糖原合成酶激酶—3與線粒體分裂蛋白在減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用中的關(guān)系

羅維昊 賀建東 韓沖芳

[摘要]目的 探討糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）與線粒體分裂蛋白（Drp-1）在大鼠心肌保護(hù)中的關(guān)系。方法 選取清潔健康雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，隨機(jī)分為4組（n=15）：缺血再灌注組（IR組）、缺血再灌注+Mivi-1處理組（M組）、缺血再灌注+SB216763處理組（B組）、缺血再灌注+Mivi-1處理+SB216763處理組（D組）。采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支30 min，再灌注120 min的方法制備大鼠心肌缺血再灌注（MRIR）模型。M組再灌注前1 min靜注Mivi-1（1.2 mg/kg）；B組再灌注前1 min靜注SB216763（0.2 mg/kg）；D組再灌注前靜注Mivi-1及SB216763。腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血清肌鈣蛋白（cTnI）濃度；取心肌組織，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）；觀察心肌病理學(xué)結(jié)果；Western blot法檢測(cè)caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 與IR組比較，M、B、D組上述指標(biāo)下調(diào)（P<0.05）；與D組比較，M、B組caspase-3濃度、AI、血清cTnI濃度上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 GSK-3β與Drp-1在大鼠心肌保護(hù)作用中并非單一依賴關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]心?。恍募≡俟嘧p傷；糖原合成酶激酶-3

[中圖分類號(hào)] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）6（b）-0012-04

The relationship between GSK-3 beta and Drp-1 in alleviating myocardial ischemia reperfusion injury in rats

LUO Wei-hao1 HE Jian-dong2 HAN Chong-fang2

1.Department of Anesthesiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anesthesiology，Hospital of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To investigate the relationship between GSK-3β and Drp-1 in the myocardium protection in rats.Methods 60 healthy male SD rats，weighing 250-300 g，randomly divided into 4 groups （n=15）：Ischemia reperfusion group（group IR），Ischemia reperfusion+Mivi-1 treatment group（group M），Ischemia reperfusion+SB216763 treatment group（group B），and Ischemia reperfusion+Mivi-1 treatment group+SB216763 treatment group （group D）.The myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by ligating the LAD for 30 min and reperfusion for 120 min.Mdivi-1（1.2 mg/kg） was given at 1 min before reperfusion in group M by intravenous injection.SB216763（0.2 mg/kg） was given at 1 min before reperfusion in group B by intravenous injection.Both of them were given at 1 min before reperfusion in group D by intravenous injection.cTnI concentration was detected from abdominal aorta blood.Myocardial specimens were obtained from the apex for determination of the AI by TUNEL.Myocardial pathology were observed and the expression of caspase-3 was detected by Western blot.Results Compared with IR group，the levels of caspase-3，AI and myocardial injury in M，B and D groups were down-regulated（P<0.05）.Compared with D group，the levels of caspase-3，AI and myocardial injury were increased in M and B group the differences were statistical significant （P<0.05）.Conclusion The relationship between GSK-3β and Drp-1 of the myocardium protection in rats is not a single dependency.

[Key words]Myocardium；Myocardial ischemia-reperfusion；GSK-3β

隨著心胸外科技術(shù)發(fā)展，冠脈旁路移植術(shù)（CABG）等多種治療手段得以廣泛應(yīng)用，梗死冠狀動(dòng)脈得以再通，但由此引發(fā)的心肌缺血再灌注損傷（MRIR）發(fā)生率卻不斷上升。研究證實(shí)，激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K/Akt），蛋白激酶C（PKC），蛋白激酶A（PKA）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等激酶[1-2]，均可引起下游底物糖原合成激酶3β（GSK-3β）抑制性磷酸化，阻止caspase-3激活及線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡啟動(dòng)，起到保護(hù)心肌的作用[3-5]。研究顯示，GSK-3β可抑制性磷酸化動(dòng)力相關(guān)蛋白-1（Drp-1）[6]，而Drp-1作為線粒體分裂調(diào)控關(guān)鍵蛋白，在急性缺血損傷中地位重要，其過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)線粒體分裂[7]，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者之間存在上下游調(diào)控關(guān)系。然而，Drp-1是否單純依賴GSK-3β調(diào)節(jié)有待探討。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔健康雄性SD大鼠60只，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（2016.10）。體重250～300 g。

1.2儀器/試劑

Drp-1抑制劑Mdivi-1（Medchem Express公司，美國(guó)），GSK-3β抑制劑SB216763（Medchem Express公司，美國(guó)），內(nèi)參GAPDH抗體（abcam公司，英國(guó)），免抗鼠caspase-3單抗（abcam公司，英國(guó)），羊抗免Ⅱ抗（abcam公司，英國(guó)），生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（泰盟公司，四川成都），動(dòng)物呼吸機(jī)（泰盟公司，四川成都），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)），小型垂直蛋白電泳槽（Bio-rad公司，美國(guó)），蛋白轉(zhuǎn)印儀（Bio-rad公司，美國(guó)）。

1.3分組/處理

參照文獻(xiàn)[8]方法，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組（n=15）：缺血再灌注組（IR組）、缺血再灌注+Mivi-1組（M組）、缺血再灌注+SB216763組（B組）、缺血再灌注+Mivi-1+SB216763組（D組）。

參照文獻(xiàn)[9]制備大鼠MRIR模型，禁食不禁飲8 h后，腹腔注射20%烏拉坦4 ml/kg麻醉，仰臥位恒溫試驗(yàn)臺(tái)固定，針狀電極監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。頸正中氣管切開(kāi)氣管插管接動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量為2.5 ml/100 g，通氣頻率60次/min，吸呼比1∶2。于胸骨左緣3、4肋間開(kāi)胸入胸腔，擠壓胸廓暴露心臟，剝離心包，用6-0絲線于左心耳根部2 mm穿過(guò)LAD，絲線兩端穿過(guò)一硅膠套管，牽拉絲線收緊套管并固定，造成人工心肌缺血。心電圖實(shí)時(shí)表現(xiàn)ST段抬高或降低，T波高尖，扎線遠(yuǎn)端心肌組織發(fā)紺，表明出現(xiàn)心肌缺血。30 min后松開(kāi)絲線進(jìn)行再灌注，心電圖表現(xiàn)ST段下降>1/2，發(fā)紺心肌逐步變紅，表明心肌再灌注成功。再灌注120 min，大鼠MRIR模型制備成功。

M組再灌注前1 min尾靜脈注射Drp-1抑制劑Mivi-1（1.2 mg/kg）；B組再灌注前尾靜脈注射SB216763（0.2 mg/kg）；D組再灌注前尾靜脈注射Mivi-1（1.2 mg/kg）及SB216763（0.2 mg/kg）。再灌注120 min時(shí)，腹正中切開(kāi)暴露腹主動(dòng)脈并取血2 ml。

1.4指標(biāo)/方法

1.4.1血清肌鈣蛋白（cTnI濃度） 血樣室溫靜置2 min后，4℃ 3500轉(zhuǎn)/min離心5 min，離心半徑10 cm，取上層血清，-80℃保存，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.4.2細(xì)胞凋亡 處死大鼠，取部分缺血心肌組織，甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，染色為棕黃色的細(xì)胞為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞；陰性細(xì)胞染成藍(lán)色，即正常心肌細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.3病理?yè)p傷 取缺血區(qū)心肌組織，部分進(jìn)行HE染色觀察心肌病理學(xué)結(jié)果。將心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋后切片機(jī)切取2～3 μm厚度切片，貼附于載玻片上，烘干。二甲苯中浸泡8 min×3次，直至切片呈透明狀，后取出切片并甩掉表面附著二甲苯，置于酒精溶液洗去二甲苯。脫蠟后蒸餾水浸泡5 min，再置于蘇木素溶液中浸染5 min，生理鹽水沖洗干凈后于75%酒精中分化30 s，再用氨水藍(lán)染數(shù)秒，后用生理鹽水沖洗并用伊紅染液染色1 min，酒精脫水。脫水完成后切片浸泡于二甲苯5 min，滴中性樹(shù)膠完成封片。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的病理?yè)p傷情況。

1.4.4 caspase水平 取剩余心肌組織，采用Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞caspase-3的表達(dá)。生理鹽水灌洗心臟后，取心肌組織加入細(xì)胞裂解液，蛋白酶抑制劑，低溫下勻漿。4℃下12000 ×g離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量配制分離膠與濃縮膠進(jìn)行電泳，120 V電泳2 h，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液封閉2 h，加兔抗鼠caspase-3抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST液漂洗5 min ×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h后TBST漂洗5 min ×3次，加ECL化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析。以caspase-3與GAPDH條帶灰度值比值反映其表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組大鼠caspase-3、AI、cTnI水平的比較

與IR組比較，M、B、D組caspase-3濃度、AI、cTnI濃度下調(diào)（P<0.05）；與M、B組分別比較，D組caspase-3濃度、AI、cTnI濃度下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1、圖1）。

表1 四組大鼠caspase-3、AI、cTnI水平的比較（x±s）

與I/R組比較，aP<0.05；與D組比較，bP<0.05

2.2四組大鼠光鏡下細(xì)胞形態(tài)的比較

光鏡下觀察，IR組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，心肌纖維排列紊亂，胞漿不同程度腫脹甚至破裂，胞核排列不齊，且出現(xiàn)碎裂和溶解，與前者相比，M、B、D組胞漿腫脹程度和細(xì)胞核的破壞程度均較輕。

3討論

健康雄性SD大鼠，采用阻斷LAD血流30 min，再灌注120 min的方法制備大鼠IR模型[9]。結(jié)果顯示，再灌注120 min后大鼠心肌梗死面積增大，心肌產(chǎn)生病理?yè)p傷，血清cTnI含量升高，提示大鼠IR模型制備成功。

Caspase家族蛋白酶是存在于細(xì)胞質(zhì)溶膠中的天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，caspase-3參與細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行，反映了細(xì)胞的凋亡狀況[3]。cTnI是一種心肌特異抗原，平時(shí)不能透過(guò)細(xì)胞膜，心肌應(yīng)激狀態(tài)時(shí)于血清內(nèi)短時(shí)間激增，對(duì)反映心肌損傷具有高度特異性。

本研究結(jié)果顯示，與IR比較，M、B組caspase-3表達(dá)水平下降，心肌損傷程度減輕，提示兩者可一定程度起到對(duì)心肌的保護(hù)作用，并且通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將兩者能產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用控制到無(wú)統(tǒng)計(jì)差異的范圍內(nèi)以排除可能通路的干擾。與M、B組比較，D組caspase-3表達(dá)水平，cTnI濃度，AI指數(shù)下降，心肌損傷程度減輕，提示GSK-3β與Drp-1之間并非單純依賴關(guān)系，兩者之間可能存在其他作用途徑。

GSK-3β是PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路上重要信號(hào)蛋白[1，10]，多種心肌保護(hù)措施發(fā)揮作用須經(jīng)過(guò)其在Ser 9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化[11]，進(jìn)而抑制線粒體通透轉(zhuǎn)化孔（mPTP）開(kāi)放[12]，最終部分抑制凋亡[13]。而Drp-1的作用是調(diào)控線粒體形態(tài)，主導(dǎo)其分裂。Clayton等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β可以磷酸化抑制Dynaminl，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元突觸部位活性囊泡的內(nèi)吞。這提示Drp-1作為dynmin家族一員的能否被GSK-3β磷酸化并參與到線粒體動(dòng)態(tài)化平衡中。研究顯示GSK-3β參與了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15-16]。在對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)[6]，用小干擾RNA抑制Drp-1表達(dá)之后，GSK-3β無(wú)法誘導(dǎo)線粒體的分裂，提示神經(jīng)元中GSK-3β調(diào)控線粒體分裂是依賴于Drp-1的。

有文獻(xiàn)顯示[17]，使用抑制劑Mdivi-1抑制Drp-1也能阻止依賴于Bax/Bak的Cyt C從線粒體釋放，說(shuō)明Drp-1的促凋亡作用可能與線粒體并無(wú)關(guān)聯(lián)，提示以上通路可能存在其他影響途徑。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[18]選擇GSK-3β抑制劑SB216763的劑量，SB216763使GSK-3β磷酸化而活性受抑，恢復(fù)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的保護(hù)作用，釋放出腺苷等自身保護(hù)物質(zhì)[13]，最終減少了mPTP的開(kāi)放，產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)[19]。采用特異性抑制劑Mdivi-1抑制Drp-1活性[20]，抑制線粒體的分裂，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)受損心肌的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩者同時(shí)施加，對(duì)比心肌保護(hù)效果與單獨(dú)施加是否有變化進(jìn)而證明其兩者之間是否為單純依賴關(guān)系。

綜上所述，GSK-3β與Drp-1在大鼠心肌保護(hù)作用中并非單純依賴的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)僅通過(guò)抑制GSK-3β的表達(dá)與Drp-1的線粒體膜移動(dòng)，單方面討論了抑制條件下兩者之間可能存在的依賴關(guān)系，并未通過(guò)激活表達(dá)的方向進(jìn)行驗(yàn)證，需進(jìn)一步研究完善。

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（收稿日期：2017-11-06 本文編輯：崔建中）