16株中國東北地區(qū)臨床孢子絲菌菌種分子生物分類學研究

黃夢雅，劉婷婷，楊致邦，周 汛

孢子絲菌是人獸共患性真菌[1]，可引起人和哺乳動物的皮膚、皮下組織及周圍淋巴管亞急性或慢性感染，偶可播散至全身如骨、腦，引起系統(tǒng)性損害，甚至死亡[2]。該菌分布于全球各地，以熱帶和亞熱帶地區(qū)為主[3]，病人大多為接種感染[4]，多見于園林、農(nóng)業(yè)工作者，也可感染某些動物如貓、狗[1]和海豚[5]等。該菌是雙相型真菌，在25℃為菌絲相，動物體內(nèi)和37℃為酵母相。 它是美國人Shenk首次從孢子絲菌病人患病組織中分離出來，故命名為申克孢子絲菌[6]。長久以來我國各地區(qū)孢子絲菌病的病原菌也一直被認為是申克孢子絲菌[7]。近期有研究認為，孢子絲菌病病原菌并非申克孢子絲菌一種，而是由申克孢子絲菌、球形孢子絲菌、巴西孢子絲菌(Sporothrixbrasiliensis，S.brasiliensis)、墨西哥孢子絲菌(Sporothrixmexicana，S.mexicana)、白孢子絲菌(Sporothrixpallida，S.pallida)、申克孢子絲菌盧艾里變種(Sporothrixschenckiivarluriei，S.luriei)6個種構(gòu)成[8-9,22]。不同菌種致病性、藥物敏感性不同[10-11]，因此，準確鑒定菌種有利于臨床治療與預后判斷。

目前，國內(nèi)傳統(tǒng)的針對孢子絲菌病病原菌鑒定多通過皮損處組織塊或濃汁培養(yǎng)，在25 ℃和37 ℃培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)以及血清學、免疫熒光染色輔助診斷[7,12]，但這些方法特異性不高，不能準確鑒別6個菌種[13]，且耗時長，需要2～3周時間。已報道鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CAL)基因序列可以鑒定孢子絲菌6個菌種[9,14-15]，但核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列及β微管蛋白序列PCR擴增率更高，可用于快速、準確鑒定孢子絲菌菌種[16-17]。本文對16株既往根據(jù)組織病理鑒定為申克孢子絲菌的臨床孢子絲菌株的孢子絲菌進行ITS及β微管蛋白序列PCR分子生物學鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 16株孢子絲菌來自于吉林大學第二醫(yī)院皮膚科孢子絲菌病患者組織，該菌曾用顯微鏡病理檢查、PSA染色等方法鑒定為申克孢子絲菌[12]。本次實驗將其分別編號為J29、J30、J31、J33、J34、J36、J37、J38、J39、J41、J42、J43、J44、J45、J46、J47。

1.1.2培養(yǎng)基 土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrse Agar Medium,PDA)， CTAB法提取基因組DNA相關(guān)試劑[18]，PCR擴增試劑盒(TaKaRa，American)。

1.1.3引物(Beijing Genomics Institute ，BGI提供)

ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG

G-3′

β-tubulin 2a：5′-GGTAACCAAATCGGTG

CTGCTTTC-3′

β-tubulin 2b：5′-ACCCTCAGTGTAGTGA

CCCTTGGC-3′

1.2 方法

1.2.1真菌菌絲相細胞基因組DNA提取 將16株孢子絲菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃下溫箱孵育10 d，取孢子絲菌菌絲相菌體500 mg，按CTAB法提取真菌基因組DNA[18]，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析測定其完整性后，產(chǎn)物儲存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2PCR擴增孢子絲菌ITS及β-tubulin基因 分別使用ITS1/ITS4[28]和β-tubulin 2a/β-tubulin 2b[29]，PCR采用50 μL體系，內(nèi)含1 μL DNA模板，各2 μL 上下游引物(15 μm)，10×PCR緩沖液5.0 μL，dNTP(各10 mm)4.0 μL，Taq聚合酶(5U/ μL)0.3 μL,雙蒸水35.7 μL。擴增條件：預變性95℃ 3 min，1個循環(huán)：變性95 ℃ 30 s，退火52～54 ℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，35個循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min。

1.2.3基因組測序 分別將所獲得的16株菌的ITS、β-tubulin擴增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往北京六合華大基因科技股份有限公司正反向測序，得到PCR擴增片段原始序列。

1.2.4序列對比及系統(tǒng)進化分析 分別將所獲得的ITS、β-tubulin正反向序列通過ContigExpress軟件拼接得到共識序列，將此序列輸入NCBI網(wǎng)站(http：//blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進行對比，并將序列存入基因庫，合并ITS、β-tubulin序列，與已經(jīng)發(fā)表在基因庫內(nèi)的其他地區(qū)的參考序列ITS、β-tubulin一起使用Clustalx 1.81進行對比[19]，將對比后獲得的序列利用MEGA4軟件中的鄰接(Neighbor-Joining，NJ)進行系統(tǒng)分析，系統(tǒng)樹各分支的置信度以1000次自引導法(Bootstrap)重復檢測[20]。

2 結(jié) 果

2.1擴增產(chǎn)物電泳 所提取的16株孢子絲菌基因組DNA分別經(jīng)ITS、β-tubulin的PCR擴增，所得原液及相應引物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測如下(見圖1、圖2)。經(jīng)ITS、β-tubulin擴增所得基因片段分別近似長600 bp和400 bp，同孢子絲菌相應基因片段長度相符。

2.2系統(tǒng)發(fā)育學分析 凝膠電泳初步檢測后的16株孢子絲菌基因片段經(jīng)正反向測序，獲得的基因原始序列分析通過系統(tǒng)發(fā)育學分析得到以下系統(tǒng)進化樹(圖3)。

圖1ITS擴增產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.1PCRproductionofITS

1: Marker 2000 bp; J29, J30, J31, J33, J34, J36, J37, J38, J39, J41, J42, J43, J44, J45, J46, J47: ITS genes.

圖2β-tubulin擴增產(chǎn)物電泳圖譜

Fig.2PCRproductionofβ-tubulin

1: Marker 2 000 bp; J29, J30, J31, J33, J34, J36, J37, J38, J39, J41, J42, J43, J44, J45, J46, J47: β-tubulin genes.

圖316株孢子絲菌的系統(tǒng)進化樹圖譜

Fig.3Phylogenetictreeof16Sporothrixisolates

Bootstrap support values >50% are shown above the branches, and the scale bar indicates 0.05 changes. The tree is rooted withOphiostomanigrocarpum. References sequences are shown in bold. “C” and “E” indicate clinical strains and environmental strains, respectively. An asterisk (*) indicates the type strains.

此次鑒定的16株菌均與球形孢子絲菌(CBS 120340*)在同一分支上，其支持率為98%，這些進化枝與申克孢子絲菌(CBS 359.36*)有明顯的距離，故鑒定為球形孢子絲菌。

3 討 論

孢子絲菌菌株通過形態(tài)學鑒定提示不同的遺傳特性和系統(tǒng)發(fā)育分組[21]。分子生物學系統(tǒng)發(fā)育的分析顯示，孢子絲菌屬下并非只有一個的種，它由6個物種構(gòu)成。不同的物種分布不同，巴西孢子絲菌的感染和分布在巴西，申克孢子絲菌主要流行在美洲、非洲、亞洲[9]。球形孢子絲菌在亞洲、歐洲、美洲等國家均有分布[23]。目前體外培養(yǎng)表明不同菌種的菌株在環(huán)境和人類宿主相對頻率的差異，導致了不同的致病性[24]。有小鼠模型的研究表明，不同孢子絲菌基因型的毒力、致病性不同導致孢子絲菌臨床類型的不同[25]。在兒童中，多為固定型[26]，成人中皮膚淋巴管型最為多見，其次為固定型，皮膚外型、播散型相對少見[27]。不同的臨床類型提示不同的治療、預后。巴西孢子絲菌和申克孢子絲菌為最致命的物種[11]。孢子絲菌的其中5個種在體外對12個抗真菌劑進行了敏感測試，不同種之間存在顯著差異，巴西孢子絲菌對抗真菌藥物最敏感，最不敏感的是墨西哥孢子絲菌，在一般情況下，特比萘芬是最有效的藥物[10]。 因此，臨床分離株的物種鑒定對孢子絲菌致病力、臨床表現(xiàn)、藥物敏感療效評估及預后有明顯意義。

現(xiàn)已經(jīng)有5株中國環(huán)境株[9]、33株中國北方孢子絲菌病臨床分離株[14]、74株中國東北孢子絲菌病臨床分離株[15]通過CAL序列，6株中國孢子絲菌病臨床分離株、64株中國孢子絲菌臨床分離株[30]通過ITS序列和β-tubulin序列[17]鑒定為球形孢子絲菌。本次研究的16株菌既往依據(jù)病人臨床表現(xiàn)、顯微鏡病理檢查、PSA染色后鑒定為申克孢子絲菌，但該方法不能準確區(qū)分6個菌種。在分子生物學的基礎(chǔ)上， ITS序列及β-tubulin序列比CAL序列的PCR擴增率更高，可快速、準確鑒定孢子絲菌菌種[16-17]。因此，我們將這16株臨床分離菌株在ITS序列和β-tubulin序列處擴增，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析證實這16株菌均為球形孢子絲菌，而非申克孢子絲菌。故此次收集的孢子絲菌病臨床分離株雖然既往鑒定為申克孢子絲菌，但在分子生物學的角度更為準確地分析為球形孢子絲菌。 本次研究結(jié)果表明，6個孢子絲菌菌種通過體外培養(yǎng)后的肉眼觀察和顯微鏡檢并不能得到良好的區(qū)分。僅僅通過組織形態(tài)學、病理染色等方法鑒定孢子絲菌致病菌種存在一定的局限性。CAL基因序列可以鑒定孢子絲菌6個菌種，但有報道其PCR擴增率較其他常用序列如ITS序列及β-tubulin序列低，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列雖然在鑒定某些真菌菌種時需要配合其他標記物，但其被廣泛應用于真菌菌種鑒定，并建議作為鑒定的一般方法[16]。故通過應用ITS序列及β-tubulin序列對孢子絲菌DNA進行PCR高效擴增，測序后利用系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以得到有關(guān)物種鑒定的明確結(jié)果。

綜上所述，本次研究的東北孢子絲菌鑒定為球形孢子絲菌，目前所有的研究表明，在分子生物學角度鑒定的中國東北甚至已研究的中國地區(qū)孢子絲菌病致病菌目前只找到球形孢子絲菌，故孢子絲菌病致病菌在中國東北地區(qū)乃至中國可能為球形孢子絲菌或并非單一申克孢子絲菌，但此結(jié)論還需要更多多中心大量樣本的研究證明。本次研究表明，傳統(tǒng)的形態(tài)學對于精確鑒定孢子絲菌菌種尚存在一定缺陷，利用提取孢子絲菌基因組DNA進行測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可以進一步完善鑒定方法，為下一步直接提取患者孢子絲菌DNA，PCR擴增鑒定菌種奠定了基礎(chǔ)。為了提高臨床效率，縮短診斷時間，我們下一步將研究直接從孢子絲菌病患者皮損組織直接提取致病菌DNA、利用ITS序列和β-tubulin分子生物學診斷技術(shù)去快速有效地鑒定物種，從而指導孢子絲菌病的臨床治療方案及預后判斷。

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