重組截短型TGF—β前體潛在相關(guān)肽的原核表達(dá)及其對HSC—T6細(xì)胞增殖的影響

石永萍 鄭俊雅 劉增瑞 李魯新 王晶 李玲玉 曹雅男 初彥輝

[摘要]目的 初步研究截短型TGF-β前體潛在相關(guān)肽（LAP）的重組蛋白對HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響。方法 PCR擴(kuò)增截短型LAP片段，構(gòu)建該片段的原核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切、DNA測序鑒定后，IPTG 0.5 mmol/L，37℃，4 h誘導(dǎo)出蛋白的大量表達(dá)，表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE，Western blot檢測，經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析純化重組蛋白， 將重組蛋白作用于大鼠肝星狀細(xì)胞-T6（HSC-T6），用MTT法檢測不同濃度重組蛋白對細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果 原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，成功表達(dá)、純化了重組蛋白，且HSC-T6細(xì)胞的增殖程度隨重組蛋白濃度的增加而降低。結(jié)論 重組蛋白可抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，為后續(xù)研究LAP片段對TGF-β活化過程的干擾作用及對器官纖維化的影響奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]TGF-β前體潛在相關(guān)肽；原核表達(dá)；蛋白純化；HSC-T6；增殖

[中圖分類號] R331 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（b）-0004-04

Prokaryotic expression of latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor and its influence on proliferation of HSC-T6 cell

SHI Yong-ping1，2 ZHENG Jun-ya1 LIU Zeng-rui1 LI Lu-xin1 WANG Jing1 LI Ling-yu1 CAO Ya-nan1 CHU Yan-hui1

1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China；2.Inspection and Legal Affairs Section，Mudanjiang Public Health Inspection Institution，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China

[Abstract]Objective To preliminarily study the influence of recombinant protein of latency-associated peptide （LAP） of recombinant truncated TGF-β precursor on proliferation of hepatic stellate cells （HSC）-T6.Methods The truncated LAP fragment was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and the prokaryotic expression vector was constructed.After double enzyme digestion and DNA sequencing，the protein expression was induced by IPTG at 0.5 mmol/L at 37°C for 4 h.The expressed protein was detected by SDS-PAGE and Western blot，after that the recombinant protein was by nickel agarose affinity chromatography for purification.The recombinant protein was applied to rat hepatic stellate cell-T6 （HSC-T6），and the influence of different concentrations of recombinant protein on cell proliferation was detected by MTT assay.Results The prokaryotic expression vector was successfully constructed and the recombinant protein was expressed and purified successfully.The proliferation of HSC-T6 cells decreased with the increase of the recombinant protein concentration.Conclusion The recombinant protein inhibits the proliferation of HSC-T6 cells，and lays the foundation for the subsequent study on the interference of LAP fragments on the activation of TGF-β and the influence on organ fibrosis.

[Key words]Latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor；Prokaryotic expression；Protein purification；Hepatic stellate cells-T6；Proliferation

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）具有多種生物學(xué)功能，促纖維化是其最重要的功能之一，被大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)為纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐[1-3]。TGF-β的活化過程是其發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵步驟，是一個受多種因素影響的復(fù)雜過程，在纖維化性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4-6]。TGF-β的活化在細(xì)胞外完成，是受多種因素影響的復(fù)雜過程。在胞內(nèi)，TGF-β的各種異構(gòu)體都是由各個獨立基因產(chǎn)生的，先是被合成前體蛋白，然后在內(nèi)肽酶、Furin 酶作用下產(chǎn)生TGF-β蛋白N端的二聚體潛在相關(guān)肽（LAP）和C端的二聚體成熟型TGF-β，這兩部分以非共價形式相連，即TGF-β與LAP的復(fù)合物，它不具有生物活性[7-9]。LAP上的半胱氨酸富集區(qū)能夠結(jié)合TGF-β功能區(qū)，并且LAP上具有結(jié)合潛在TGF-β 結(jié)合蛋白（LTBP）和整合素的識別區(qū)域[10-11]，TGF-β與LAP的復(fù)合物被分泌到細(xì)胞外后，經(jīng)過復(fù)雜的過程，并在LTBP、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP被祛除或發(fā)生構(gòu)型改變，導(dǎo)致復(fù)合物瓦解，方可釋放具有生物活性的TGF-β，TGF-β通過與細(xì)胞膜表面特異性受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12-15]。本實驗以人源LAP蛋白為研究對象，希望構(gòu)建一種能與TGF-β高效結(jié)合的截短型LAP片段，即能高效地與野生型LAP競爭結(jié)合TGF-β，在TGF-β活化的起始階段干擾TGF-β的活化，進(jìn)而抑制TGF-β信號傳導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；RNA提取試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；PCR相關(guān)試劑購自日本東洋紡公司；XholⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶及Buffer購自寶生物工程大連有限公司；引物、非干擾型蛋白定量試劑盒、W-TMB顯色試劑盒均由上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。PCR儀，離心機(jī)，均為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 人源LAP截短型片段的擴(kuò)增

依據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫中LAP的cDNA序列設(shè)計引物，為方便克隆在上下游引物的5′端加入XholⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，上游引物5′-AGTGGACATCAACGGGTTC-3′，下游引物5′-CCAGTGTGTTATCCCTGCT-3′。按RNA提取試劑盒提人血總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板擴(kuò)增基因片段。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，回收的基因和載體pET28a分別用限制性內(nèi)切酶XholⅠ、EcoRⅠ雙酶切?；厥彰盖挟a(chǎn)物后連接載體與基因片段，得到pET28a-LAP-B2重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，將連接產(chǎn)物涂布于卡那霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基上，烘箱37℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆菌落搖菌過夜，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將陽性克隆測序。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌BL21，挑取單菌落于5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于10 ml的LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD值為0.6時，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min，分別20℃誘導(dǎo)過夜，37℃誘導(dǎo)4 h，未加IPTG組為陰性對照，選擇最佳的誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)后收集菌體用PBS緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心分別收集上清和沉淀，沉淀用包涵體溶解液溶解，用12%的SDS-PAGE膠電泳檢測，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.5 重組蛋白的純化

按表達(dá)量最高的條件大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后，用PBS將收集的菌體重懸，冰浴超聲破碎菌體，12 000 r/min，4℃，離心20 min，收集上清進(jìn)行純化。用鎳瓊脂糖親和層析法純化，用20、50、500 mmol/L的咪唑梯度洗脫，將收集到的組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測，將純度最好的洗脫組分經(jīng)透析膜透析2 h后再經(jīng)濾膜過濾、分裝，-80℃保存。SDS-PAGE電泳和Western blot檢測純化后的蛋白，并使用SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.6大鼠肝星狀細(xì)胞- T6（HSC-T6）的增殖檢測

MTT實驗設(shè)有正常對照組、模型組、重組蛋白作用組7組（5、10、25、50、75、100、200 ng/ml）、空白對照組，除正常對照組和空白組外，其他組均加入10 ng/ml的 TGF-β活化細(xì)胞。每組5個復(fù)孔，按每孔8×103細(xì)胞種至3個96孔板中，培養(yǎng)至貼壁后加入藥物，分別培養(yǎng)12、24、48 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO震蕩10 min，用酶聯(lián)儀測試490 nm處吸光度值（OD）。

2 結(jié)果

2.1 LAP截短片段的擴(kuò)增

人源LAP片段為747 bp，實驗設(shè)計的截短片段為171 bp，PCR擴(kuò)增后，結(jié)果顯示產(chǎn)物條帶大小為171 bp，與實驗設(shè)計一致（圖1）。

2.2 原核表達(dá)載體鑒定

抽提陽性克隆菌液質(zhì)粒，用XholI、EcoRI雙酶切， 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，分別產(chǎn)生171 bp和5369 bp的條帶，與目的片段和載體大小相符（圖2）。陽性克隆重組質(zhì)粒送于上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果表明插入的序列與Genebank公布的序列一致（圖3）。

2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體形式大量存在于37℃誘導(dǎo)4 h的菌體沉淀中（圖4），分子量大小為10.3 KD，與預(yù)期目的蛋白分子量一致，可進(jìn)一步純化。將收集的菌體用破碎Buffer溶解（2 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-114，1 mmol/L DTT，pH 8.0），冰浴超聲破碎菌體，用鎳柱純化重組蛋白，利用咪唑梯度洗脫，收集洗脫液。SDS-PAGE檢查從包涵體中純化出了目的蛋白（圖5）。

重組蛋白經(jīng)過純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明重組蛋白成功得到了純化（圖6）。蛋白經(jīng)Western blot檢測在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶（圖7），用W-TMB顯色試劑盒顯色，經(jīng)測定蛋白濃度>85%。

2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果

不同濃度的重組蛋白作用于HSC-T6細(xì)胞，不同時間測其OD490值，其OD490值均低于TGF-β活化組，并隨重組蛋白濃度加大，作用時間的延長，其OD490值逐漸降低，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性（圖8）。

3討論

TGF-β具有廣泛的生物學(xué)功能，TGF-β的活化過程是其發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵步驟，是一個受多種因素影響的復(fù)雜過程[16-17]。本試驗以TGF-β活化過程的相關(guān)蛋白LAP為研究對象，構(gòu)建了LAP片段的原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白在包涵體中大量表達(dá)，包涵體表達(dá)能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[18-20]，并從包涵體中成功純化出目的蛋白，用Western blot確定了表達(dá)的特異性，并對蛋白的表達(dá)和純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)純化后獲得了純度>85%的重組蛋白。將重組蛋白作用于HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了該細(xì)胞的增殖，這為后續(xù)研究人源LAP片段重組多肽對TGF-β活化過程的干擾，以及研究其對TGF-β生物學(xué)功能的影響提供有利的保障，并為纖維化疾病的研究和治療提供新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Williams EJ，Gaca MD，Brigstock DR，et al.Increased expression of connective tissue growth factor in fibrotic human liver and in activated hepatic stellate cells[J].J Hepatol，2000，32（5）：754-761.

[2]Pohlers D，Brenmoehl J，Loffler I，et al.TGF-beta and fibrosis in different organs-molecular pathway imprints[J].Biochim Biophys Acta，2009，1792（8）：746-56.

[3]Galat A.Common structural traits for cystine knot domain of the TGFbeta superfamily of proteins and three-fingered ectodomain of their cellular receptors[J].Cell Mol Life Sci，2011，68（20）：3437-3451.

[4]Painemal P，Acuna MJ，Riquelme C，et al.Transforming growth factor type beta 1 increases the expression of angiotensin Ⅱ receptor type 2 by a SMAD-and p38 MAPK-dependent mechanism in skeletal muscle[J].Biofactors，2013，39（4）：467-475.

[5]Gordon KJ，Blobe GC.Role of transforming growth factor-beta superfamily signaling pathways in human disease[J].Biochim Biophys Acta，2008，1782（4）：197-228.

[6]Blobe GC，Schiemann WP，Lodish HF.Role of transforming growth factor β in human disease[J].N Engl J Med，2000，342（18）：1350-1358.

[7]Shi M，Zhu J，Wang R，et al.Latent TGF-β structure and activation[J].Nature，2011，474（7351）：343-349.

[8]ten Dijke P，Arthur HM.Extracellular control of TGF beta signaling in vascular development and disease[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（11）：857-869.

[9]Radaev S，Zou Z，Huang T，et al.Ternary complex of transforming growth factor-beta1 reveals isoform-specific ligand recognition and receptor recruitment in the superfamily[J].J Biol Chem，2010，285（19）：14 806-14 814.

[10]Annes JP，Chen Y，Munger JS，et al.Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta bindingprotein-1[J].J Cell Biol，2004，165（5）：723-734.

[11]Wipff PJ，Hinz B.Integrins and the activation of latent transforming growth factor β1-an intimate relationship[J].Eur J Cell Biol，2008，87（8-9）：601-615.

[12]Shi Y，Massagué J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus[J].Cell，2003，113（6）：685-700.

[13]Yang Z，Mu Z，Dabovic B，et al.Absence of integrin-mediated TGFbeta1 activation in vivo recapitulates the phenotype of TGFbeta1-null mice[J].J Cell Biol，2007，176（6）：787-793.

[14]Walton KL，Makanji Y，Chen J，et al.Two distinct regions of latency-associated peptide coordinate stability of the latent transforming growth factor-beta1 complex[J].J Biol Chem，2010，285（22）：17 029-17 037.

[15]Ge G，Greenspan DS.BMP1 controls TGFbeta1 activation via cleavage of latent TGF beta-binding protein[J].J Cell Biol，2006，175（1）：111-120.

[16]Prud′homme GJ.Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer，fibrosis and immunologic disease，and therapeutic considerations[J].Lab Invest，2007，87（11）：1077-1091.

[17]Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis[J].J Clin Invest，2005， 115（2）：209-218.

[18]Long S，Truong L，Bennett K，et al.Expression，purification，and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli[J].Protein Expr Purif，2006，46（2）：374-378.

[19]Zhang Y，Ma Y，Yang M，et al.Expression，purification，and refolding of a recombinant human bone morphogenetic protein 2 in vitro[J].Protein Expr Purif，2011，75（2）：155-160.

[20]Vallejo LF，Brokelmann M，Marten S，et al.Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli[J].J Biotechnol，2002，94（2）：185-194.

（收稿日期：2018-03-23 本文編輯：許俊琴）