順鉑聯(lián)合他莫昔芬對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞增殖及凋亡的影響

王成雙 佐滿珍

1青島市中心醫(yī)院，青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤婦科（山東青島 266042）；2宜昌市第一人民醫(yī)院，三峽大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（湖北宜昌 443000）

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其病死率占各類(lèi)婦科腫瘤之首，且有逐年增加的趨勢(shì)［1］。大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷即為晚期，2009年FIGO分期Ⅲ期或Ⅳ期的患者5年生存率分別為28%和16%［2］。目前腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合輔助化療依然是治療卵巢癌的重要手段，而順鉑和卡鉑等鉑類(lèi)藥物是目前卵巢癌一線化療的抗腫瘤藥物，其細(xì)胞毒性作用主要通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，導(dǎo)致其鏈內(nèi)和鏈間交叉聯(lián)結(jié)，繼而使單鏈或雙鏈DNA斷裂，這種DNA損傷在無(wú)法修復(fù)的情況下可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。鉑類(lèi)藥物還可引起線粒體損傷，降低ATP酶活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。多種因素參與了卵巢癌的發(fā)生［4-5］，研究證實(shí)，雌激素受體表達(dá)增加會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并對(duì)化療產(chǎn)生耐藥［6-7］。

順鉑（DDP）具有廣泛的抗腫瘤譜，在耐鉑類(lèi)藥物的卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)雌激素受體表達(dá)顯著增加，提示其可能與鉑類(lèi)藥物耐藥有關(guān)［8］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是經(jīng)典的雌激素受體拮抗劑，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，用他莫昔芬處理乳腺癌細(xì)胞，可發(fā)生細(xì)胞漿濃縮、染色質(zhì)凝聚、DNA斷裂等形態(tài)學(xué)改變。DDP聯(lián)合TAM對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用目前研究較少，本課題研究了DDP聯(lián)合TAM對(duì)A2780細(xì)胞增殖抑制、凋亡、細(xì)胞周期的影響，以期為基礎(chǔ)和臨床研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 人卵巢癌A2780細(xì)胞株由華中科技大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院凍存?zhèn)鞔?7℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品、試劑 注射用順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司；枸櫞酸他莫昔芬（純度＞99.00%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；進(jìn)口胎牛血清購(gòu)自上海原創(chuàng)生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)、DMEM培養(yǎng)基、Annexin V/PI試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Gbico公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)DDP及TAM對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株A2780抑制率 實(shí)驗(yàn)分3個(gè)處理組：空白組（只含培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞及藥物處理）、對(duì)照組（正常培養(yǎng)細(xì)胞，但無(wú)藥物處理）及藥物組（正常培養(yǎng)細(xì)胞，并予以藥物處理）。胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，24 h后更換培養(yǎng)液，以DMEM培養(yǎng)液配制藥品，使DDP終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL；TAM終濃度分別為1× 10-6、1× 10-5、2.5× 10-5、5× 10-5、7.5× 10-5、2× 10-4mol/mL；取3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)（24、48、72 h），6復(fù)孔/組，培養(yǎng)后每孔加入20 μL濃度為50 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO避光震蕩10 min，待沉淀溶解后，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，各組取平均值。細(xì)胞抑制率（%）=1-藥物組OD/對(duì)照組OD×100%。根據(jù)半數(shù)抑制濃度計(jì)算軟件計(jì)算IC50。

1.2.2 Hoechst染色檢測(cè)A2780細(xì)胞凋亡 胰酶消化重懸對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A2780細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL。將蓋破片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞4×104個(gè)，培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞50%～80%融合。用藥物處理A2780后除去培養(yǎng)液，根據(jù)Hoechst 33258試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞周期 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780細(xì)胞，接種于25 mL2培養(yǎng)瓶中，每瓶4×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)融合至70%～80%，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，制備單細(xì)胞懸液，后按Annexin V/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，記錄細(xì)胞周期各時(shí)相百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)及組間兩兩比較采用LSD法；當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物濃度、不同作用時(shí)間時(shí)卵巢癌A2780細(xì)胞抑制率

2.1.1 不同藥物濃度DDP對(duì)A2780細(xì)胞的抑制率 以MTT法檢測(cè)不同藥物濃度DDP及在24、48、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)A2780細(xì)胞的抑制率，不同藥物濃度在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)A2780細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制存在差異，72 h的抑制率明顯高于24 h及48 h（P＜0.01），因此，以72 h濃度—抑制率曲線為標(biāo)準(zhǔn)，求得DDP的IC50為2.80 μg/mL。見(jiàn)圖1。

2.1.2 不同藥物濃度TAM對(duì)A2780細(xì)胞的抑制率 以MTT法檢測(cè)不同藥物濃度TAM在24、48、72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示，不同藥物濃度在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)卵巢癌A2780細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的抑制效果，其中，72 h的抑制率高于24 h及48 h（P＜0.05），因此，選擇72 h濃度—抑制率曲線為標(biāo)準(zhǔn)，求得TAM的IC50為2.25×10-5mol/L（12.69 μg/mL）。見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度、時(shí)間順鉑作用于卵巢癌A2780細(xì)胞抑制率Fig.1 Inhibition of different concentration and duration of DDP on A2780 cells′proliferation

圖2 不同濃度、時(shí)間他莫昔芬作用于卵巢癌A2780細(xì)胞抑制率Fig.2 Inhibition of different concentration and duration of TAM on A2780 cells′proliferation

2.2 DDP聯(lián)合TAM對(duì)A2780細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察（Hoechst染色×200） 與對(duì)照組相比，給藥組細(xì)胞出現(xiàn)胞漿濃縮，胞核致密濃縮，呈碎塊狀，顏色變白等形態(tài)學(xué)改變。于每幅圖中隨機(jī)選取5個(gè)視野，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給藥組存活細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1、圖3）。

圖3 順鉑聯(lián)合他莫昔芬對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察（Hoechst染色×200）Fig.3 Effect of DDP and TAM on cell apoptosis（Hoechst staining × 200）

表1 順鉑、他莫昔芬對(duì)細(xì)胞存活情況的影響Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

表1 順鉑、他莫昔芬對(duì)細(xì)胞存活情況的影響Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

注：A，順鉑組；B，他莫昔芬組；C，順鉑聯(lián)合他莫昔芬組；D，正常對(duì)照組。**P＜0.01，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，組間比較

組別 復(fù)孔A B C D 5 5 5 5細(xì)胞數(shù)目82.4±2.41**#88.6±4.93**#63.2±2.95**#193.8±5.63

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組處理對(duì)A2780細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，與對(duì)照組（4）相比，順鉑（A）及他莫昔芬（B）均使A2780細(xì)胞周期停滯于G0/G1期（P＜0.05，P＜0.01）（表2、圖4）。

3 討論

圖4 順鉑、他莫昔芬對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of DDP and Cinobufacini on cell cycle

表2 順鉑、他莫昔芬對(duì)細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

表2 順鉑、他莫昔芬對(duì)細(xì)胞周期的影響Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

注：A，順鉑組；B，他莫昔芬組；C，順鉑聯(lián)合他莫昔芬組；D，正常對(duì)照組。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別A B C D n 3 3 3 3 G0/G1期67.48±4.85*72.3±4.16**39.37±5.21**58.37±2.65 S期+G2/M期32.52±4.85*27.7±4.16**60.63±5.21**41.63±2.65

約70%的卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)即為晚期，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的手術(shù)分期或滿意的減瘤術(shù)及輔助化療，仍有70%的卵巢癌患者在2年內(nèi)復(fù)發(fā)［9-10］，復(fù)發(fā)性卵巢癌對(duì)鉑類(lèi)化療耐藥，直接威脅到卵巢癌患者的生存。雌激素是卵巢癌的發(fā)病因素之一，研究表明，絕經(jīng)后的卵巢癌患者體內(nèi)雌激素水平較前明顯增高［11］，雌激素與受體結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移。雌激素受體分α和β兩個(gè)亞型，α受體可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，β受體恰好相反。使用α受體拮抗劑或者β受體激動(dòng)劑處理卵巢癌細(xì)胞，可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)［7］。NCCN推薦用于卵巢癌治療的抗雌激素藥物有兩種，即選擇性雌激素調(diào)節(jié)劑SERMs和芳香化酶抑制劑，常用的雌激素受體拮抗劑他莫昔芬及雷洛昔芬皆隸屬于前者。他莫昔芬可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合形成復(fù)合物，改變雌激素受體的空間構(gòu)型，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞活性，抑制其生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)他莫昔芬能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，減少S期細(xì)胞的比例（P＜0.01），其對(duì)細(xì)胞周期的影響甚至優(yōu)于順鉑（P＜0.05），形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為胞漿及胞核濃縮，呈碎塊狀，顏色較正常細(xì)胞變白。他莫昔芬抑制A2780的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)效果可見(jiàn)一斑，而STASENKO等［12］的臨床研究證實(shí)，他莫昔芬可延長(zhǎng)難治性卵巢癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期（progression?free survival，PFS）。另一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究，以82例口服他莫昔芬（40 mg qd）患者與156例行紫杉醇（80 mg/m2，每周）或阿霉素（40 mg/m2，每4周）化療患者相比，PFS有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但OS卻無(wú)明顯差別［13］。這顯然為不能耐受化療毒性反應(yīng)的晚期或難治性卵巢癌患者提供了新的治療選擇。

當(dāng)順鉑與他莫昔芬聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是毋庸置疑的（P＜0.01），本課題組發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期的角度來(lái)看，腫瘤細(xì)胞S期比例上升，G0/G1比例減少，這顯然提示順鉑聯(lián)合他莫昔芬聯(lián)合用藥時(shí)其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并不是單獨(dú)的疊加效應(yīng)。國(guó)內(nèi)研究表明，順鉑可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞表達(dá)雌激素受體，雌激素受體拮抗劑可減輕順鉑耐藥［8］，究竟雌激素受體如何逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥，其機(jī)制尚不清楚，余波瀾等［14］的研究表明，雷洛昔芬的衍生物阿佐昔芬及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物去甲阿佐昔芬均可形成醌類(lèi)代謝物，與谷胱甘肽相結(jié)合后能抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性。由此推測(cè)，或可逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥。然而，尚缺乏他莫昔芬減輕順鉑耐藥的相關(guān)機(jī)制研究，需要廣大學(xué)者進(jìn)一步研究證實(shí)。