菲牛蛭營養(yǎng)成分分析與評價

戚敏，楊秀娟，陶琳麗，陳琛，曹勝雄，劉廷丹，張曦

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis），別名馬尼擬醫(yī)蛭，俗名金邊（銅邊）螞蟥，屬醫(yī)蛭科，牛蛭屬，廣泛分布于我國廣西、廣東、海南等地區(qū)[1-2]。菲牛蛭是水蛭的一種，而水蛭是一味傳統(tǒng)動物藥，初載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有破血、通經(jīng)、散瘀的功能；主治血瘀經(jīng)閉腹痛、癥瘕積聚，跌打損傷[3]。菲牛蛭不僅具有抗凝血的效果、還具有抗血栓、抗腫瘤、抗炎、降血脂、以及治療心腦血管疾病的功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，動物藥中的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)不僅是營養(yǎng)成分，大多數(shù)被科學(xué)證實(shí)是動物藥中的特效成分[5]。脂肪酸，礦物元素也具有特定的營養(yǎng)價值與生理功能。近年來，由于人們對心血管藥物的迫切需求，人們開始重視對菲牛蛭等吸血蛭類的研究，但研究主要集中于菲牛蛭有效物質(zhì)的分離鑒定以及作用機(jī)理，對于其蛭體成分分析較少。因此，本試驗(yàn)對菲牛蛭蛭體常規(guī)營養(yǎng)成分、氨基酸組成、脂肪酸組成及礦物元素組成進(jìn)行測定與分析，為菲牛蛭資源及營養(yǎng)保健食品、藥品的開發(fā)利用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由云南海瑞迪生物制藥有限公司提供的成體引種菲牛蛭作為試驗(yàn)素材，將活體菲牛蛭進(jìn)行稱重后置于-20℃條件下迅速致死，再放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)去除水分，進(jìn)行水分測定，樣品經(jīng)粉碎機(jī)打成粉末后備用。檢測前，將樣品再次放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)制備為絕干樣。

1.2 主要儀器及試劑

LC-20AT高效液相色譜儀、GC-2014高效氣相色譜儀、AA-6880F原子吸收分光光度計(jì)：日本島津（中國）有限公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；索氏抽提器：云南省科儀化玻有限公司；JK9830自動凱氏定氮儀：濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐：上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。甲醇（優(yōu)級純）、乙腈（色譜純）：tedia company.USA；18種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國NU-CHEKPREP公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)組成測定

水分含量測定采用冷凍干燥法。

水分含量X/%=[（Mb-Ma）-（Mc+Md）/2]/（Mb-Ma）×100

式中：Ma為自封袋的袋重，g；Mb為新鮮樣品+自封袋的總重，g；Mc、Md為凍干后無水分的樣品和袋的總重，g。

粗蛋白含量測定使用凱氏定氮法，參照GB/T 9695.11-2008《肉及肉制品氮含量測定》。粗脂肪含量測定，使用索氏抽提法測定，參照GB/T 9695.7-2008《肉及肉制品總脂肪含量測定》。粗灰分含量測定，使用干灰化法測定，參照GB/T9695.18-2008《肉及肉制品總灰分測定》。

1.3.2 氨基酸含量測定

氨基酸測定，使用高效液相色譜法進(jìn)行檢測。

樣品前處理：取0.3 g絕干樣品，采用酸水解法對樣品進(jìn)行水解，水解后使用0.02 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，取200 μL樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液置于1.5 mL離心管內(nèi)，分別加入三乙胺乙腈溶液100 μL、異硫氰酸苯脂乙腈溶液100 μL至每個離心管中，混勻，室溫靜置1小時后加入正己烷400 μL至各離心管，震蕩后靜置 10 min。取下層溶液（PTC-AA）200 μL，加 800 μL超純水稀釋，搖勻，用0.22 μm針筒式濾膜至自動進(jìn)樣品瓶中。

分析條件為色譜柱：博納艾杰爾Venusil氨基酸分析專用柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）流動相流速為1.00 mL/min；洗脫梯度見表 1；柱溫：40.0 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測波長：254 nm。

表1 流動相梯度Table 1 The mobile phase gradien

1.3.3 脂肪酸含量測定

脂肪酸測定，采用高效氣相色譜法進(jìn)行測定。

樣品前處理：采用硫酸-甲醇酯化法進(jìn)行樣品前處理，稱取1 g～2 g左右的樣品置于25 mL雞心瓶中，加入10 mL濃度為10%硫酸甲酯液，在水浴鍋上70℃回流1 h，室溫冷卻后，加2 mL正己烷萃取，充分震蕩，取上清液經(jīng)0.22 μm針筒式濾膜過濾后備測。

分析條件為色譜柱：RtR-2560（100 mm×0.25 mm×0.2 μm）。載氣：高純氮?dú)?。氣體流量：氮?dú)?0 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。柱溫：240℃進(jìn)樣口（Split，SPL）溫度：240℃。分流比：10.0。氫離子火焰檢測器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度：250℃。色譜柱升溫程序：起始溫度110℃，保留3 min；然后以4℃/min升溫至240℃，保持50min。進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.4 礦物元素含量測定

礦物元素測定，使用元素采用原子吸收分光光度法測定。

樣品前處理：樣品灰化完全后加入體積比為1∶1鹽酸溶液2.5 mL溶解，并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，鈣含量的測定使用氯化鑭溶液定容，其他用去離子水定容，隨機(jī)將定容好的試樣液先用快速定性濾紙過濾，然后將濾液再用0.22 μm水系濾膜過濾，得到濾液用于鈣、鐵、鋅、銅元素的測定；從上述濾液中準(zhǔn)確吸取80 μL于10 mL容量瓶中，用去離子水定容后用于鎂元素測定。

原子吸收光光度計(jì)工作條件詳見表2。

表2 原子吸收分光光度計(jì)工作條件Table 2 Atomic absorption spectrophotometer’s working conditions

1.4 氨基酸營養(yǎng)評價方法

采用氨基酸比值系數(shù)法進(jìn)行氨基酸營養(yǎng)評價[6-8]：根據(jù)1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出的人體必需氨基酸模式與雞蛋全蛋氨基酸模式[9]，通過公式（1）、（2）、（3）分別計(jì)算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系數(shù)（ration coefficient of amino acid，RCAA）、氨基酸比值系數(shù)分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA），其中CV為RCAA的變異系數(shù)。根據(jù)計(jì)算結(jié)果對菲牛蛭氨基酸營養(yǎng)價值進(jìn)行對比和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)營養(yǎng)測定結(jié)果與分析

菲牛蛭4種常規(guī)營養(yǎng)測定結(jié)果見表3。

表3 菲牛蛭4種常規(guī)營養(yǎng)成分（鮮樣）Table 3 Four kinds of routine nutritional components of Poecilobdella manillensis（fresh sample） %

由表3可知，鮮體菲牛蛭粗蛋白含量為16.70%、粗脂肪為1.35%、灰分為1.33%、水分含量為80.55%。常見禽蛋粗蛋白含量約為12%，魚蝦約為17%、瘦肉約為20%；常見肉類脂肪含量約為2.3%～11.8%[10]。菲牛蛭粗蛋白高于禽蛋、低于瘦肉、與魚蝦粗蛋白含量相近，脂肪含量低于常見肉類。豬、牛、羊3種哺乳動物血液中的粗蛋白含量約為17%～18%、粗脂肪含量約為0.3%～0.4%、灰分含量0.8%～1.1%、水分含量約為80%[11]。菲牛蛭蛭體粗蛋白與水分含量與這3種動物血液十分接近，而粗脂肪與灰分含量略高于3種動物血液，從常規(guī)營養(yǎng)的角度來看，菲牛蛭粗蛋白含量與魚類相當(dāng)，營養(yǎng)成分與家畜血液相近。

2.2 氨基酸測定結(jié)果與分析

菲牛蛭17種氨基酸測定結(jié)果見表4。

表4 菲牛蛭與其他4種水蛭的17種氨基酸含量（絕干樣）Table 4 The amount of 17 amino acids in the Poecilobdella manillensis and the other 4 hirudos（dry sample） %

由表4可知，試驗(yàn)所測定的菲牛蛭17種氨基酸總量（TAA）為66.09%，其中必需氨基酸（EAA）含量為24.37%，非必需氨基酸含量（NEAA）為41.72%。與日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥[12]和寬體金線蛭[13]4種水蛭相比，菲牛蛭TAA、EAA、NEAA含量最高。蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值不僅取決于氨基酸含量高低，還取決于必需氨基酸的組成比例[14]。本研究中，菲牛蛭EAA/TAA的值為36.87%，接近于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)中40%的推薦值，EAA/NEAA為58.41%，接近FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)中60%的推薦值，具有良好的氨基酸組成比，說明菲牛蛭氨基酸組成比例平衡，營養(yǎng)價值高。

自然界中的氨基酸有20多種，其中天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、精氨酸9種氨基酸在一般植物中含量少，且有些人體內(nèi)不能合成，是維持機(jī)體氮平衡所必須的，稱為藥用氨基酸（MAA）[15]。谷氨酸是哺乳動物腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，天冬氨酸在預(yù)防心臟病、高血壓等疾病起到重要作用；在醫(yī)學(xué)上谷氨酸、天冬氨酸用于降低血氨，消除自由氨的毒性作用，保護(hù)肝臟以及心臟，恢復(fù)其功能[16-17]。而賴氨酸是一種人體必需氨基酸，能夠促進(jìn)人體大腦神經(jīng)再生性細(xì)胞的合成、增進(jìn)食欲[18]、治療出血性腦血管病[19]，是以谷物為主食人群的最為缺乏的氨基酸[20]。亮氨酸可以平衡機(jī)體能量代謝功能，對于肥胖癥、高血脂癥具有防治作用[21]。菲牛蛭蛭體的谷氨酸含量最高，為9.97%，其次為天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸，MAA含量為43.44%占TAA總量的65.73%，菲牛蛭MAA含量高，菲牛蛭所具有的預(yù)防與治療心血管疾病及降血脂的功效或許與MAA高含量的特點(diǎn)有關(guān)。此外，菲牛蛭含量最高的5種氨基酸均為MAA，結(jié)果與日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥[12]的測定結(jié)果一致，但與寬體金線蛭[13]不同。且李軍[22]、丁月珠[23]測定數(shù)種水蛭抗凝血效果時發(fā)現(xiàn)：菲牛蛭抗凝血效果最佳；菲牛蛭、日本醫(yī)蛭等吸血蛭類抗凝血效果遠(yuǎn)高于非吸血蛭類的寬金線蛭。菲牛蛭等吸血蛭類的抗凝血效果或許與其氨基酸組成具有一定關(guān)系。

兩種參考模式下菲牛蛭的氨基酸營養(yǎng)評定結(jié)果見表5。

表5 兩種參考模式下菲牛蛭的RAA、RCAA和SRCAA（凍干粉）Table 5 RAA，RCAA and SRCAA of Poecilobdella manillensis in the FAO/WHO pattern and the whole egg reference pattern（freezedried powder）

根據(jù)氨基酸比值系數(shù)法計(jì)算出的RCAA值越接近1，說明該蛋白的氨基酸越接近所對比模式氨基酸，當(dāng)RCAA＞1時，說明該必須氨基酸相對過剩，當(dāng)RCAA＜1時，說明該必須氨基酸相對不足；若某種蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，比例合理，越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，則說明該蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高，能提供人體營養(yǎng)需求[7]。通過表5可知，在FAO/WHO模式下，除賴氨酸與蛋氨酸+半胱氨酸外，菲牛蛭蛭體蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的RCAA值都十分接近1，說明其氨基酸組成較為均衡。在全蛋模式下，菲牛蛭的蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸的RCAA值相對低于全蛋模式，賴氨酸高于全蛋模式，其余氨基酸接近于全蛋模式。菲牛蛭的氨基酸模式更加接近于FAO/WHO模式，且FAO/WHO模式的SRCAA評分高于全蛋模式。無論在FAO/WHO模式還是在全蛋模式下，菲牛蛭的第一限制性氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸。

2.3 脂肪酸測定結(jié)果與分析

菲牛蛭18種脂肪酸測定結(jié)果見表6。

表6 菲牛蛭18種脂肪酸含量（絕干樣）Table 6 The contents of 18 fatty acids in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表6可知，試驗(yàn)所測定的18種脂肪酸總量為27.86 mg/g，飽和脂肪酸（SFA）含量為 12.92 mg/g，不飽和脂肪酸（USFA）含量為15.13 mg/g，必需脂肪酸含量為5.49 mg/g。SFA中的月桂酸和肉豆蔻酸含量與血液中膽固醇的含量呈顯著正相關(guān)，被認(rèn)為是導(dǎo)致冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的主要因素，而棕櫚酸能降低血清中的膽固醇含量[24]，硬脂酸能有效降低血栓和動脈硬化發(fā)病概率[25]，調(diào)節(jié)膽酸生成[26]，有利于身體健康。菲牛蛭的月桂酸、肉豆蔻酸含量極低，棕櫚酸、硬脂酸含量高，占18種脂肪酸總量的40%左右，從SFA的角度來評價，菲牛蛭的SFA是有益的。USFA由MUFA與PUFA共同構(gòu)成，MUFA具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心臟等功效，其中最具代表性的油酸能夠保護(hù)脂蛋白免受氧化，防止動脈損傷[27]；PUFA具有抗心血管疾病、降低血脂、抗癌以及促進(jìn)生長的作用，畜禽肉中的PUFA含量較少，尤其缺乏亞油酸、亞麻酸[28-30]。菲牛蛭USFA占18種脂肪酸總量的50%以上，雖然幾乎不含亞麻酸，但油酸、亞油酸含量達(dá)5.93 mg/g、2.68 mg/g，有益脂肪酸含量較豐富，對人體心腦血管健康具有積極作用。

2.4 礦物元素測定結(jié)果與分析

菲牛蛭5種礦物元素測定結(jié)果見表7。

表7 菲牛蛭5種礦物元素含量（絕干樣）Table 7 The contents of 5 mineral elements in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表7所示，菲牛蛭5種礦物元素總量為16.804 mg/g，其中人體常量元素鈣、鎂元素含量分別為12.044、2.357 mg/g，人體微量元素鐵、鋅、銅含量分別為 1.015、1.362、0.026 mg/g，鈣元素含量最高，5 種礦物元素含量呈現(xiàn)鈣＞鎂＞鋅＞鐵＞銅的規(guī)律。菲牛蛭礦物元素的含量與規(guī)律同方富永[31]、苗艷麗[32]研究的結(jié)果一致。鈣、鎂元素不僅構(gòu)成機(jī)體骨骼，同時也是多種酶的激活因子；鐵是動物血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素和多種酶的重要組成成分，在呼吸與生物氧化過程中起重要作用；鋅是機(jī)體多種酶的構(gòu)成與激活劑，對動物大腦功能、機(jī)體免疫功能、動物機(jī)體繁殖性能有重要的影響；銅在機(jī)體內(nèi)生化功能為催化作用，參與人體氧化還原作用，具有維持正常造血功能、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康的功能[33-34]。菲牛蛭礦物元素含量高，對人體健康具有積極作用。

中藥的微量元素含量與其藥效關(guān)系密切[34]。試驗(yàn)所測定的菲牛蛭鐵、鋅、銅元素含量均高于決明子、三七、紅花[36]等8味治療心血管疾病中草藥含量，高于龍葵、白英、昆布[37]等7味抗癌中草藥含量，同時高于同為水蛭類的日本醫(yī)蛭、螞蟥、柳葉螞蟥及金邊螞蟥（寬體金線蛭）[38]的含量。研究證明，菲牛蛭的抗凝血效果優(yōu)于日本、歐洲醫(yī)蛭、優(yōu)于寬體金線蛭[22-23]。一些蛋白質(zhì)不僅由氨基酸構(gòu)成，還由非氨基的礦物元素、糖類、酯類等組分一同構(gòu)成，菲牛蛭抗凝血效果優(yōu)于其他水蛭，其活性蛋白含量與構(gòu)成可能與其高礦物質(zhì)的特點(diǎn)有關(guān)，這有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

菲牛蛭粗蛋白含量為16.7%、灰分為1.33%、粗脂肪為1.35%、水分含量為80.55%。菲牛蛭氨基酸TAA的值為66.09%，EAA為24.37%，NEAA為41.72%，氨基酸組成比例平衡；其中EAA/TAA的值為36.87%，EAA/NEAA為58.41%，符合FAO/WHO推薦值，具有良好的氨基酸組成比；MAA含量為43.44%，MAA/TAA為65.73%，藥用氨基酸含量高；菲牛蛭的氨基酸模式接近于FAO/WHO模式，氨基酸評分好。菲牛蛭棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸含量豐富，USFA占18種脂肪酸總量的50%以上，有益于心腦血管健康。菲牛蛭富含人體所需的鈣、鎂、鐵、鋅、銅5種礦物元素，礦物元素含量較一般中草藥高。菲牛蛭營養(yǎng)豐富，營養(yǎng)組成極具特點(diǎn)，可以根據(jù)菲牛蛭營養(yǎng)特點(diǎn)進(jìn)行保健食品以及藥品的開發(fā)。