CDX2基因通過NF-κB信號通路抑制結(jié)腸癌細胞增殖

陳 鱗 王恩湘 劉群友 鐘 鷹 周國良 趙喜雁

近年來由于基因、蛋白質(zhì)等生物工程的發(fā)展使得結(jié)腸癌在早期診斷和治療方面有了新的突破，但結(jié)腸癌仍居我國各類惡性腫瘤死亡原因的前五位[1]，其發(fā)生發(fā)展涉及到多種抑癌基因的失活和致癌基因的激活等復雜過程，目前對其發(fā)病機制還不是完全清楚。尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2(Caual type homobox transcription factor 2，CDX2)是同源盒基因(Homobox genes，Hox genes)家族中的成員，不僅能調(diào)節(jié)腸上皮細胞的增殖、分化以及維持腸上皮細胞的表型，而且對消化道上皮細胞的發(fā)育起著關(guān)鍵作用[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)CDX2的功能涉及腫瘤細胞周期、凋亡、增殖、遷移、侵襲，提示CDX2基因在腫瘤中起重要的作用[3-5]。CDX2基因是否與結(jié)腸癌細胞增殖和cyclin D1、核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路有關(guān)，目前尚不清楚。本研究旨在探討結(jié)腸癌HT-29細胞過表達CDX2基因前后HT-29細胞增殖能力變化及與NF-κB信號通路的關(guān)系。為揭示CDX2抑制結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞株HT-29細胞購自中科院上海細胞所。用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶放置于37℃、充分飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.1.2 試劑 RT-PCR試劑購自美國Invitrogen公司；CDX2為兔抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋有限公司；G418購自美國AMRESCO公司；NF-κB抗體、p-NF-κB抗體購自CST公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-CDX2、空載體pcDNA3.1由本校實驗室長期保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染 實驗陽性對照組：正常結(jié)腸黏膜；未轉(zhuǎn)染組：HT-29細胞；空白質(zhì)粒組：pcDNA3.1/HT-29細胞；轉(zhuǎn)染組：pcDNA3.1-CDX2/HT-29細胞。具體轉(zhuǎn)染方法：細胞轉(zhuǎn)染與篩選在6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至達到80%左右細胞融合度；以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑分別介導1.2 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CDX2和陰性對照空白質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HT-29細胞。細胞轉(zhuǎn)染9 h后換液，轉(zhuǎn)染24 h后，按照1∶4傳代，接種于24孔板中，待細胞貼壁生長后用G418進行抗性克隆篩選，直至獲得穩(wěn)定的細胞株，分別獲得pcDNA3.1-CDX2/HT-29細胞、pcDNA3.1/HT-29細胞。

1.2.2 RT-PCR 實驗在35 mm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)pcDNA3.1/HT-29細胞及pcDNA3.1-CDX2/HT-29細胞和HT-29組細胞，按照TRIzol說明書提取總RNA。應(yīng)用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。CDX2引物F：5′-CTACATCACCATCCGGAGGAA-3′，R：5′-CTCCTTTGCTCTGCGGTTCT-3′；產(chǎn)物大小339 bp；β-actin引物F：5′-ACACCCCAGCCATGTACGTT-3′，R：5′-CGTCACCGGAGTCCATCAC-3′；產(chǎn)物大小598 bp。取3 μL cDNA按常規(guī)操作進行PCR產(chǎn)物擴增，并使用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 Western blot分析 分別選取轉(zhuǎn)染實驗處理的細胞，細胞裂解液提取總蛋白，用BCA法進行蛋白量測定，取40 g用不連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，麗春紅S染色，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CDX2抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體和β-actin抗體，均按1∶200稀釋，4℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育4 h，然后用Millipore發(fā)光液顯色。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖 分別選取對數(shù)生長期的3組細胞，以1×104個/孔的細胞密度接種于96孔板中。分別在培養(yǎng)0，1，2，3，4，5，6，7 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶充分溶解，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值。以接種當天MTT吸光度值為起始點，以時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.5 流式細胞儀分析 分別選取對數(shù)生長期的3組細胞，用70%乙醇固定，放置-20℃冰箱中過夜，PBS洗2遍，依次加入50 μg/mL碘化丙啶和1 mg/mL RNaseA，室溫避光孵育30 min后進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染CDX2基因?qū)T-29細胞CDX2 mRNA的影響

RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組pcDNA3.1-CDX2/HT-29于339 bp有明顯的條帶，而未轉(zhuǎn)染組HT-29和空白質(zhì)粒組pcDNA3.1/HT-29在該位呈低表達，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株pcDNA3.1-CDX2/HT-29存在CDX2 mRNA的過表達(P<0.05)，并且與正常結(jié)腸黏膜細胞比較，CDX2 mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖1)。

2.2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染CDX2基因?qū)T-29細胞CDX2蛋白的影響

以未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組為對照，轉(zhuǎn)染組pcDNA3.1-CDX2/HT-29細胞中CDX2蛋白表達水平明顯增加88%(P<0.05)，并且與正常結(jié)腸黏膜細胞比較，CDX2蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖2)。

2.3 過表達CDX2基因?qū)T-29細胞生長的影響

MTT結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組HT-29和空白質(zhì)粒組pcDNA3.1/HT-29相比，轉(zhuǎn)染組pcDNA3.1-CDX2/HT-29增殖受到抑制，細胞生長速度逐漸下降，其中48 h和72 h細胞生長抑制率分別為27.8%、33.4%(P<0.05)(表1，圖3)。

圖1 轉(zhuǎn)染CDX2基因?qū)T-29細胞CDX2 mRNA的表達Figure 1 The mRNA expression of CDX2 in wild type and over-expression CDX2 HT-29 cellsNote：M：Marker；1：HT-29 cells；2：Normal colonic mucosa；3：pcDNA3.1 plasmid transected HT-29 cells；4：pcDNA3.1-CDX2 plasmid transfected HT-29 cells.*P<0.05，compared with 1 and 3.

圖2 轉(zhuǎn)染CDX2基因?qū)T-29細胞CDX2蛋白的表達Figure 2 The protein expression of CDX2 in wild type and over-expression CDX2 HT-29 cellsNote：M：Marker；1：HT-29 cells；2：Normal colonic mucosa；3：pcDNA3.1 plasmid transected HT-29 cells；and 4：pcDNA3.1-CDX2 plasmid transfected HT-29 cells.*P<0.05，compared with 1 and 3.

GroupA490 valuesDay 1Day 2Day 3Day 4Day 5Day 6Day 7pcDNA3.1/HT-290.37±0.020.51±0.0250.66±0.0330.71±0.0320.83±0.0310.99±0.0511.22±0.041HT-290.37±0.020.47±0.021a0.59±0.032a0.68±0.035a0.78±0.048a0.93±0.053a1.13±0.053apcDNA3.1-CDX2/HT-290.37±0.020.44±0.018bc0.44±0.036bc0.46±0.043bc0.55±0.061bc0.59±0.062bc0.61±0.072bc

Note：Compared with the pcDNA3.1/HT-29 group at the same time.a.P>0.05；Compared with pcDNA3.1/HT-29 group at the same time，b.P<0.05；Compared with the HT-29 group at the same time，c.P<0.05.

2.4 過表達CDX2基因?qū)T-29細胞周期的影響

流式細胞儀分析細胞周期結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組HT-29、空白質(zhì)粒組pcDNA3.1/HT-29相比，轉(zhuǎn)染組pcDNA3.1-CDX2/HT-29細胞G0/G1期細胞比例明顯增加，而S期比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

2.5 過表達CDX2基因?qū)T-29細胞Cyclin D1蛋白和NF-κB磷酸化水平的影響

Western blot分析結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組相比，過表達CDX2基因轉(zhuǎn)染組HT-29細胞NF-κB表達上調(diào)(P<0.05)，而Cyclin D1蛋白、p-NF-κB表達下調(diào)(P<0.05)。而未轉(zhuǎn)染組HT-29和空白質(zhì)粒組pcDNA3.1/HT-29比較NF-κB和p-NF-κB表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖4)。

表2 各組細胞周期比例的比較

Note：*P<0.05vs.HT-29 cells or pcDNA3.1/HT-29 cells group.

圖4 過表達CDX2基因?qū)T-29細胞Cyclin D1蛋白和NF-κB的磷酸化水平的影響Figure 4 Effects of overexpression CDX2 gene on cyclin D1 protein and phosphorylation levels of NF-κB in HT-29 cellsNote：1：HT-29 cells；2：pcDNA3.1 plasmid transected HT-29 cells；3：pcDNA3.1-CDX2 plasmid transfected HT-29 cells.*P<0.05，vs. group 1 and 2.

圖3 過表達CDX2基因?qū)T-29細胞生長的抑制作用Figure 3 Effects of over-expression CDX2 on proliferation of HT-29 cells

3 討論

CDX2為CDX家族成員之一，位于染色體12q 12-13上，是一種腸特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育腸道形成中起關(guān)鍵作用，并與細胞的凋亡、黏附、侵襲和遷移有關(guān)[2-5]。有研究發(fā)現(xiàn)當CDX2高表達時，它能同靶基因的啟動子結(jié)合，促進靶基因表達，從而誘導胚胎極性的形成、器官的發(fā)生和組織的腸性分化，當CDX2低表達或不表達時，則促進細胞的增殖和加快細胞的代謝，并進一步導致腫瘤的發(fā)生[5-8]。Subtil等研究顯示CDX2在結(jié)腸癌中的表達水平顯著低于正常結(jié)腸組織，并隨結(jié)腸癌惡性程度、異型性的增高而降低[9-10]，亦發(fā)現(xiàn)CDX2通過上調(diào)SLC7A7基因的表達促進豬腸上皮細胞增殖[11]。而CDX2如何抑制結(jié)腸癌的發(fā)生目前機制仍未完全清楚，因此，本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將CDX2過表達于人結(jié)腸癌細胞HT-29中，與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，CDX2基因轉(zhuǎn)染組細胞的增殖速度明顯下降；G0/G1期細胞百分比明顯增加，處于S期的細胞百分數(shù)明顯減少，這些結(jié)果提示CDX2基因可能誘導HT-29細胞的G1期阻滯，抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。

眾所周知，CDX2和NF-κB在細胞的增殖和凋亡中扮演著重要的角色，二者在結(jié)腸癌細胞增殖中同樣起著重要的作用[12-13]。NF-κB是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，由Rel家族中5種亞單位組成二聚體，其中最常見p65和p50組成的異二聚體，與許多基因啟動子區(qū)域的核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄，參與多種疾病的發(fā)病過程，不僅與細胞周期、增殖、凋亡、腫瘤血管形成、細胞間黏附、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及機體的免疫應(yīng)答狀態(tài)有關(guān)，而且還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[12，14-18]。NF-κB通常以無活性的方式存在胞質(zhì)中，受到某些基因刺激后p65磷酸化激活，其通路的異常激活可能導致一系列抑癌基因的異常表達，抑制腫瘤細胞的調(diào)亡、細胞的分化及腫瘤細胞的遷移[19]。研究NF-κB和CDX2蛋白之間在結(jié)腸癌細胞中是否存在相互作用，有助于更好探索結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程。本實驗結(jié)果表明經(jīng)基因轉(zhuǎn)染后過表達CDX2基因HT-29細胞內(nèi)NF-κB表達上調(diào)，p-NF-κB表達明顯低于對照組，這些結(jié)果提示CDX2基因通過抑制磷酸化p-NF-κB的活性，抑制其對下游靶基因激活，進而導致腫瘤細胞增殖下降，與p-NF-κB表達呈負相關(guān)。這些實驗結(jié)果提示CDX2通過與NF-κB相互作用，抑制NF-κB磷酸化，阻礙了NF-κB DNA復合體的形成，影響下游抑癌基因在人類結(jié)直腸癌中的表達，抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。

目前研究表明細胞周期Cyclin Dl基因的啟動子上存在與NF-κB結(jié)合的位點[20]，同時還有研究顯示NF-κB為Cyclin D1的上游基因，與周期蛋白啟動子的抑制蛋白(Rb)位點結(jié)合后啟動Cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄表達，當NF-κB表達激活過程被阻滯后，其下游靶基因Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄蛋白表達受抑制[21-22]。Cyclin D1是定位于人染色體11q13的CCND1基因編碼，全長約15 kb，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼產(chǎn)物為Cyclin D1蛋白，該蛋白屬細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，是由295個氨基酸構(gòu)成，分子量為34 kD，含量隨細胞周期呈周期性變化，同時調(diào)控細胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，在調(diào)節(jié)細胞從G1期進入S期發(fā)揮重要作用。Cyclin D1已被公認為是一種原癌基因[32]，其過度表達可致細胞增殖失控而導致腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Cyclin D1基因過表達和基因擴增，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、食管癌等[20-25]。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后過表達CDX2基因HT-29細胞內(nèi)Cyclin D1表達明顯低于未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組，這些結(jié)果提示CDX2基因通過Cyclin D1影響細胞周期，從而抑制結(jié)腸癌細胞增殖。

綜合上述，過表達CDX2基因能夠抑制人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖，誘導細胞G0/G1期阻滯，并能影響Cyclin D1、NF-κB在細胞中的表達，提示其可能是通過NF-κB信號通路抑制細胞周期蛋白Cyclin D1，抑制結(jié)腸癌細胞的增殖。推測如果使用NF-κB信號通路抑制劑再檢測過表達CDX2基因的結(jié)腸癌細胞中Cyclin D1蛋白及細胞增殖能力，更能完善本課題的機制探索。