快速篩選方法。

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