崔巖 李珊山 侯媛媛 宋洋 陳瑞麗 李洪霞
(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科,長春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科,長春 130021)
黑素(melanin)是一種耐酸、耐熱、帶負電荷的疏水性大分子聚合物,是真菌重要的毒力因子之一,致密地覆蓋于細胞壁表面。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),黑素可通過抵御活性氧簇(ROS)、紫外線、重金屬離子的殺傷以及降低巨噬細胞的吞噬等多種途徑保護菌體,使之能在不利環(huán)境中生長[1]。
球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa)可以通過1,8-二羥基萘(dihydroxynaphthalene,DHN)途徑、L-多巴(L-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)途徑和酪氨酸(L-tyrosine)途徑合成黑素。S.globosa作為雙相型真菌(即在環(huán)境中為菌絲相,在機體內(nèi)為酵母相引發(fā)感染),無論在酵母相或是菌絲相均可合成黑素,可見黑素對于致病性孢子絲菌的生存十分重要[2]。最近研究發(fā)現(xiàn),黑素可以降低申克孢子絲菌(S.schenckiisenusstricto)和巴西孢子絲菌(S.brasiliensis)對特比萘芬、兩性霉素B的敏感性[3,4],但對于S.globosa的作用尚無報道。因此本文利用紫外照射法誘導(dǎo)的S.globosa白化突變株(MEL-)與黑素野生株(MEL+),檢測對4種常見抗真菌藥的敏感性并探討黑素對抗真菌藥物的作用。
Sporothrixglobosa(FHJU 12082703)黑素野生株(MEL+)分離自孢子絲菌病臨床患者皮損組織(CAL基因序列GenBank登錄號為KT008664),其白化突變株(MEL-)由吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科實驗室構(gòu)建并提供[5]。
氟康唑(Fluconazole,F(xiàn)CZ)、特比萘芬(Terbinafine,TRB)、伊曲康唑(Itraconazole,ICZ)購自加拿大Tokyo Chemical Industry,兩性霉素B(Amphotericin B,AMB)購自加拿大BBI公司。纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶購自美國Genview公司。蛋白酶K購自美國Invitrogen公司。
利用瓊脂平板法檢測MEL+和MEL-,對4種抗真菌藥FCZ、TRB、ICZ和AMB的藥物敏感性。將保存的MEL+和MEL-菌接種至Potato Dextrose Agar(PDA),28℃活化7 d。加入含0.5 % Tween 80的生理鹽水配置成終濃度為2×102 CFU/mL的孢子懸液,取100 μL涂布于含有不同濃度梯度的抗真菌藥物瓊脂平板上,30℃培養(yǎng)72 h后菌落計數(shù)。每種抗真菌藥為倍比稀釋,各含5個藥物濃度,濃度范圍分別為FCZ 1 ~16 μg/mL;TRB 0.025 ~ 0.4 μg/ml;AMB 1 ~16 μg/mL;ICZ 0.0625~ 1 μg/mL。不含抗真菌藥物的瓊脂平板作為陰性對照。實驗重復(fù)3次。按生存率=(含藥平板菌落數(shù)/不含藥菌落數(shù))×100%,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
按照宋洋[5]的方法制備S.globosa黑素,將活化的MEL+菌絲相接種至Potato Dextrose Broth(PDB)液體培養(yǎng)基中,28℃,120 r/min,震蕩培養(yǎng)2個月。8層紗布過濾后離心獲得分生孢子。加入含濃度均為10 mg/mL纖維素酶、蝸牛酶和溶壁酶的1.0 mol/L山梨糖醇-0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液,30℃震蕩消化過夜。離心并PBS洗滌3次,棄上清,加入4.0 mol/L硫氰酸胍溶液,室溫震蕩過夜。離心并PBS洗滌3次,蛋白酶K 37℃消化過夜,PBS洗滌3次,6.0 mol/L鹽酸煮沸1h。取上層黑色懸液,PBS,震蕩洗滌,離心取上層懸液,共3次。靜置,每日洗滌一次,至黑素顆粒逐漸沉淀后,離心,棄上清,光鏡下觀察。
利用紫外分光光度計檢測黑素對抗真菌藥物濃度的影響。取上述方法制備的100 μL黑素分別加入用甲醇溶解的4種抗真菌藥物,至終體積為200 μL,藥物終濃度分別為TRB 25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL;FCZ 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL;ICZ和AMB 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL,于30℃,震蕩孵育12 h和24 h,0.22 μm有機系濾膜過濾后按照2010版中國藥典分別檢測吸光度(TRB檢測波長為282 nm,F(xiàn)CZ和ICZ檢測波長為259,AMB檢測波長405 nm)。陰性對照組為不含黑素的等體積抗真菌藥液,空白對照組為等體積黑素。
利用高效液相色譜法(HPLC)檢測黑素對AMB的作用。配置濃度為128 μg/mL的AMB作為母液,分別取100 μL、50 μL、30 μL藥液,加入黑素補足200 μL。30℃,震蕩孵育24h后,0.22 μm有機系濾膜過濾,利用Agilent 1260高效液相色譜儀檢測(美國安捷倫公司)。色譜條件如下[6],色譜柱:Extend-C18柱,(5μm,250 mm×4.6mm);流動相:(A)乙腈,(B)2.5 mmol/L EDTA;檢測波長:383nm;柱溫:30℃;流速:1 mL/min;進樣量:精密吸取供試品溶液20μL;梯度洗脫時間:0 ~ 15 min,A液為30%,B液為70%,16 min及以后,A液為100%。黑素和AMB母液各200 μL。實驗重復(fù)3次。
利用SPSS 18.0軟件,采用Student t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)差異分析,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Graphpad Prism 5軟件將數(shù)據(jù)繪制柱形圖。
菌株MEL+和MEL-分別接種于不同濃度梯度的含藥瓊脂平板上,30℃培養(yǎng)72h后,肉眼計菌落數(shù)。與對照組相比,計算生存率。結(jié)果如圖1顯示,MEL+在ICZ和TRB的含藥平板上,隨著藥物濃度的降低,生存率逐漸升高,在ICZ濃度為0.5 μg/mL和1 μg/mL時不生長,而對于AMB和FCZ的各個濃度間無顯著差異,生長率接近100%。MEL-則在AMB和TRB含藥平板上隨著藥物濃度的降低,生存率逐漸升高,而在ICZ含藥平板的各個濃度上均未生長。在AMB的4~16 μg/mL和ICZ的0.06~0.25 μg/mL濃度間,MEL-生存率小于MEL+,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
圖1抗真菌藥物敏感性實驗(*P<0.05,**P<0.01)
Fig.1Antifungal drug susceptibility test(*P<0.05,**P<0.01)
將不同的抗真菌藥液與黑素孵育12h或24h后,利用紫外分光光度計檢測藥液的吸光度,觀察濃度的變化情況。結(jié)果顯示(圖2),藥液加入黑素孵育12 h和24 h后,藥液濃度均呈現(xiàn)不同程度的降低。而AMB所有濃度均顯著降低(p<0.01),TRB為100 μg/mL時,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ICZ孵育12 h后,10 μg/mL和20 μg/mL有差異(P<0.05),孵育24 h時,僅20 μg/mL差異顯著(P<0.01)。FCZ在所有濃度均無差異(P>0.05)。
為了觀察AMB加入黑素的變化情況,我們利用HPLC進行檢測。結(jié)果如圖3所示,AMB在C-18柱、檢測波長為383 nm時,保留時間約為5.2 min左右(圖3-A),而在此時黑素幾乎無吸收(圖3-E)。隨著藥液濃度的降低和黑素濃度的升高,在保留時間為3.8 min、4.2 min和4.7 min左右出現(xiàn)吸收峰,尤其在50 μL AMB + 150 μL黑素(圖3-C)和30 μL AMB + 170 μL黑素(圖3-D),峰形變化明顯。
圖2球形孢子絲菌黑素對抗真菌藥物濃度的影響(*P<0.05,**P<0.01)
Fig.2The effect ofSporothrixglobosamelanin on concentration of antifungal drugs(*P<0.05,**P<0.01)
根據(jù)合成途徑的差異,黑素可分為3種:DHN-melanin、eumelanin(L-DOPA途徑)、promelanin(L-tyrosine途徑)[3]。目前研究發(fā)現(xiàn),新生隱球菌(Cryptococccusneoformans)[7]、巴西副球孢子絲菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)[8]、組織莢膜胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)[7]和馬內(nèi)菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei)[9]可利用eumelanin抵御抗真菌藥物的殺傷,而足馬杜拉分支桿菌(Madurellamycetomatis)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)則依賴于DHN-melanin[10]。現(xiàn)已證實,致病性孢子絲菌包括S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto和S.globosa,無論酵母相或是菌絲相,均可通過上述3種途徑合成黑素[2],而且合成黑素的能力越強,菌株侵襲力越強[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn),孢子絲菌復(fù)合體之一,盧艾里孢子絲菌(S.luriei)的菌絲相只能合成pyomelanin,而酵母相不能合成任何種類的黑素,S.luriei幾乎不致病或許與此相關(guān)[12]。
圖3高效液相色譜圖:A:128 μg/mL AMB ;B:100 μL, 128 μg/mL AMB + 100 μL 黑素;C:50 μL, 128 μg/mL AMB + 150 μL黑素;D:30 μL, 128 μg/mLAMB + 170 μL 黑素;E:200 μL 黑素
Fig.3HPLC chromatogram:A:128 μg/mLAMB ;B:100 μL 128 μg/mL AMB + 100 μLmelanin;C:50 μL, 128 μg/mL AMB + 150 μL melanin;D:30 μL, 128 μg/mLAMB + 170 μL melanin;E:200 μL melanin
Mario[4]通過向培養(yǎng)基添加黑素前體的方式,首次證明黑素具有保護S.brasiliensis、S.schenckiisenusstricto抵御AMB殺傷的作用。Rodrigo[3]則通過添加黑素合成抑制劑三環(huán)唑發(fā)現(xiàn),黑素可以抵御TRB的殺傷,但是由于三環(huán)唑的抑制作用廣泛,因而無法明確是哪種黑素發(fā)揮作用。我們利用紫外照射誘變法構(gòu)建的白化突變株,直接證明了黑素可以保護菌株對抗真菌藥物的殺傷。在前期實驗中,我們采用了CLSI推薦的液基微量稀釋法,但是結(jié)果顯示MEL-在RPMI 1640為液基培養(yǎng)的時間過長,對照組需要5 d才能完全生長,而此時MEL+則生長過度,無法讀取MIC值,因而改用含藥平板涂布法,通過計菌落數(shù)的比值進行分析。在以往微量稀釋法的藥敏試驗中,TRB的MIC值(0.03 ~ 0.06 μg/mL)遠低于ICZ(0.25 ~ 1 μg/mL),但結(jié)果顯示含藥平板涂布法對TRB的抑菌作用影響最大[13,14],提示該方法可能影響了TRB的生物利用度。FCZ和ICZ同屬唑類化合物(主要通過抑制真菌細胞色素P450對羊毛固醇14α脫甲基作用,從而抑制麥角固醇的合成),區(qū)別只在于兩者對細胞色素P450的作用位點不同[15]。結(jié)果顯示,F(xiàn)CZ對MEL+和MEL-的生長均無抑制作用,這與微量稀釋法的藥敏結(jié)果相似,不僅印證了S.schenckiisenuslato對FCZ是天然耐藥,而且表明MEL-中FCZ的作用靶點未發(fā)生突變。與MEL+相比,MEL-對AMB和ICZ較為敏感,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,尤其是對ICZ,在0.06 ~ 1 μg/mL范圍內(nèi)均未生長,表明黑素具有保護S.globosa抵御AMB和ICZ的作用,這可能是由于黑素的缺失,增加了AMB和ICZ在真菌細胞內(nèi)的濃度,使藥物殺傷效率增加,提示使用抗黑素合成類的藥物(三環(huán)唑)會增加抗真菌藥物的作用,即兩者的關(guān)系為協(xié)同作用,Almeida-Paes[3]和Mario[4]的實驗結(jié)果也不同程度地證實了該假設(shè)。在本實驗中,由于在培養(yǎng)過程中未添加任何前體物,因此可能是DHN-melanin發(fā)揮了作用,但是不排除S.globosa其他類型的黑素也具有相同功能,這需要進一步實驗驗證。
有文章推測[16],黑素可能通過吸附或轉(zhuǎn)化抗真菌藥物,降低細胞內(nèi)藥物濃度,從而保護菌株。為了探討黑素抵御抗真菌藥的作用機制,我們利用紫外分光光度法檢測了黑素對抗真菌藥物濃度的影響。結(jié)果顯示,黑素對各組抗真菌藥物12h和24h的作用結(jié)果相似,均對FCZ的濃度無影響,但可明顯降低AMB各組以及ICZ和TRB高劑量組的濃度。黑素對AMB濃度影響更顯著,這可能由于一方面AMB可直接與真菌細胞膜的麥角固醇結(jié)合,形成孔道,導(dǎo)致細胞離子外泄,引起真菌死亡[17]。而AMB為多烯類化合物,分子量較大,因此黑素對于AMB的轉(zhuǎn)運和吸收影響最大。同時黑素可通過屏蔽作用,降低AMB對麥角固醇的結(jié)合。另一方面,AMB本身具有黃色,對紫外分光光度法的檢測較為敏感。為了進一步確定黑素對AMB的作用方式,我們利用HPLC法對產(chǎn)物進行了檢測。圖譜顯示,與對照組相比,加黑素組出現(xiàn)了新峰,并且與AMB特征峰相鄰,可能表明黑素對AMB進行了轉(zhuǎn)化。下一步可嘗試利用質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進一步分析。
綜上,我們發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌黑素能夠抵御AMB和ICZ對菌株的殺傷,并提示黑素可能對AMB進行轉(zhuǎn)化,從而降低藥物濃度。