斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究

李杰，肖澤濤，郭書賢

（南陽理工學(xué)院生化學(xué)院，河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽473004）

微生物油脂（microbial lipids）又稱單細(xì)胞油脂（single cell lipid，SCO），是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭瑸樘荚?、氮源，輔以無機鹽生產(chǎn)的油脂和一些有商業(yè)價值的脂質(zhì)。微生物油脂在能源環(huán)保、食品生產(chǎn)、日用化工等方面有廣泛的應(yīng)用。在當(dāng)前人口不斷增長的情況下，對于油脂的需求量巨大，而自然資源卻日益貧乏，因此，開發(fā)新的油脂資源具有重要的現(xiàn)實意義[1-7]。

生物柴油由于燃燒性好并且產(chǎn)生的污染少而受到許多國家的青睞，近年來，生物柴油行業(yè)急劇擴張。粗甘油是生產(chǎn)生物柴油的副產(chǎn)物，生物柴油行業(yè)規(guī)模的擴張使得副產(chǎn)物粗甘油大量產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計，粗甘油副產(chǎn)物約占總產(chǎn)物量的10%，如何將粗甘油回收利用，成為了一個新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[8-13]。

粗甘油可作為碳源被產(chǎn)油微生物通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為微生物油脂，相關(guān)的研究已經(jīng)取得了一定進展。2013年，Shen等研究了T.fermentans利用純甘油進行發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況，發(fā)現(xiàn)其最大的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為4.0 g/L、1.4 g/L和35.0%[14]。2015年，Spier等對L.starkeyi利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況進行了研究，試驗表明，發(fā)酵120 h后，L.starkeyi的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂含量分別為5.74、2.89 g/L和50.49%[15]。2016年，胡洋等利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂的研究中，選取蛋白胨+酵母浸膏作為混合氮源，以粗甘油為碳源，通過改變氮源的含量控制培養(yǎng)基的C/N，結(jié)果表明，C/N 為 60時，T.fermentans、T.cutaneum和L.starkeyi的生物量達到最大值，分別為14.24、15.07 g/L和17.74 g/L；在C/N為110時，油脂含量達到最大值，分別為32.37%、28.55%和32.27%[16]。由此說明，菌株的生長和油脂積累對于C/N的需求是不同的。因此，本研究主要針對產(chǎn)油脂微生物，考察以粗甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，不同碳氮比對其產(chǎn)油脂的影響，以期為微生物利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

大豆油：南陽萬德隆超市。

1.2 菌株

斯達油脂酵母1809：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；斯達油脂酵母 ZW-25、MM-17、YP-07：河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 10，蛋白胨10，pH自然。

YEPD固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，瓊脂粉20，pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[17]：葡萄糖 70，（NH4）2SO42.0，酵母粉 0.5，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH 5.8～6.0。

粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)待考察的粗甘油添加量，用粗甘油替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余成分同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 試劑

NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、Na2SO4、MnSO4·4H2O、KOH、NaCl、H3PO4、葡萄糖、香草醛、甲醇：均為國產(chǎn)分析純。

酵母膏、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：均為生物試劑。

1.5 主要儀器設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；BSP-150電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；HZQ-B數(shù)顯恒溫?fù)u床：蘇州威爾實驗用品有限公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器有限公司；CX31生物顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；7890A氣相色譜儀：上海天美分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 粗甘油制備

粗甘油的制備參考孔秀梅[18]，按醇油摩爾比4∶1進行酯交換反應(yīng)，按油重0.32%加入催化劑氫氧化鉀，控制溫度80℃，攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后回收殘余甲醇，然后冷卻靜置。分層后收集下層液體，用50%的H2SO4調(diào)節(jié)pH值至3.0，除去皂化物，即得試驗用粗甘油。

2.2 培養(yǎng)方法

將保存于試管斜面的菌株活化，挑取一環(huán)接種于YEPD液體培養(yǎng)基，25℃，145 r/min培養(yǎng)48 h，作種子液。將種子液以10%接種量分別接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃、145 r/min培養(yǎng)5 d。

2.3 高產(chǎn)油脂菌株的篩選

設(shè)置甘油培養(yǎng)基（試驗組）和葡萄糖培養(yǎng)基（對照組），采用平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法對斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07進行培養(yǎng)，篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株進行后續(xù)試驗。

2.4 碳源、氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

2.4.1 粗甘油濃度的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的粗甘油，考察其對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，粗甘油濃度范圍25 g/L～115 g/L，濃度梯度為15 g/L。

2.4.2 氮源種類和濃度的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中粗甘油濃度70 g/L，分別考察不同種類氮源對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響；考察有機氮源時固定無機氮源濃度，考察無機氮源時固定有機氮源濃度；有機氮源選擇酵母粉、蛋白胨、尿素，無機氮源選擇 NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3。

2.4.3 碳氮比的影響

固定發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源種類和濃度，改變粗甘油的添加量，選擇粗甘油濃度范圍25 g/L～115 g/L，濃度梯度15 g/L，分別考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。

2.5 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

將斯達油脂酵母ZW-25種子液以10%接種量接種于粗甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃、145 r/min培養(yǎng)144 h，每隔12小時取樣，測定菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)、pH值和殘余甘油濃度，考察菌株在發(fā)酵過程中各指標(biāo)的變化規(guī)律。

2.6 試驗指標(biāo)的測定和計算方法

2.6.1 生物量測定

發(fā)酵液進行離心，將濕菌體105℃烘干至恒重，稱重。菌體生物量以g/L表示（g為干菌體質(zhì)量，L為所用發(fā)酵液體積）[19]。

2.6.2 油脂產(chǎn)量測定（磷酸香草醛顯色法）

分別配制濃度為 0、0.08、0.1、0.12、0.2、0.16 g/L 油脂樣品（溶劑為無水乙醇-正己烷，體積比配比為1∶2）。分別取油脂樣品各1 mL水浴蒸干后加入2 mL98%硫酸，混勻后置于90℃水浴中加熱20 min，取出在冰水浴中冷卻后，加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液（0.025 g香草醛用1 mL無水乙醇溶解，再用34%磷酸定容到100 mL）3 mL，搖勻后室溫反應(yīng)20 min，在526 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。菌體用無菌水洗滌兩次后適當(dāng)稀釋，取1mL菌懸液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定油脂濃度，乘以稀釋倍數(shù)即得油脂產(chǎn)量[20]。

2.6.3 油脂含量測定

油脂含量/%=油脂產(chǎn)量/生物量×100

2.6.4 油脂系數(shù)測定

油脂系數(shù)=油脂產(chǎn)量/粗甘油消耗量×100

2.6.5 pH值測定

pH計預(yù)熱30 min，將電極浸入緩沖溶液進行校正，即可使用[21]。

2.6.6 殘余甘油濃度的測定

取5 mL丙三醇稀釋至50 mL，從中吸取0、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL 溶液分別加入 6 只比色管（10 mL）中，用含18%乙醇的飽和NaCl溶液定容，搖勻靜置；再分別從各比色管中吸取1.14 mL溶液加入6只裝有10 mL 5%NaOH和0.86 mL 15%CuSO4的小燒杯中，混勻后靜置10 min顯色，取適量溶液于8 000 r/min下離心5 min。然后取上清液，于630 nm波長下測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測發(fā)酵液用含18%乙醇的飽和NaCl溶液適當(dāng)稀釋，測其粗甘油濃度[22]。

2.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

采用酸熱法[23]提取油脂，油脂經(jīng)甲酯化后，利用氣相色譜對其脂肪酸組成和含量進行分析。

樣品甲酯化方法參考曲威[24]，取待測的微生物油脂0.1 g，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，于65℃水浴中皂化 30 min，加入 BF3-乙醚溶液（1 ∶1）0.2 mL，在65℃水浴中甲酯化5 min，取出，迅速冷水冷卻，加入石油醚2 mL，振蕩，靜置20 min。吸取上清液0.3μL～0.5 μL作為氣相色譜的進樣樣品。

氣相色譜檢測條件：FFAP色譜柱，進樣口270℃，檢測器270℃；柱溫：初始溫度60℃，以8℃/min升溫至185℃，保持2 min；以2℃/min升溫至260℃保持3 min；載氣：N2；柱流速：1 mL/min；分流比 20 ∶1；進樣量1 μL。使用CHEM32軟件進行數(shù)據(jù)處理。將測得的樣品色譜圖各峰的保留時間與脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間作比較，確定樣品色譜圖各峰的性質(zhì)，各組分含量（P）與不飽和脂肪酸指數(shù)（IUFA）計算如下式。

IUFA=1×單烯酸含量/%+2×二烯酸含量/%+…+n×n稀酸含量/%

式中：IUFA為不飽和脂肪酸指數(shù)，%。

式中：P表示組分的相對含量，%；Ai表示組分的峰面積；∑Ai表示各組分的峰面積總和。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

甘油和磷酸香草醛顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1、圖2。

圖1 甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glycerin

圖2 磷酸香草醛顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of sulfo-phospho-vanillin reaction

由圖1可知，甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=19.386x+0.001 3，曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 5。由圖2可知，斯達油脂酵母油脂標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.757 7x-0.088 2，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 1。

3.2 不同斯達油脂酵母菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況

將待篩選的斯達油脂酵母菌株ZW-25、MM-17、1809、YP-07分別接種在含粗甘油培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基的平板上，25℃、培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄兩組平板的生長情況，結(jié)果見表1。

表1 各菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生長情況Table 1 The growth situation of different strain on crude glycerol and glucose plate

由表1可知，4株斯達油脂酵母菌株均可在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長，菌株ZW-25在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基平板上長勢良好，說明其更適合在以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長。

3.3 不同斯達油脂酵母菌株以粗甘油為碳源發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究

根據(jù)2.3的方法進行試驗，各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況如圖3所示。

圖3 各菌株利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.3 The fermentation of producing lipid situation of using crude glycerol of different strain

由圖3可知，對照組中，斯達油脂酵母各菌株的生物量和油脂產(chǎn)量均高于試驗組，說明各菌株對葡萄糖的利用程度高于粗甘油。試驗組中，菌株ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)與其它菌株相比均是最高的，分別為11.99 g/L、5.45 g/L、45.65%和17.27，但在對照組中，ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量低于1809和MM-17，說明菌株1809和MM-17對粗甘油的耐受程度低于ZW-25。故選擇斯達油脂酵母ZW-25作為后續(xù)試驗的菌株。

3.4 不同粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察粗甘油濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 斯達油脂酵母ZW-25利用不同濃度粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.4 The fermentation of producing lipid situation of using different crude glycerol concentration by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖4可知，斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨粗甘油濃度增加而逐漸增大，當(dāng)粗甘油濃度為55 g/L時，其生物量達最大值，為14.17 g/L；而油脂產(chǎn)量在粗甘油濃度為40 g/L時達最大值6.97 g/L，且其生物量高達13.79 g/L；當(dāng)粗甘油濃度為70 g/L時，菌體生物量和油脂產(chǎn)量開始降低，可能是由于粗甘油的濃度過高而影響細(xì)胞的滲透壓。此外，粗甘油濃度為40 g/L時，菌株的油脂含量和油脂系數(shù)最高，分別為50.52%和18.12。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂適宜的粗甘油濃度為40 g/L。

3.5 氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察氮源種類和濃度對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 斯達油脂酵母ZW-25利用不同氮源發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.5 The fermentation of producing lipid situation of using different nitrogen source by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖5可知，有機氮源為酵母粉時，斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標(biāo)均最高，其中生物量為13.77g/L，油脂產(chǎn)量為8.22g/L，油脂含量為59.74%，油脂系數(shù)為15.02；相比之下，在以蛋白胨為有機氮源時，其各項指標(biāo)略低；以尿素為有機氮源時，各項指標(biāo)偏低。

對無機氮源而言，以（NH4）2SO4作為無機氮源時，斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的各項指標(biāo)均最高，其中生物量為12.04 g/L，油脂產(chǎn)量為6.13 g/L，油脂含量為50.99%，油脂系數(shù)為15.01；以NH4Cl、NaNO3、NH4NO3作為無機氮源時，其各項指標(biāo)偏低，以NaNO3為無機氮源時，其發(fā)酵產(chǎn)油脂各項指標(biāo)最低。

故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的適宜氮源為：酵母粉+（NH4）2SO4。

3.6 不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

根據(jù)2.4中的方法考察不同碳氮比對斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，斯達油脂酵母ZW-25在低碳氮比（25～40）條件下培養(yǎng)時，菌體生長速度較快，生物量從8.91 g/L 上升至 13.79 g/L；菌株在高碳氮比（40～55）條件下培養(yǎng)時，生長速度較慢，生物量從13.79 g/L上升至14.17 g/L，但油脂產(chǎn)量較高；碳氮比為40時，油脂產(chǎn)量達6.97 g/L，說明高碳氮比利于菌株產(chǎn)油。當(dāng)碳氮比大于55時，菌株的生物量和油脂產(chǎn)量逐漸減少，可能是由于粗甘油濃度過高影響細(xì)胞的滲透壓，不利于菌株生長及產(chǎn)油。故斯達油脂酵母ZW-25發(fā)酵產(chǎn)油的適宜碳氮比為40，經(jīng)轉(zhuǎn)換可得：粗甘油濃度為40 g/L、酵母粉 0.5 g/L、（NH4）2SO42.0 g/L。

圖6 斯達油脂酵母ZW-25在不同碳氮比條件下發(fā)酵產(chǎn)油脂情況Fig.6 The fermentation of producing lipid situation under different carbon-nitrogen ratio by Lipomyces starkeyi ZW-25

3.7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程研究

根據(jù)2.5的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程進行研究，結(jié)果如圖7所示。

圖7 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂各指標(biāo)的變化情況Fig.7 The change of different index of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

由圖7可知，斯達油脂酵母ZW-25的生物量和油脂產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢，144h達最大值，分別為10.03 g/L、6.07 g/L；粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低，起始濃度從40 g/L逐漸下降至7.15 g/L；油脂含量在0～12 h上升較快，12 h達41.18%，隨后緩慢上升，到144 h達60.6%；油脂系數(shù)在0～60 h上升較快，60 h達14.12，隨后趨于平緩；隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯，0～12 h，pH值從起始的5.94下降至3.96，隨后發(fā)酵液pH值緩慢下降，到144 h下降至2.41，但在發(fā)酵期間，菌體的生長未出現(xiàn)減緩的趨勢，說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

3.8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析

根據(jù)2.7的方法對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成進行分析，結(jié)果如圖8和表2所示。

由圖8和表2可知，斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂中含多種脂肪酸，其中含量最高的為油酸，其次是棕櫚酸，兩種脂肪酸占總脂肪酸的89.5%，由此可見其利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主，可作為新的油源使用。

圖8 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的氣相色譜圖Fig.8 The gas chromatogram of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

表2 斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的脂肪酸組成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

4 結(jié)論

1）通過平板培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵的方法從斯達油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07中篩選出利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的高產(chǎn)菌株ZW-25。

2）碳源和氮源對斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂有較大影響，培養(yǎng)基中適宜的C/N為40，適宜的碳源氮源組成為：粗甘油濃度40 g/L，酵母粉 0.5 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L。此條件下，其生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)分別可達13.79、6.97 g/L、50.52%和18.12。

3）斯達油脂酵母ZW-25的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)隨發(fā)酵時間的延長呈逐漸上升趨勢，144 h達最大值；粗甘油濃度隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低；隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH值下降趨勢明顯，但菌體生長未出現(xiàn)減緩趨勢，說明菌株對發(fā)酵液pH值的變化具有較強的耐受性。

4）斯達油脂酵母ZW-25利用粗甘油發(fā)酵所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸為主，其中油酸和棕櫚酸含量較高，分別為58.58%和30.92%，可作為功能性油脂的油源。

綜上所述，斯達油脂酵母ZW-25具有利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)油脂的應(yīng)用潛力，研究結(jié)果可為粗甘油的綜合利用開辟新的途徑。