一種配制型塊菌蘋果醋的研制

吳樹坤，黃治國，衛(wèi)春會(huì)，宗緒巖，鄧杰

（四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

塊菌是屬子囊菌門的一類大型真菌[1]，也是世界上最珍貴的藥食用菌之一，通常需要與木本植物形成共生關(guān)系才能得以生長[2]。塊菌營養(yǎng)成分豐富，含有多種易被人體吸收的氨基酸、無機(jī)鹽[3]和有促進(jìn)免疫功能和抗腫瘤活性的多糖等[4]，塊菌中含有的神經(jīng)酰胺具有較好的保濕作用，可廣泛運(yùn)用于美容行業(yè)[5]，其含有的α-雄烷醇化學(xué)結(jié)構(gòu)與人體性激素相似，具有調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期等功能[6]。此外，還可作為輔料制成各類食品，備受美食界喜愛[7]。無論作為保健食品還是功能藥物都極具價(jià)值，故塊菌素有“林中黑鉆石”的美譽(yù)[8]。

蘋果醋作為蘋果深加工的產(chǎn)物，具有蘋果的典型風(fēng)味且營養(yǎng)價(jià)值高于普通食醋，其特有的風(fēng)味可使其同普通飲料一樣可直接飲用。蘋果醋含有豐富的有機(jī)酸[9]和數(shù)種人體必需的氨基酸[10]、維生素等物質(zhì)[11]，具有調(diào)節(jié)血糖[12]、血壓，促進(jìn)食欲[13]、軟化血管[14]、抗氧化[15-18]等功能，其含有的乙酸等能進(jìn)入機(jī)體參與三羧酸循環(huán)緩解身體疲勞[19]，而豐富的抗壞血酸則可增加人體免疫力，延緩衰老的功能[20]。目前，關(guān)于保健果醋研制的報(bào)道較多[21-24]，但鮮有以感官評(píng)價(jià)為研制標(biāo)準(zhǔn)且對(duì)自身產(chǎn)品中活性物質(zhì)清晰闡明的報(bào)道。本研究擬用蘋果釀制成醋，以感官評(píng)價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化蘋果醋與塊菌提取物及蔗糖的調(diào)配比例，并檢測其α-雄烷醇、氨基酸及揮發(fā)性成分的含量。研制一款不僅具有蘋果-塊菌混合果香味，而且在口感上又能適應(yīng)多數(shù)消費(fèi)者，此外還具有一定保健功能的利口果醋，此產(chǎn)品具有較好的市場前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅富士蘋果、塊菌：市售；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌由四川理工學(xué)院釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

乙醚（分析純）、食用酒精：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、檸檬酸（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；L－8900型氨基酸自動(dòng)分析儀：日本HITACHI公司；DK-98-1型電子恒溫水浴鍋：天津泰新特儀器有限公司；WYT-ⅡA型手持折光儀：成都市格納絲商貿(mào)有限公司；SG260-A型榨汁機(jī)：好夫人電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果醋的釀制工藝

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

蘋果汁的制備：將新鮮無腐爛的蘋果用清水洗凈并削皮去核，切成小塊浸泡在0.05%的VC溶液中進(jìn)行護(hù)色，隨后榨汁。

成分調(diào)整：使用手持折光儀用蔗糖將蘋果汁糖度調(diào)整為15%，用檸檬酸將pH值調(diào)整為3.5。

酒精發(fā)酵：將活化好的酵母（0.2%安琪干酵母，4%葡萄糖在37℃活化15 min，再以33℃活化1 h～2 h）以10%的比例接種至滅菌（溫度控制在80℃～85℃，保持30 min）的蘋果汁中，發(fā)酵溫度控制在28℃，每天旋轉(zhuǎn)發(fā)酵罐2次～3次，并測定果汁糖度和酒精度的變化。

醋酸發(fā)酵：將蘋果酒加熱至70℃左右保持15 min，冷卻后將其酒精濃度調(diào)整為6%（20℃），再向發(fā)酵罐中以10%的比例接入活化的醋酸菌（3%乙醇，0.25%醋酸菌，1%葡萄糖，1%酵母膏，0.5%CaCO3于40℃，140 r/min活化48 h）。發(fā)酵溫度37℃，每天檢測酒精度與醋酸的變化。

澄清：采用加熱澄清法[25]，即將發(fā)酵液在80 s～90 s內(nèi)加熱到80℃左右，然后急速冷卻至室溫，隨后用硅藻土作助濾劑過濾。即得蘋果原醋。

1.3.2 塊菌多糖的提取

1.3.2.1 工藝流程

1.3.2.2 操作要點(diǎn)

浸提：以塊菌∶40%乙醇溶液=1∶5（g/mL）的比例浸提30 min，每隔5分鐘攪拌1次，過濾后，濾渣再重復(fù)浸提兩次。

濃縮：將塊菌提取液體積濃縮至與初始?jí)K菌質(zhì)量一樣的值。即得用于調(diào)配的塊菌提取液。

1.3.3 理化指標(biāo)的測定[26]

酒精度的測定：酒精計(jì)法；糖度的測定：斐林試劑法；酸度的測定：酸堿滴定法。

1.3.4 α-雄烷醇的測定[27]

1）樣品預(yù)處理

由于塊菌中α-雄烷醇含量極低，檢測前需將200 mL用于調(diào)配的塊菌提取液與100 mL重蒸乙醚充分振蕩混合進(jìn)行液液萃取，靜止分層后，取上層溶液，并重復(fù)萃取一次，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL。立即進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。

2）α-雄烷醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將10 mg的α-雄烷醇標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮溶解，定容到10 mL，然后再配制成濃度分別為 20、50、100、150、200 μg/mL的α-雄烷醇標(biāo)準(zhǔn)品，用GC-MS定量檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）α-雄烷醇的檢測

氣相色譜（GC）條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度 230℃；升溫程序?yàn)?0℃保持3 min，10℃/min升到180℃，再以20℃/min升到230℃保持10 min；載氣99.999%氦氣，載氣流速為 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 1 μL；分流比：20 ∶1。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃，四極桿150℃，傳輸線溫度230℃，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍25 amu～500 amu，溶劑延遲3 min。

1.3.5 塊菌蘋果醋飲料調(diào)配方法

采用L9（34）正交試驗(yàn)，以蘋果醋、塊菌提取液、蔗糖為影響因素，選擇出蘋果醋塊菌飲料的最佳調(diào)配組合。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3.6 蘋果醋的感官評(píng)定方法

按照正交試驗(yàn)的原料比例進(jìn)行塊菌蘋果醋的配制，制得9組樣品。然后，邀請(qǐng)10位視覺、嗅覺、味覺良好的專業(yè)人員進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2，每組樣品的感官評(píng)分取平均值。

1.3.7 氨基酸的測定

最優(yōu)調(diào)配比例的塊菌蘋果醋中游離氨基酸的測定方法參照文獻(xiàn)[28]。

1.3.8 塊菌蘋果醋中揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

以乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)最優(yōu)調(diào)配比例的塊菌蘋果醋中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行半定量，具體方法參照文獻(xiàn)[29]。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Standard table for sensory evaluation

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)每組重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析；正交試驗(yàn)采用極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果醋釀制過程酒精度、糖度及酸度的變化

2.1.1 酒精發(fā)酵過程酒精度和糖度的變化

本試驗(yàn)研究蘋果汁酒精發(fā)酵過程酒精度和糖度的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 酒精發(fā)酵過程酒精度和糖度的變化Fig.1 The changes of alcohol content and sugar content at alcohol fermentation process

如圖1所示，蘋果汁的糖含量在發(fā)酵的前5天均每天顯著減小（p＜0.05），而酒精含量在發(fā)酵的前5天均每天顯著增加（p＜0.05）；這是由于發(fā)酵前期蘋果汁中糖含量充足且有一定的溶氧，各種營養(yǎng)物質(zhì)充足，有利于接種的酵母迅速生長和代謝。但發(fā)酵至6天后，蘋果汁中糖含量和酒精含量的變化均不顯著（p＞0.05），發(fā)酵至第7天糖含量降至2.9%，酒精含量升至5.3%vol；這是由于后期發(fā)酵環(huán)境變得惡劣，溶氧不足，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，使酵母的生命活力降低，故而酵母代謝受阻，因此糖含量和酒精含量變化緩慢。故可推斷蘋果汁酒精發(fā)酵的1 d～5 d為主發(fā)酵期。本試驗(yàn)結(jié)果與衛(wèi)春會(huì)等[30]對(duì)蘋果醋的研究結(jié)果一致。

2.1.2 醋酸發(fā)酵過程中酸度和酒精度的變化

本試驗(yàn)研究了蘋果醋醋酸發(fā)酵過程中酸度和酒精度的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 醋酸發(fā)酵過程中酸度和酒精度的變化Fig.2 The changes of acidity and alcohol content at acetic acid fermentation process

如圖2所示，蘋果酒的酒精含量在發(fā)酵的前4天均顯著降低（p＜0.05），而總酸含量在發(fā)酵的前4天均每天顯著增加（p＜0.05），這是由于發(fā)酵前期蘋果酒中底物充足，使醋酸菌生長并消耗酒精代謝產(chǎn)生醋酸。但發(fā)酵至4天后，蘋果酒中總酸含量的變化不顯著（p＞0.05），而在發(fā)酵至5天后，酒精含量的變化也不顯著（p＞0.05），發(fā)酵至第 6 天酒精含量降至 1.43%vol，總酸含量升至21.6 g/L，這是由于發(fā)酵后期酸度的增加且營養(yǎng)物質(zhì)貧乏，使醋酸菌生長代謝活力降低[31]。故可推斷蘋果醋醋酸發(fā)酵的1 d～4 d為主發(fā)酵期。

2.2 塊菌蘋果醋飲料的調(diào)配結(jié)果

正交試驗(yàn)采用蔗糖、塊菌提取液和蘋果原醋通過不同的比例進(jìn)行調(diào)配，并根據(jù)表2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。評(píng)分結(jié)果見表3。

由表3可知，塊菌蘋果醋飲料的調(diào)配過程中，隨著蔗糖添加量增加，感官評(píng)分先降低后升高；隨著塊菌提取液和蘋果醋量的增加，感官評(píng)分均逐漸增加。通過極差分析可得，各因素對(duì)塊菌蘋果醋感官影響的主次順序?yàn)閴K菌提取液＞蔗糖＞蘋果醋。塊菌蘋果醋最優(yōu)的調(diào)配條件為A3B1C3，即蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，蘋果原醋34 mL。而試驗(yàn)組中評(píng)分最高的為第7組（94分），且其調(diào)配比例與分析所得的最優(yōu)條件一致，故無需再進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The results table of orthogonal test

2.3 塊菌提取液中α-雄烷醇的檢測

2.3.1 α-雄烷醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)以α-雄烷醇作為標(biāo)準(zhǔn)品，用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品用氣相色譜定量分析得到的色譜數(shù)據(jù)，用標(biāo)準(zhǔn)品檢測的濃度對(duì)應(yīng)的峰面積制到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），并得到回歸方程為y=293 084x+60，決定系數(shù)R2＝0.984 1。

圖3 α-雄烷醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of alpha male alkanol

2.3.2 塊菌提取液中α-雄烷醇的含量

通過氣相色譜檢測，α-雄烷醇的峰面積為11 304，另一個(gè)α-雄烷醇的同分異構(gòu)體的峰面積為414 674，由線性回歸方程可得，α-雄烷醇的濃度為0.038 4 μg/mL，α-雄烷醇同分異構(gòu)體的濃度為1.145 μg/mL，即塊菌中α-雄烷醇的含量為0.019 2 μg/100 g，其同分異構(gòu)體的含量為0.707 μg/100 g。由于塊菌中α-雄烷醇的含量極低，難以檢測，且目前關(guān)于塊菌中α-雄烷醇的檢測方法報(bào)道較少。王冠等[27]采用液體發(fā)酵法發(fā)酵松露，再對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行α-雄烷醇的檢測，其α-雄烷醇含量最高可達(dá)123.5 ng/mL。但此法無法解釋?duì)?雄烷醇是由發(fā)酵產(chǎn)生還是塊菌中自身所有。

2.4 塊菌蘋果醋中游離氨基酸的含量

根據(jù)2.2中所得的塊菌蘋果醋最佳調(diào)配比例進(jìn)行組合，并對(duì)其進(jìn)行各游離氨基酸的含量的測定，結(jié)果見表4。

表4 各游離氨基酸的含量Table 4 Content of free amino acids

如表4所示，塊菌蘋果醋中一共檢測出12種氨基酸，氨基酸總含量為288.43 mg/100 mL，其中包括賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸6種必需氨基酸，且必需氨基酸的含量為32.41 mg/100 mL，占氨基酸總含量的11.24%，甲硫氨酸可能因含量較低，未被檢出。蘋果醋中氨基酸的來源主要為蘋果自身含有和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸，張海濤等[10]的研究表明，蘋果汁通過發(fā)酵，會(huì)增加其氨基酸的種類，如賴氨酸、異亮氨酸等。這些氨基酸很大程度上提高了蘋果飲料的營養(yǎng)價(jià)值。

2.5 塊菌蘋果醋中揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

根據(jù)2.2中所得的塊菌蘋果醋最佳調(diào)配比例進(jìn)行組合，并對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 揮發(fā)性風(fēng)味成分的含量Table 5 Content of volatile flavor components

續(xù)表5 揮發(fā)性風(fēng)味成分的含量Continue table 5 Content of volatile flavor components

如表5所示，一共檢測出24種揮發(fā)性風(fēng)味成分，總含量為46.72 mg/100 mL，其中包括15種酯類物質(zhì)，占總數(shù)的62.5%，總酯含量為11.215 mg/100 mL，占總揮發(fā)性風(fēng)味含量的24%。經(jīng)感官評(píng)價(jià)，該塊菌蘋果醋具有蘋果和塊菌的混合果香味，香味飽滿且無刺激味。酯類物質(zhì)主要來自原料和發(fā)酵過程中產(chǎn)生，在果醋、果酒及飲料中均是主要的呈香物質(zhì)[32]。且在果醋、果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究中，酯類物質(zhì)的檢測也是必不可少的[33-34]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化塊菌蘋果醋的調(diào)配比例，研究結(jié)果表明當(dāng)調(diào)配比例為蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，蘋果原醋34 mL時(shí)，綜合感官評(píng)分最高；此比例調(diào)配出的塊菌蘋果醋飲料的色澤靚麗，滋味協(xié)調(diào)，且具有蘋果和塊菌的混合果香味，香味飽滿且無刺激味。同時(shí)根據(jù)最優(yōu)調(diào)配比例，分析了塊菌蘋果醋中氨基酸含量和風(fēng)味成分含量，共檢測出了12種氨基酸（含量為288.43 mg/100 mL），其中包含6種必需氨基酸（含量為32.41 mg/100 mL），而必需氨基酸在人體一旦缺乏，將會(huì)影響人體的生理機(jī)能，使其抵抗力下降等[35]。此外還檢測出了24種風(fēng)味物質(zhì)，其中包含15中酯類物質(zhì)，其香氣不僅帶有蘋果的果香還具有塊菌中特殊的香味。此外，塊菌中α-雄烷醇及其同分異構(gòu)體的含量分別為 0.019 2 μg/100 g 和 0.707 μg/100 g，α-雄烷醇屬于類固醇物質(zhì)，與其同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似，均為稠和四環(huán)化合物。由此可以推斷它們?cè)谀承┕δ芊矫婵赡芫哂邢嗨频淖饔?。綜合試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)研制的塊菌蘋果醋不僅香味濃郁，滿足大眾口感，而且還具有豐富的氨基酸和其他功能物質(zhì)，為利口、保健蘋果醋飲料的開發(fā)提供了一條新的途徑。