TACC3和p53蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

賀 偉 母齊鳴 王 剛 萬 波 廖 波 楊 娟

原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的癌癥，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。我國每年新增原發(fā)性肝癌患者400萬左右，占全球原發(fā)性肝癌總患者50%左右。由于腫瘤迅速生長，使肝包膜張力增加，多數(shù)病人以肝區(qū)疼痛(刺痛或脹痛、持續(xù)性鈍痛)就診[2-3]。我國70%的原發(fā)性肝癌由乙肝引起，其次為丙肝及飲酒，黃曲霉毒素是我國潮濕地區(qū)原發(fā)性肝癌發(fā)病的高危因素。原發(fā)性肝癌易擴(kuò)散，手術(shù)效果不佳，且對放療不敏感，三年生存率較低，因此探討原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制具有重要意義[4]。TACC3在多種外周組織包括心臟、大腦、脾臟、腎臟、胃等多種組織中正常表達(dá)，其配體對胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用，作為非機(jī)動微管相關(guān)蛋白家族的重要成員，TACC3對于細(xì)胞有絲分裂的持續(xù)性和穩(wěn)定性具有重要的調(diào)控作用[5-7]。p53是與人類腫瘤相關(guān)性最高的蛋白因子，其基因定位于17p13.1，p53蛋白主要分布于細(xì)胞核，能與DNA特異結(jié)合，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化等翻譯后修飾調(diào)控，p53基因突變后，p53蛋白空間構(gòu)象發(fā)生改變，失去了對細(xì)胞生長、凋亡和DNA 修復(fù)的調(diào)控作用，對細(xì)胞的增殖失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[8-9]。目前關(guān)于TACC3蛋白和p53蛋白與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究較少，因此本研究擬探討TACC3和p53蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，為原發(fā)性肝癌的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年4月—2014年5月在中航工業(yè)三六三醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的原發(fā)性肝癌患者138例，所有患者行輔助檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、肝臟病理組織檢查，其中男113例，女25例，年齡為40～74歲，平均(57.5±17.8)歲，病程為9個(gè)月～4年；肝功能分級A 級82例、B級10例、C級31例、D級15例；單純乙肝患者108例，單純丙肝患者42例，乙肝丙肝共患者12例；AST(14.8～98.9)U/L，平均(57.5±43.8)U/L；ALT(0～104.9)U/L，平均(56.9±69.4)U/L；肝細(xì)胞癌74例、膽管細(xì)胞癌45例、混合細(xì)胞癌19例。病理分期采用TNM分期(AJCC癌癥分期手冊)。符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)公布的2005版《Occult primary cancer clinical practice guidelines》中關(guān)于原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。手術(shù)切除標(biāo)本后行病理檢查以判定TNM分期、病理學(xué)分級、有無復(fù)發(fā)、浸潤深度、有無淋巴血管間隙浸潤、腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。同時(shí)取距原發(fā)性肝癌組織5 cm以上的組織為癌旁組。患者自愿提供癌旁組織及原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本，用作分析TACC3和p53蛋白的表達(dá)。

1.2 ELISA測定TACC3、p53蛋白水平

所有實(shí)驗(yàn)操作均為無菌操作，實(shí)驗(yàn)所有器具高壓滅菌，37℃烘干。保存在-70℃冰箱中的癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織取出解凍。稱取0.5 g癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織，加入少量液氮，在微波碾磨儀(5 000 r/s)中迅速將其碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入1 mL Eppendorf管，加入0.8 mL PBS(pH7.4)，充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細(xì)收集上清液。獲取癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織勻漿后，采用ELISA法檢測癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織的TACC3、p53蛋白表達(dá)量。

1.3 TACC3、p53在癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織的表達(dá)水平的測定

免疫組化法測定TACC3、p53在癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)，制作常規(guī)5 μm的癌旁組織、原發(fā)性肝癌組織石蠟切片，3% 的H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1% 的TACC3、p53抗體工作液(稀釋濃度1∶200)，4℃過夜，加入二抗(IgG)，室溫30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，(50%、60%、80%、90%、95%、100%)梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時(shí)計(jì)數(shù)；>50% 為(+++)，26%～50% 為(++)，6%～25% 為(+)，陽性細(xì)胞≤5% 為(-)，(-)及(+)歸為不表達(dá)組或低表達(dá)組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達(dá)組即為陽性。

1.4 隨訪

隨訪起始日期為肝癌術(shù)后第1天，隨訪截止日期為患者死亡日期或末次隨訪日期。隨訪方式為電話，隨訪內(nèi)容為：手術(shù)效果、恢復(fù)情況、病情變化、生存質(zhì)量、生存狀態(tài)、死亡及死亡時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌旁組和原發(fā)性肝癌組中TACC3、p53蛋白水平的表達(dá)

原發(fā)性肝癌組TACC3蛋白表達(dá)水平高于癌旁組(347.90±7.99vs. 36.78±5.97)，p53蛋白表達(dá)水平高于癌旁組(308.78±8.09vs. 43.08±9.77)(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁組和原發(fā)性肝癌組中TACC3、p53蛋白水平的表達(dá)

2.2 癌旁組織和原發(fā)性肝癌組織中TACC3、p53表達(dá)率的比較

原發(fā)性肝癌組TACC3陽性率高于癌旁組(75.3%vs8.0%)、p53陽性率高于癌旁組(78.2%vs15.9%)(P<0.05)(圖1，表2)。

2.3 原發(fā)性肝癌組TACC3、p53蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

原發(fā)性肝癌組TACC3、p53蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)(P>0.05)；與TNM分期、病理學(xué)分級、復(fù)發(fā)、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且TNM分期越高、病理學(xué)分級越高、有復(fù)發(fā)、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、腫瘤最大徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TACC3、p53蛋白陽性表達(dá)率越高(P<0.05)(表3)。

2.4 TACC3、p53蛋白表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)卡方及Log-rank檢驗(yàn)，TACC3、p53陰性組3年生存率及生存期明顯高于TACC3、p53陽性組(P<0.05)(圖2，表4)。

圖1 TACC3、p53在癌旁組、原發(fā)性肝癌組中的表達(dá)Figure 1 Expression of TACC3 and p53 protein in the paracancerous and primary liver cancer tissuesNote：A.TACC3 protein was expressed in the paracancerous group；B.TACC3 protein was expressed in the primary liver cancer group；C.p53 protein was expressed in the paracancerous group；and D.p53 protein was expressed in the primary liver cancer group.

GroupsnTACC3PositiveNegativep53PositiveNegativeParaneoplastic group13811(8.0)127(92.0)22(15.9)116(84.1)Primary liver cancer group138104(75.3)34(24.7)108(78.2)30(21.8)χ2128.929107.550P<0.001<0.001

表4 不同TACC3、p53蛋白表達(dá)原發(fā)性肝癌患者預(yù)后比較

表3 原發(fā)性肝癌患者TACC3、p53蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 TACC3、p53陽性/陰性患者生存曲線比較Figure 2 Comparison of survival curve of the positive and negative groups of TACC3 and p53

3 討論

TACC3是原癌基因，其結(jié)構(gòu)、功能的異常與遺傳性及散發(fā)性腫瘤均相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TACC3在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、遺傳物質(zhì)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長方面有重要作用[11-12]。作為Aurora A的作用底物，TACC3過表達(dá)導(dǎo)致Aurora A活性增強(qiáng)，進(jìn)而激活A(yù)kt/RAS/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[13]。TACC3也是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的啟動子，能被內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞膜上的受體激活，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究表明，若Wnt信號通路異常，則TACC3過表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin進(jìn)入胞核，激活下游癌基因(p53、Ras等)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[14]。本研究中，原發(fā)性肝癌組TACC3陽性率高于癌旁組，原發(fā)性肝癌組TACC3水平高于癌旁組，這與上述討論中TACC3促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖一致。腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移與基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9密切相關(guān)，TACC3能明顯增強(qiáng)MMP2、MMP9的表達(dá)，提示TACC3高表達(dá)對腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力有指示作用，此外TACC3可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌更多的白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等，而上述免疫抑制性細(xì)胞因子能誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤的發(fā)展并加速腫瘤血管系統(tǒng)的生長速度[15]。本研究結(jié)果提示，TNM分期越高、病理學(xué)分期越高、有復(fù)發(fā)、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、腫瘤最大徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TACC3蛋白陽性表達(dá)率越高，也說明TACC3高表達(dá)，能誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤的發(fā)展并加速腫瘤血管系統(tǒng)的生長速度。本研究中TACC3陰性組3年生存率及生存期明顯高于TACC3陽性組，這說明TACC3具有促進(jìn)癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用，TACC3高表達(dá)能明顯降低原發(fā)性肝癌患者預(yù)后。

p53在Hedgehog 信號通路扮演著核心調(diào)節(jié)作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結(jié)合時(shí)，Ptch 抑制跨膜蛋白受體(Smo)的活化，Smo 被釋放，其下游細(xì)胞因子p53被活化，促進(jìn)p53移位到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而激活下游原癌基因[16-17]。本研究中，原發(fā)性肝癌組p53水平高于癌旁組，原發(fā)性肝癌組p53陽性率高于癌旁組，說明原發(fā)性肝癌組原癌基因激活，p53表達(dá)高度活化，這與上述結(jié)論一致。此外高度表達(dá)p53的乳腺癌細(xì)胞株增殖能力高于野生株。高表達(dá)p53蛋白的腫瘤細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的能力強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)合，才能穿過細(xì)胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶[18]。p53基因突變一般發(fā)生于腫瘤的早期，p53基因突變后，處于高度活化狀態(tài)，且不受EGFR信號通路的調(diào)控，即使使用EGFR拮抗劑阻斷了上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，突變的p53的仍可發(fā)揮其促腫瘤增殖作用，EGFR拮抗劑對p53基因突變的惡性腫瘤患者不能發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。本研究結(jié)果提示，TNM分期越高、病理學(xué)分級越高、有復(fù)發(fā)、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、腫瘤最大徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，p53蛋白陽性表達(dá)率越高，說明p53在腫瘤組織中表達(dá)增加。p53蛋白主要分布于細(xì)胞核，能與DNA特異結(jié)合，p53通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子控制細(xì)胞周期，在G1期檢查DNA損傷點(diǎn)，監(jiān)視基因組的完整性。如有損傷，p53蛋白阻止復(fù)制；如果修復(fù)失敗，p53蛋白則引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡；p53突變或缺失后，細(xì)胞周期失調(diào)，基因異常表達(dá)，并出現(xiàn)染色體重排和某種特征的惡性表型[20]。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)p53陰性組3年生存率明顯高于p53 陽性組，說明p53具有促進(jìn)癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用，p53低表達(dá)能明顯提高原發(fā)性肝癌患者預(yù)后。

綜上所述，原發(fā)性肝癌組織中TACC3、p53蛋白表達(dá)量增加，其與原發(fā)性肝癌的進(jìn)展密切相關(guān)；TACC3、p53蛋白低表達(dá)能提高原發(fā)性肝癌患者預(yù)后。