辣木葉多糖MLP100-3的提取純化與體外抗炎活性研究

崔璨， 王欣宇， 苑廣偉， 劉澤平， 陳曉陽， 王磊,

(1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院制藥工程系， 廣東 廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省木本飼料工程技術(shù)研究中心， 廣東 廣州 510642)

辣木，也被稱為“鼓槌樹”、“辣根樹”，是廣泛分布于亞洲、非洲西部和喜馬拉雅地區(qū)的一種喬木[1]. 辣木對降雨量和生長土壤有較強的適應(yīng)性、能耐長期干旱、通過種子或扦插繁殖，生長很快且營養(yǎng)豐富.辣木又被稱為“奇跡樹”， 因為它幾乎所有的組織部位都具有顯著的營養(yǎng)與藥用價值.研究表明，辣木葉富含蛋白質(zhì)、氨基酸類、脂肪、酚類以及一些必需礦物質(zhì)，辣木根可被開發(fā)為口香糖，辣木花及種子是黃酮醇、硫代氨基甲酸糖苷以及其他能量的良好來源.近年來，培育優(yōu)良辣木品種，探索豐產(chǎn)栽培措施、研究辣木有效成分活性和開發(fā)高附加值的產(chǎn)品逐步成為人們研究的熱點.辣木是一種具有營養(yǎng)和藥用價值的可食用植物[2].越來越多的研究顯示，辣木葉、果實、莖、花和種子在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出較強的降血糖、抗氧化、抗炎抑菌、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的活性[3-5].尤其是富含蛋白質(zhì)、氨基酸、鈣、鉀等微量元素的辣木葉更是在人類飲食以及炎癥治療等方面得到了廣泛的應(yīng)用.

近年來，植物多糖因其抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等活性受到了人們越來越多的關(guān)注[6-8].多糖的生物活性比如抗氧化活性與其糖組分、分子結(jié)構(gòu)和單糖分支長度有關(guān)[6, 9-11].多糖作為辣木的重要組成部分，近年來得到了廣泛的研究，Waterman等[12]通過研究證實辣木葉水提物能夠顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7中炎癥標(biāo)志物的基因表達(dá)水平.還有研究證明辣木籽水提物能夠通過減少小鼠巨噬細(xì)胞中NO和細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β來發(fā)揮抗炎作用，降低小鼠體內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)量，同時也減少髓過氧化物酶的活性[13].但是，關(guān)于辣木葉多糖抗炎活性的相關(guān)研究尚未見報道.

本研究利用水提醇沉法從辣木葉中提取得到水溶性粗多糖，采用Sevag法進行脫蛋白處理，然后分別經(jīng)過分級醇沉、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析和透析處理對提取得到的辣木葉粗多糖進行純化，得到純化的辣木葉多糖組分MLP100-3.采用傅里葉紅外光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法以及核磁共振光譜法對MLP100-3的結(jié)構(gòu)以及單糖組成進行初步的鑒定.同時用LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7建立體外炎癥細(xì)胞模型，通過測定細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介質(zhì)-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量評價辣木多糖MLP100-3對巨噬細(xì)胞NO以及炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平的影響.結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的結(jié)果，驗證辣木多糖MLP100-3是否能夠在mRNA水平上對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA和TNF-α mRNA發(fā)揮抑制作用，為辣木多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的辣木葉采自廣東省徐聞縣辣木種植合作社的辣木基地.收集新鮮的辣木葉，烘干，研磨成粉末，過60目篩，備用.

1.2 試劑

無水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚、濃硫酸、氯化鈉溶液、重水、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、碘甲烷、三氯甲烷、焦炭酸二乙酯(DEPC)、二甲基亞砜(DMSO)、三氟乙酸(TFA)、單糖標(biāo)準(zhǔn)品、硼氫化鈉.以上試劑均為分析純.

1.3 儀器

低溫離心機：Eppendorf,5810R；多功能酶標(biāo)儀：PerkinElmer, HH3400；水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海一恒科學(xué)儀器有限公司，RE-5203; 真空冷凍干燥機：西盟國際公司，Sim FD8-6P；水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；傅立葉變換紅外光譜儀：BRUKER 德國，VERTEX 70；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)：島津，日本，GCMS-QP2010 Ultra；核磁共振光譜儀：BRUKER 德國，NMR 600MHz等.

1.4 方法

1.4.1 辣木葉多糖的提取

稱取100 g 辣木葉粉末，按照1∶20的料液比加入2 000 mL水，煮沸3 h，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)3次.將收集到的液體置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，待懸蒸至50 mL時取出，加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃下沉淀過夜.6 500 r/min離心10 min，去上清，將沉淀充分復(fù)溶，采用Sevag法除蛋白[14].向復(fù)溶后的多糖溶液中加入Sevag溶液(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，混合搖勻30 min， 靜置20 min， 將上層溶液吸出，置于新的離心管內(nèi)，繼續(xù)加入Sevag溶液，至少重復(fù)3次，直至無白色絮狀沉淀出現(xiàn). 將沉淀置于57 ℃烘箱中12 h，取出稱質(zhì)量.

1.4.2 辣木葉多糖的分離純化

將辣木葉粗多糖充分復(fù)溶，將其質(zhì)量濃度稀釋為5 mg/mL，以2 mg/mL的質(zhì)量濃度上樣到DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，然后以dH2O與NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L的溶液為洗脫液，以1 mL/min的流速進行洗脫，收集洗脫液，每管收集1 mL，同時采用苯酚-硫酸法測定各收集管洗脫液的多糖濃度.以洗脫管號為橫坐標(biāo)，以各洗脫管的多糖濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線.然后將各洗脫組分溶液用透析袋進行透析處理(相對分子量為3 500).

1.4.3 辣木葉多糖濃度的測定

采用硫酸-苯酚法測定多糖的含量[15]， 50 μL多糖樣品中加入150 μL濃硫酸，混勻后加入30 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚， 90 ℃下水浴加熱5 min，接著冷水浴5 min終止反應(yīng). 490 nm下測定吸光度值.根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品多糖濃度.

1.4.4 辣木葉多糖結(jié)構(gòu)的初步鑒定

(1)辣木葉多糖的傅里葉紅外光譜鑒定 將純化得到的MLP100-3多糖組分置于真空冷凍干燥箱內(nèi)進行冷凍干燥處理，稱取1.0～2.0 mg的MLP100-3多糖樣品，與200.0 mg的溴化鉀充分混合均勻，充分研磨1～2 min，使用壓片機將混合物壓制成透明薄片，置于傅立葉變換紅外光譜儀進行測定[16].

(2)辣木葉多糖的單糖組成測定 準(zhǔn)確稱取冷凍干燥的MLP100-3辣木葉多糖10 mg，充分溶解于3 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸中，100 ℃熱水浴中孵育6 h，然后用氮吹儀于60 ℃下吹干.加入少量甲醇減壓蒸干以除盡三氟乙酸.然后加入10 mg的鹽酸羥胺和0.7 mL的吡啶，90 ℃孵育30 min，冷卻后再加入1 mL乙酸酐，90 ℃孵育30 min，冷卻，取出上清液，減壓濃縮至干.使用1 mL氯仿溶解乙?；a(chǎn)物，然后取出0.2 μL進行GC-MS分析[17].

GC-MS分析條件：從160 ℃開始，以2 ℃/min線性升到210 ℃.柱流量為1.0 mL/min，載氣為氦氣，進樣口溫度為250 ℃；質(zhì)譜條件：EI源；離子源溫度為250 ℃；掃描范圍：33～550 aum；分流比為50 ∶1.

(3)辣木葉多糖的核磁共振光譜測定 將30 mg干燥的辣木葉多糖MLP100-3充分溶解于0.5 mL的二氧化氘(重水)，然后轉(zhuǎn)移至核磁管，于600 M超導(dǎo)核磁共振波譜儀(25 ℃或80 ℃)分別做1H和13C波譜檢測.

1.4.5 辣木葉多糖的體外抗炎活性評價

(1)辣木葉多糖對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響 RAW264.7細(xì)胞以1×104/孔接種于96板中，于37 ℃、體積分別為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清.每孔加入100 μL的辣木葉多糖MLP100-3(質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL)，同時設(shè)置空白組、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)陽性對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)24 h，棄上清，輕輕地用PBS清洗兩遍，每孔加入100 μL終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液.置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出棄上清，PBS緩慢清洗1遍，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，490 nm下測定吸光度值，重復(fù)3次.細(xì)胞存活率按以下公式計算：

細(xì)胞存活率(%)=樣品組OD值/空白組OD值×100%

(2)辣木葉多糖的抗炎活性測定 LPS是一種脂多糖，它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì).本實驗采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞作為體外炎癥細(xì)胞模型，以此研究辣木多糖的抗炎作用.采用Griess法對細(xì)胞上清液中的NO含量進行測定.收集對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，每孔加入100 μL的辣木葉多糖MLP100-3(質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL)，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/mL，同時設(shè)置空白組與LPS陽性對照組，每組平行操作3次，預(yù)先培養(yǎng)2 h.然后加入LPS，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取50 μL細(xì)胞上清液，分別加入等量的Griess I和Griess II試劑，混合均勻，孵育10 min，550 nm處測定吸光度值.以NaNO2為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各組細(xì)胞上清液中NO的濃度.同時，利用ELISA法分別測定細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量.

(3)辣木葉多糖對炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)液將其稀釋成1×106/mL，接種于12孔板中，每孔加入100 μL的辣木葉多糖MLP100-3(質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL)，同時設(shè)定空白組和LPS刺激對照組，培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)2 h，然后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)定3組重復(fù).

按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Ex tration Kit試劑盒說明分別對各組收集的細(xì)胞進行總RNA的提取.然后使用SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)進行反轉(zhuǎn)錄，最后按照試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)的操作說明進行RT-PCR的操作(表1).

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉多糖的提取及離子交換柱層析分離

本文采用水提醇沉法從辣木葉中提取得到辣木葉粗多糖，并采用Sevag法去除蛋白質(zhì)，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化，得到洗脫曲線(圖1).DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析分離過程中，以dH2O及NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L的溶液為洗脫液， 每個洗脫組分收集10管，每管1 mL.收集濃度0.4 mol/L NaCl洗脫的辣木葉多糖組分，命名為MLP100-3，將MLP100-3組分進行透析處理，然后置于真空冷凍干燥機內(nèi)進行冷凍干燥.

圖1 辣木葉多糖DEAE Sepharose Fast Flow 洗脫曲線

2.2 辣木葉多糖結(jié)構(gòu)的初步鑒定

2.2.1 辣木葉多糖的傅里葉紅外光譜測定

本研究采用1.4.3(3)所述方法對辣木葉多糖MLP100-3進行傅里葉紅外光譜的測定(圖2).

圖2 辣木多糖MLP100-3傅里葉紅外光譜圖

辣木多糖MLP100-3在波數(shù)(σ)3 407.81 cm-1處存在伸縮振動峰，可判定具有O-H構(gòu)型；2 937.10 cm-1處的伸縮振動峰為-CH的典型標(biāo)志；2 144.53 cm-1處則為累積雙鍵伸縮振動峰[18-19]；1 648.99 cm-1處的伸縮振動峰表明具有C=O的結(jié)構(gòu)；1 405.33 cm-1處為C-H伸縮振動峰[20]；1 240.38 cm-1和1 045.06 cm-1處的伸縮振動峰表明含有吡喃環(huán)的結(jié)構(gòu).在 1 750～1 700 cm-1之間沒有明顯的吸收峰出現(xiàn)，說明樣品中不含糖醛酸[21].

2.2.2 辣木葉多糖的單糖組成分析

用三氟乙酸將辣木葉多糖充分水解，然后使用鹽酸羥胺和吡啶將辣木葉多糖進行乙?；幚?，最后使用乙酸酐將產(chǎn)物進行乙?；幚碛糜贕C-MS分析.同樣的方法將7種標(biāo)準(zhǔn)單糖組分進行處理，相同條件下用于GC-MS分析，得到各標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰次序及時間(表2)，標(biāo)準(zhǔn)單糖以及辣木葉多糖組分MLP100-3的GC-MS圖譜(圖3、圖4).對比可知，辣木葉多糖組分MLP100-3中所含單糖種類以及比例，即MLP100-3的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它們之間的質(zhì)量比為1.3 ∶5.0 ∶4.0 ∶4.0 ∶6.3 ∶6.5.

表2 標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰時間表Table 2 Retention time of monosaccharide standards

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖GC-MS色譜圖

圖4 MLP100-3水解衍生物GC-MS色譜圖

2.2.3 辣木葉多糖的核磁共振光譜分析

本研究根據(jù)1.4.3(3)的方法對辣木葉多糖MLP100-3進行核磁共振光譜分析(圖5).由于所提取得到的MLP100-3溶解性較差，導(dǎo)致樣品含量沒有達(dá)到機器檢出限，無法得到13C的NMR圖譜，因而無法進行結(jié)構(gòu)的進一步鑒定.從MLP100-3的1H 圖譜可以初步判定：化學(xué)位移δ5.19～5.15之間的信號顯示MLP100-3中可能有α-Araf 端基質(zhì)子的存在；δ4.91～4.87之間的典型信號表明MLP100-3中可能存在β-Galp 或者α-GalpA端基質(zhì)子.

圖5 MLP100-3的1H NMR圖譜

2.3 辣木葉多糖的抗炎活性

2.3.1 辣木葉多糖對細(xì)胞增殖活性的影響

本研究采用MTT法測定辣木葉多糖MLP100-3對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響(圖6).

質(zhì)量濃度為12.5～50 μg/mL的MLP100-3多糖組分對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性無明顯影響，當(dāng)MLP100-3質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性表現(xiàn)出一定的抑制作用.

1)與空白組比較，P <0.05.

Fig.6 Effects of MLP100-3 on the proliferation ability of RAW264.7 cells

結(jié)果表明，低劑量的MLP100-3對巨噬細(xì)胞的增殖活性無明顯影響，當(dāng)MLP100-3的質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL以上時，會對細(xì)胞活性產(chǎn)生一定程度的抑制作用.

2.3.2 辣木葉多糖對RAW264.7炎癥細(xì)胞NO和細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

本研究采用Griess試劑法測定不同濃度的辣木葉多糖MLP100-3對LPS誘導(dǎo)的炎癥巨噬細(xì)胞RAW264.7中NO水平的影響(圖7).

A:亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線；B:Griess法測定MLP100-3對炎癥細(xì)胞NO分泌量的影響;與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01.

A:Standard curve of Nitrite; B:Effect of MLP100-3 on No Secretion of RAW264.7 cells by Griess; compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖7 辣木葉多糖MLP100-3對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

Fig.7 Effects of MLP100-3 on NO secretion of RAW264.7 cells by LPS

NO是炎癥發(fā)展過程中的一個重要信號分子，它參與生物體內(nèi)多種生命活動.首先，繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7A)，得到的線性方程為y=0.010x+0.044，R2=0.999.然后根據(jù)對應(yīng)的A值計算出各實驗組NO的質(zhì)量濃度，線性范圍是100 μmol/L(圖7B).正常狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO含量比較少，當(dāng)受到外來物如LPS刺激時，細(xì)胞會分泌產(chǎn)生大量的NO，進而導(dǎo)致機體炎癥的發(fā)生.質(zhì)量濃度25～200 μg/mL范圍內(nèi)MLP100-3能夠抑制巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生，當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時，抑制作用達(dá)到顯著水平(P<0.05).

采用ELISA法測定辣木葉多糖MLP100-3對炎癥細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌量的影響(圖8).

正常狀態(tài)下，RAW264.7巨噬細(xì)胞只產(chǎn)生少量的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，比如IL-6、IL-1β和TNF-α，只有在受到外界刺激時，炎癥細(xì)胞因子的分泌水平才會大幅度增加. 本研究用LPS誘導(dǎo)建立RAW264.7炎癥細(xì)胞，與空白組相比較，刺激組炎癥相關(guān)細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β和TNF-α的量均顯著增加，說明LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型是成功的.IL-6由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌，是一種功能多樣的細(xì)胞因子.與空白組相比較，LPS能夠顯著刺激巨噬細(xì)胞大量產(chǎn)生IL-6和IL-1β.但MLP100-3對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-1β沒有產(chǎn)生顯著的抑制作用(P>0.05).另外，在25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，MLP100-3可顯著抑制巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生(P<0.05或P<0.01).

2.3.3 辣木葉多糖對RAW264.7細(xì)胞中iNOS mRNA、COX-2 mRNA和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響

為進一步探究辣木葉多糖MLP100-3抗本研究采用熒光定量PCR的方法，測定MLP100-3對炎癥細(xì)胞中iNOS、COX-2以及TNF-α 的mRNA表達(dá)水平的影響(圖9).LPS能夠明顯提高巨噬細(xì)胞iNOS、COX-2以及TNF-α的mRNA的表達(dá)水平.不同質(zhì)量濃度的多糖作用于巨噬細(xì)胞24 h后，與LPS刺激組相比較，當(dāng)質(zhì)量濃度大于50 μg/mL時，MLP100-3對iNOS mRNA的表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.01)；當(dāng)質(zhì)量濃度大于100 μg/mL時，MLP100-3對TNF-α mRNA及COX-2 mRNA的表達(dá)水平均表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.01).

與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖8 辣木葉多糖MLP100-3對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-6(A)、IL-1β(B)和TNF-α(C)分泌量的影響

Fig.8 Effects of MLP100-3 on IL-6(A)、IL-1β(B)and TNF-α(C)secretion of RAW264.7 cells induced by LPS

3 討論

本文采用水提醇沉法從辣木葉中提取得到多糖，然后經(jīng)過分級醇沉、透析、陰離子交換柱層析等方法對辣木葉粗多糖進行進一步的分離純化，得到組分相對單一的辣木葉多糖MLP100-3.目前，辣木多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲輔助浸提法和稀酸堿提取法.熱水浸提法提取工藝簡單，容易操作，不僅能減少提取過程中對多糖的損傷，同時這種方法提取所得多糖還具有良好的水溶性，是提取植物多糖最常用的方法之一；另外，也可以使用稀酸稀堿溶液進行辣木多糖的提取，所提取多糖得率較高，但提取得到的多糖水溶性較差，并且酸堿法提取條件要求嚴(yán)格，較難達(dá)到預(yù)期效果；梁鵬等[22]以辣木莖葉為原料，優(yōu)化工藝為浸提時間120 min，浸提溫度80 ℃，料液比為1∶20，此種情況下，辣木粗多糖提取率可以達(dá)到5.66%.與之相比，本實驗所采用的熱水浸提法從辣木葉中提取粗多糖，其得率可達(dá)到11.24%，多糖的提取率明顯提升.結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，辣木多糖組分MLP100-3為較純的碳水化合物類物質(zhì)，無明顯雜質(zhì)的出現(xiàn).單糖組成分析表明，MLP100-3主要由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、半乳糖以及葡萄糖組成.

與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01.compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01.

圖9 辣木多糖MlP100-3對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生iNOS mRNA(A)、COX-2 mRNA(B)和TNF-α mRNA(C)水平的影響

Fig.9 Effects of MLP100-3 on iNOS mRNA(A)、COX-2 mRNA(B)and TNF-α mRNA (C)level of RAW264.7 cells induced by LPS

另外，本課題還將純化得到的辣木葉多糖組分應(yīng)用于LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型中.測定辣木葉多糖MLP100-3對炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的NO及炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α生成的影響，本研究發(fā)現(xiàn)從辣木葉中提取得到的多糖組分MLP100-3能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的RAW264.7炎癥細(xì)胞上清中NO及炎癥細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生.而機體內(nèi)NO的產(chǎn)生又依賴于細(xì)胞內(nèi)iNOS及COX-2的表達(dá)，由此推測辣木葉多糖MLP100-3是否可以通過抑制iNOS mRNA以及COX-2 mRNA的表達(dá)而減少NO的生成；結(jié)合RT-PCR檢測結(jié)果可以得出，辣木葉多糖MLP100-3能夠在轉(zhuǎn)錄水平上通過抑制iNOS mRNA和COX-2 mRNA從而發(fā)揮抗炎活性.除此之外，MLP100-3還能夠顯著抑制炎癥細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)水平而抑制TNF-α的分泌量.

NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)分為4個階段，即潛階段、誘導(dǎo)階段、應(yīng)答階段和消退階段.在誘導(dǎo)階段，NF-κB會誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)的促炎因子、趨化因子及次級炎癥介質(zhì)的酶，例如環(huán)氧合酶和誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶.并且NF-κB同時還會誘導(dǎo)產(chǎn)生部分蛋白比如TNF-α，進一步激活NF-κB而擴大炎癥反應(yīng).TNF-α可以促進T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子促進炎癥反應(yīng)，NO可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物和破壞致病生物大分子，它們都是主要的炎癥因子.從實驗結(jié)果中可以推測，MLP100-3可能通過下調(diào)機體內(nèi)iNOS mRNA、COX-2 mRNA和TNF-α mRNA的表達(dá)水平而抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路激活，最終發(fā)揮抗炎活性.而LPS 刺激機體產(chǎn)生的連鎖式炎癥級聯(lián)反應(yīng)是極其復(fù)雜的一個過程，信號通路的存在，給炎癥反應(yīng)的治療提供了可選擇的靶點，關(guān)于辣木葉多糖MLP100-3具體是在哪個靶點以及如何在特定靶點上發(fā)揮抗炎活性需要更進一步的探究與論證.