桃紅芪術(shù)軟肝煎對(duì)肝纖維化大鼠病理及TGF撥/Smad信號(hào)通路的影響

王靖思 吳潔 孫桂芝??張秋云??劉玉琴 陳蘭羽 朱宏偉

摘要 目的：觀察桃紅芪術(shù)軟肝煎抗大鼠肝纖維化的作用及對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響。方法：選取105只Wistar大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、對(duì)照藥物組（秋水仙堿組、扶正化瘀膠囊組）、桃紅芪術(shù)軟肝煎組（桃紅芪術(shù)低劑量組、中劑量組、高劑量組）。除空白組外，分3、6、9周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用50%CCl41mL/kg橄欖油溶液腹腔注射進(jìn)行肝纖維化模型制作，同時(shí)進(jìn)行HE染色和Masson染色觀察肝纖維化的病理表現(xiàn)；并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟組織的E-Cadherin、Vimentin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、Smad2蛋白表達(dá)；RT-PCR方法檢測(cè)肝臟組織的E-Cadherin、Vimentin、TGF-β1、Smad2的mRNA表達(dá)。結(jié)果：肝纖維化病理結(jié)果顯示，隨著造模、給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各給藥組均能明顯阻斷模型大鼠肝組織纖維化進(jìn)展；與模型組比較，第9周時(shí)桃紅芪術(shù)高劑量組作用最明顯。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與模型組比較，用藥各組從第3周至第9周，E-cadherin表達(dá)均較模型組表達(dá)明顯增加（P<0.05），用藥各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，用藥各組TGF-β1表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），用藥各組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Smad2mRNA表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），桃紅芪術(shù)低劑量組VimentinmRNA、Smad2mRNA表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組Smad2mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；扶正化瘀膠囊組TGF-β1mRNA、VimentinmRNA表達(dá)量均較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：桃紅芪術(shù)軟肝煎可持續(xù)通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，治療肝纖維化。

關(guān)鍵詞 孫桂芝；桃紅芪術(shù)軟肝煎；肝纖維化；肝硬化；肝纖維化防治；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad信號(hào)通路；上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

AbstractObjective：ToobserveeffectsofTaohongQizhuRuanganDecoctionontreatingliverfibrosisofrats，andeffectsonTGF-β/Smadsignalpathway.Methods：Atotalof105Wistarratswererandomlydividedintoblankgroup，modelgroup，controlgroup（colchicineandFuzhengHuayuCapsulegroup），TaohongQizhuRuanganDecoctiongroup（lowdosegroup，middledosegroup，highdosegroup）.Exceptblankgroup，theliverfibrosismodelwasestablishedbytheintraperitonealinjectionof50%CCl41mL/kgofoliveoilsolutionat3，6，9week.Atthesametime，HEstainingandMassonstainingwereusedtoobservethepathologicalexpressionsofliverfibrosis.TheexpressionsofE-Cadherin，Vimentin，TGF-β1andSmad2inlivertissuesweredetectedbyimmunohistochemistry.ThemRNAexpressionsofE-Cadherin，Vimentin，TGF-β1andSmad2inlivertissuesweredetectedbyRT-PCR.Results：Thepathologicalresultsofliverfibrosisshowedthatwiththeprolongationofmodelingandadministrationtime，eachdrug-administeredgroupcouldsignificantlyblocktheprogressionofhepaticfibrosisinmodelrats.Andcomparedwithmodelgroup，effectofhighdoseTaohongQizhuRuanganDecoctiongroupwasmostobvious.Immunohistochemical：From3weekto9week，comparedwithmodelgroup，E-cadherinexpressionwassignificantlyincreasedthanothergroups（P<0.05），andtherewerenodifferencesbetweengroups（P>0.05）；comparedwithmodelgroup，TGF-βexpressiondecreasedsignificantlyinotherdruggroups（P<0.05），andtherewerenodifferencesbetweengroups（P>0.05）.RT-PCR：Comparedwiththeblankgroup，Smad2mRNAexpressioninmodelgroupsignificantlyincreased（P<0.05）.VimentinmRNAandSmad2mRNAexpressionoflowdosegroupofTaohongQizhuRuanganDecoctionsignificantlydecreased（P<0.05）.Smad2mRNAexpressionofmiddledosegroupofTaohongQizhuRuanganDecoctiondecreased（P<0.05）；TGF-βmRNA，VimentinmRNAexpressionofFuzhengHuayuCapsulegroupdecreasedcomparedwiththemodelgroup（P<0.05）.Conclusion：TaohongQizhuRuanganDecoctioncanregulateepithelial-mesenchymaltransitionthroughTGF-β/Smadsignalingpathwaytotreatliverfibrosis.

KeyWordsSunGuizhi；TaohongQizhuRuanganDecoction；Hepaticfibrosis；Livercirrhosis；Preventionandtreatmentofhepaticfibrosis；TGF-βsignalpathway；Epithelial-mesenchymaltransition；TGF-β1

中圖分類號(hào)：R289.5；R575.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.047

慢性病毒性肝炎是肝纖維化的主要原因，在肝硬化的形成過(guò)程中，肝纖維化是慢性病毒性肝炎向肝硬化發(fā)展的不可避免的階段[1]，肝纖維化及其并發(fā)癥給社會(huì)帶來(lái)巨大健康負(fù)擔(dān)，由于缺乏有效的治療方法，慢性肝臟疾病困擾著世界上數(shù)百萬(wàn)人[2]。且慢性肝病中一旦由纖維化進(jìn)展到硬化，發(fā)展到肝細(xì)胞癌的概率就會(huì)增加[3-4]，因此有效抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要的臨床意義。桃紅芪術(shù)軟肝煎（簡(jiǎn)稱桃紅芪術(shù)）為孫桂芝主任醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)方[5]，觀察其抗大鼠肝纖維化的作用及其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物選取105只雌性Wistar大鼠，體重（180±20）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007大鼠。分籠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物房，清潔級(jí)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料，自由飲用純凈水，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.1.2藥物桃紅芪術(shù)軟肝煎，由生黃芪、炒白術(shù)、太子參、桃仁、莪術(shù)等藥材組成，所用藥材購(gòu)自本草方源藥業(yè)，全量水提取2次，濃縮收清膏2700g灌裝，含生藥量為2.9g/kg。扶正化瘀膠囊，含生藥量4.0g/kg（上海黃海制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20020074）；秋水仙堿（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369）。

1.1.3試劑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶劑盒、白蛋白試劑盒（均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾公司）；4%多聚甲醛（Solarbio公司）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（Hyclone公司）；CCl4分析純、水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色及Masson染色試劑盒（均購(gòu)自南京建成科技有限公司）；Trizol試劑盒（Lifetechnologies公司，批號(hào)：84802）；快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastQuantRTKit）（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：N2828）；RT-PCR試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：N2828）；引物序列由賽百盛生物公司合成。

1.1.4儀器低速離心機(jī)（型號(hào)600-A），白洋離心機(jī)廠；熒光正置顯微鏡，ScopeA1，德國(guó)Zeiss公司；ASP300脫水機(jī)、EG1150H包埋機(jī)、RM2235切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；BX51顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2動(dòng)物分組及造模105只大鼠隨機(jī)分組，分為空白組、模型組、對(duì)照藥物組（秋水仙堿組、扶正化瘀膠囊組）、桃紅芪術(shù)組（低劑量組、中劑量組、高劑量組）。每組15只。除空白組外均進(jìn)行肝纖維化模型制作。造模方法：造模組采用含50%CCl4的橄欖油溶液1mL/kg腹腔注射制作肝纖維化模型，2次/周，分3、6、9周3個(gè)時(shí)間周進(jìn)行造模?？瞻捉M則采用含50%的0.9%NaCl溶液的橄欖油溶液進(jìn)行腹腔注射。均每周稱體重1次，以調(diào)整腹腔注射劑量。

1.3干預(yù)造模同時(shí)各組進(jìn)行每日灌胃干預(yù)，桃紅芪術(shù)低劑量組給予桃紅芪術(shù)3.1g/（kg·d）、中劑量組給予31g/（kg·d）、高劑量組給予62g/（kg·d），秋水仙堿組給予0.1%的秋水仙堿0.1mg/（kg·d），扶正化瘀膠囊組給予扶正化瘀膠囊0.415g/（kg·d），空白組給予0.9%生理鹽水，直至9周末。

1.4取材分別在干預(yù)第3、6、9周末分批處死各組大鼠，稱重后麻醉（按照3.5mL/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射10%水合氯醛），打開(kāi)腹腔，抽取腹主動(dòng)脈動(dòng)脈血，4℃靜置3h后，4000r/min離心10min，分離血清；抽取血液后摘取大鼠肝臟和脾臟，用濾紙吸取血液。取肝臟右葉同一部位約1cm×1cm×0.5cm大小的肝臟組織放入4%多聚甲醛液中固定，以制作病理切片；再取肝臟右葉約1cm×1cm大小的新鮮肝臟組織放入凍存管內(nèi)，置-80℃超低溫冰箱保存，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1肝、脾指數(shù)計(jì)算摘取的大鼠肝臟和脾臟，分別用千分位電子天平稱取質(zhì)量并記錄，計(jì)算肝、脾指數(shù)。計(jì)算公式：肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量/體重×100%；脾指數(shù)（%）=脾質(zhì)量/體重×100%。

1.5.2肝臟病理觀察采用蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。1）取材和固定：取肝組織標(biāo)本，立即置于4%多聚甲醛中固定；2）沖洗：標(biāo)本固定24h后，流水沖洗30min；3）脫水；4）透明：將標(biāo)本經(jīng)二甲苯（Ⅰ）→二甲苯（Ⅱ）→二甲苯（Ⅲ）處理，各級(jí)時(shí)間20min左右；5）浸蠟及包埋：將含有肝臟組織的包埋盒放在熔蠟箱內(nèi)約1h，共3次。切片、粘片及烤片：用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片后粘片，烤片2h后進(jìn)入染色過(guò)程。HE染色及Masson染色步驟參照試劑盒說(shuō)明書。肝纖維化病理參照標(biāo)準(zhǔn)：參照2000年西安會(huì)議上由中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的慢性肝炎分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.5.3E-Cadherin、Vimentin、TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。1）將切片脫蠟入蒸餾水，PBS洗5min后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗5min×3次，3%H2O2孵育10min，PBS洗5min×3次，一抗作用37℃2h，PBS洗5min×3次，二抗作用37℃1h，PBS洗5min×3次，顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸、乙醇分色，飽和碳酸鋰返藍(lán)，上行脫水、透明、封片。2）光鏡下觀察各指標(biāo)表達(dá)，每張切片從左至右隨機(jī)選擇5個(gè)視野觀察各指標(biāo)的陽(yáng)性表達(dá)情況。應(yīng)用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)分析軟件測(cè)量各指標(biāo)的光密度值，計(jì)算平均吸光度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.4E-Cadherin、Vimentin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、Smad2的mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR方法檢測(cè)。1）RNA制備：按Trizol試劑盒說(shuō)明書步驟提取RNA，測(cè)A值（260nm，280nm）。其余樣品-20℃凍存或立即反轉(zhuǎn)錄。2）RNA反轉(zhuǎn)錄：使用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastQuantRTKit）合成第一鏈cDNA，得到的cDNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或低溫保存；3）Real-timePCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系20μL/管，2×SyBrGreenMix10μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），DEPCH2O7μL，cDNA1μL。引物序列如表1。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃35s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的原始檢測(cè)結(jié)果，按照相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。2-⊿⊿Ct計(jì)算方法：⊿⊿Ct=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct管家基因）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較使用單因素方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊使用LSD方法進(jìn)行組間的兩兩比較；方差不齊先用Welch方法校正，然后再用DunnettT3方法進(jìn)行各組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1對(duì)大鼠一般情況的影響

空白組：大鼠精力充沛，反應(yīng)靈活，毛發(fā)有光澤，脾氣溫和，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)死亡。模型組：大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，目光呆滯，毛發(fā)粗糙欠光澤，脫落較多，脾氣暴躁，對(duì)造模實(shí)驗(yàn)不配合，并且后期有腹部膨隆、口唇及皮毛出血等現(xiàn)象，無(wú)死亡。桃紅芪術(shù)組（低劑量組、中劑量組、高劑量組）和對(duì)照藥物組（秋水仙堿組、扶正化瘀膠囊組）：精力較充沛，反應(yīng)靈敏，目光靈活，毛發(fā)較光澤，脾氣較好，對(duì)造模及灌胃過(guò)程配合較好，桃紅芪術(shù)高劑量組和秋水仙堿組各死亡1只。

2.2對(duì)大鼠肝纖維化程度的影響

從干預(yù)第3周至第9周的HE染色及Masson染色圖片可以看出，第3周HE染色造模病理圖片中部分纖維組織增生，Masson染色病理圖片中少許纖維組織著色，提示部分組織發(fā)生纖維化，桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組改善最為明顯；第6周模型組病理圖片已經(jīng)存在纖維縱隔，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，形成假小葉，部分區(qū)肝被膜纖維組織顯著增生，提示肝纖維化造模成功，其他用藥各組病理程度均較模型組輕，模型組Masson染色纖維組織明顯增多，其他各組纖維染色不及模型組顯著，提示桃紅芪術(shù)及扶正化瘀膠囊、秋水仙堿對(duì)于大鼠肝纖維化具有明顯的緩解作用，桃紅芪術(shù)高劑量組改善較其他組顯著。見(jiàn)圖1。第9周HE染色圖片可見(jiàn)造模各組均形成假小葉，但是用藥各組假小葉結(jié)構(gòu)均較模型組有所改善，特別是桃紅芪術(shù)中劑量組及高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改善最為明顯，模型組染色纖維顯著增多，用藥各組纖維染色增多程度不及模型組。

2.3對(duì)大鼠肝組織E-Cadherin、Vimentin、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

從第9周數(shù)據(jù)分析，與模型組比較，用藥各組E-cadherin表達(dá)較模型組表達(dá)明顯增加、TGF-β1表達(dá)較模型組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），用藥各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組和扶正化瘀膠囊組作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2～4，表2。

2.4對(duì)大鼠肝組織E-Cadherin、Vimentin、TGF-β1、Smad2mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Smad2mRNA表達(dá)量升高（P<0.05），說(shuō)明造模過(guò)程中，Smad2mRNA表達(dá)上升，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而發(fā)生肝纖維化；桃紅芪術(shù)低劑量組TGF-βmRNA、VimentinmRNA、Smad2mRNA表達(dá)下降（P<0.05），桃紅芪術(shù)軟肝煎中劑量組Smad2mRNA表達(dá)下降（P<0.05）；桃紅芪術(shù)高劑量組E-cadherinmRNA表達(dá)上升（P<0.05），說(shuō)明桃紅芪術(shù)軟肝煎可以通過(guò)下調(diào)Smad2mRNA表達(dá)，下調(diào)TGF-β表達(dá)，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其中以桃紅芪術(shù)軟肝煎低劑量組療效最好。

5.1大鼠RT-PCRmRNA曲線見(jiàn)圖6。

3討論

肝纖維化是肝臟受損傷后（如肝臟感染發(fā)生乙型肝炎或丙型肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝病、自身免疫性肝病等）的結(jié)果，病理性肝纖維化主要?dú)w因于纖維化與基質(zhì)降解所造成的失衡[7]。上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymalTransition，EMT）是指在組織重建和多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育中存在的現(xiàn)象[8]，其主要特征為：上皮細(xì)胞標(biāo)志物鈣黏蛋白E-cadherin表達(dá)的降低或缺失；間質(zhì)細(xì)胞表型的獲得如Vimentin等標(biāo)志物的升高及細(xì)胞形態(tài)間質(zhì)化等。研究發(fā)現(xiàn)EMT分為3型，其中2型EMT與器官纖維化密切相關(guān)[9]。

許多信號(hào)通路參與肝纖維化的過(guò)程，有研究認(rèn)為TGF-β1是導(dǎo)致肝纖維化最重要的細(xì)胞因子[10]。肝臟受損后，肝臟內(nèi)TGF-β1表達(dá)明顯上升，與TGF-β受體（TGF-betaReceptors，TβR）相結(jié)合，并進(jìn)一步活化下游的Smad蛋白（如Smad2、Smad3、Smad5、Smad8等），最終導(dǎo)致大量膠原纖維的產(chǎn)生，形成肝纖維化[11]。在肝纖維化中，TGF-β誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞發(fā)生EMT，是成纖維細(xì)胞的潛在來(lái)源之一[12]。

目前，肝纖維化動(dòng)物模型一直是我們從事肝纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)及難題，李萍等[13]對(duì)30只雄性Wistar大鼠給予腹腔注射牛血清白蛋白成功制作肝纖維化模型。王曉晗等[14]通過(guò)喂養(yǎng)C57/B6雄性小鼠含0.1%的3.5-二乙氧基羰基-1.4-二氫-2.4.6-三甲基吡啶（DDC）飼料成功構(gòu)建肝纖維化模型。李旭等[15]給Wistar大鼠采用膽總管結(jié)扎術(shù)的方法制作肝纖維化模型。Fan等[16]采用SD大鼠腹腔注射50%CCl4/橄欖油溶液0.2mL/100g造模。還有使用復(fù)合因素造模者，張貴陽(yáng)等[17]曾采用CCl4聯(lián)合高脂低蛋白食物飲食、30%乙醇飲用水等控制因素的方法制作大鼠肝纖維化模型，6周即可成模。目前國(guó)際常用模型多為單一造模方式，較少使用復(fù)合造模方法，避免造模過(guò)程中產(chǎn)生較多干擾因素，較經(jīng)典的模型是Nakamura等[18]對(duì)Wistar大鼠腹腔注射1mL50%CCl4/橄欖油溶液2次每周制作肝纖維化模型，4～8周即可成模，本研究采用此種造模方法，第6周模型組HE染色及Masson染色病理圖片可見(jiàn)假小葉形成，肝纖維化模型成功形成。金明麗等[19]研究四氯化碳不同注射方式對(duì)于構(gòu)建大鼠不同分期肝纖維化模型的影響，發(fā)現(xiàn)腹腔注射及皮下注射的方式均可以建立大鼠不同分期的肝纖維化模型，但是皮下注射造模死亡率比腹腔注射的死亡率低，但是造模需要的時(shí)間較長(zhǎng)，2種注射方式獲得有意義的肝纖維化模型無(wú)明顯差異。

Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)外源性骨形態(tài)生成蛋白可以緩解血吸蟲(chóng)病肝纖維化小鼠的急性期和慢性期進(jìn)展，并且其機(jī)制可能是通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。Tang等[21]通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為積雪草酸可能是抗肝纖維化的潛在藥物，其機(jī)制通過(guò)誘導(dǎo)Smad7針對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)的肝纖維化的阻斷作用實(shí)現(xiàn)的。Zhou等[22]將200nmol/L的紫杉醇干預(yù)經(jīng)過(guò)人重組TGF-β1誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)后的肝星狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Smad2/3的磷酸化作用，從而抑制膠原纖維Ⅰ和Ⅲ及纖連蛋白的表達(dá)，認(rèn)為紫杉醇可以通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)緩解肝纖維化。喻勤等[23]研究發(fā)現(xiàn)荔枝核總黃酮通過(guò)抑制TGF-β1及Smad3，上調(diào)Smad7減輕二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化損傷程度。趙昉等[24]發(fā)現(xiàn)健脾軟肝方可以抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路中TGF-β1、TGF-βR1、及Smad3、Smad7的表達(dá)，從而緩解CCl4大鼠肝纖維化程度。牛學(xué)敏等[25]發(fā)現(xiàn)益氣活血方可以使TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。鄧?yán)虻萚26]研究認(rèn)為復(fù)方鱉甲軟肝片可以通過(guò)抑制肝生長(zhǎng)因子表達(dá)來(lái)抗大鼠肝纖維化。張智慧等[27]認(rèn)為銀杏葉提取物（GbE）可以降低TGF-β1的表達(dá)，有效防止CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的進(jìn)展。尚雙艷[28]研究發(fā)現(xiàn)香附多糖組大鼠的組織金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）和TGF-β1水平明顯低于模型組，提示香附多糖可有效改善肝纖維化大鼠肝臟纖維化。黃晨愷等[29]熊果酸（UrsolicAcid，UA）這種從藥用植物中提取出的天然三萜類化合物，能抑制肝臟中TGF-β的表達(dá)，從而下調(diào)下游促纖維化信號(hào)通路，減少I型膠原的產(chǎn)生。楊欣等[30]和夏雪皎等[31]研究得出結(jié)論：疏肝健脾活血方可以通過(guò)影響大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而顯著改善肝纖維化大鼠肝組織病理變化，具有不錯(cuò)的抗肝纖維化作用。馬瀅等[32]認(rèn)為丹酚酸B在二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)肝纖維化-肝癌進(jìn)程中，可能通過(guò)增強(qiáng)pSmad3C/p21介導(dǎo)的抑癌信號(hào)來(lái)減弱pSmad3L/PAI-1/c-Myc介導(dǎo)的促纖維化-癌變信號(hào)，從而阻礙肝纖維化向肝癌發(fā)展的進(jìn)程。張可鋒等[33]發(fā)現(xiàn)七味凈肝靈的高、中劑量組大鼠的肝纖維化病變程度比模型組減輕明顯，從而得出結(jié)論：七味凈肝靈對(duì)于DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有顯著的改善作用，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。張玉等[34]研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHM）能夠通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)從而抑制HSC-T6細(xì)胞的活化。楊文明等[35]觀察發(fā)現(xiàn)肝豆扶木湯可以降低TX小鼠肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，作用機(jī)制可能是抑制TGF-β1和Smad2蛋白的表達(dá)以及上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)。呂建林等[36]研究發(fā)現(xiàn)海珠益肝化纖方可降低肝纖維化大鼠α-SMA和TGFβ1的表達(dá)從而抑制肝纖維化的進(jìn)展。章圣朋等[37]認(rèn)為夏枯草總?cè)仆ㄟ^(guò)下調(diào)p-ERK表達(dá)和調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路保護(hù)肝臟。張家富等[38]觀察肝樂(lè)顆粒中、高劑量組可以減輕肝組織病理?yè)p傷程度，減少膠原纖維沉積，還可以顯著降低Smad2，CollagenⅠ，TGF-β1，TβRⅠ蛋白及mRNA的表達(dá)。

在肝纖維化過(guò)程中，肝臟內(nèi)膠原纖維組織增加，造成肝臟重量增加；肝纖維化時(shí)，肝組織受損后，門靜脈系統(tǒng)血液回流受阻，壓力增高，脾靜脈回流受阻，造成脾臟瘀血，最終導(dǎo)致脾臟增大，本研究發(fā)現(xiàn)桃紅芪術(shù)軟肝煎可以降低CCl4大鼠肝纖維化的肝脾值，緩解肝脾淤血情況；增加肝纖維化大鼠體重，改善營(yíng)養(yǎng)狀況；隨著造模給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，各給藥組均有阻斷模型大鼠肝組織纖維化進(jìn)展的功效，以桃紅芪術(shù)軟肝煎中、高劑量組作用最為明顯；免疫組織化學(xué)蛋白表達(dá)結(jié)果及RT-PCRmRNA結(jié)果顯示桃紅芪術(shù)軟肝煎可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)TGF-β及Vimentin、Smad2蛋白表達(dá)，提示桃紅芪術(shù)軟肝煎可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，降低Smad2蛋白表達(dá)，從而下調(diào)TGF-β、Vimentin，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，發(fā)揮改善上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、治療肝纖維化的作用。

結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肝脾指數(shù)、病理染色、免疫組織化學(xué)及RT-PCR結(jié)果，可以看出桃紅芪術(shù)軟肝煎中、高劑量均有較好的治療肝纖維化的作用，對(duì)比扶正化瘀膠囊和秋水仙堿組，也有較好的療效。扶正化瘀膠囊由蟲(chóng)草、絞股藍(lán)、松花粉、五味子、桃仁、丹參等藥物組成[39]，具活血祛瘀，益精養(yǎng)肝之效。已被證實(shí)對(duì)于治療肝纖維化具有較好療效[40-46]。西醫(yī)對(duì)于肝纖維化沒(méi)有特效用藥，研究發(fā)現(xiàn)秋水仙堿可以刺激膠原酶的活性，促進(jìn)膠原的降解[47]，孫嘉臨和王先化[48]發(fā)現(xiàn)秋水仙堿可以降低肝纖維化大鼠血清中的腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor，TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ），通過(guò)抑制炎性反應(yīng)來(lái)緩解肝纖維化。研究證明，桃紅芪術(shù)軟肝煎與中成藥扶正化瘀膠囊、西藥秋水仙堿具有相同甚至更好的療效，因此，桃紅芪術(shù)軟肝煎有希望成為治療肝纖維化的潛在用藥，有待于臨床療效的驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]ZhangB，WangZ，DengB，etal.IdentificationofEnolase1andThrombospondin-1asserumbiomarkersinHBVhepaticfibrosisbyproteomics[J].ProteomeSci，2013，11（1）：30.

[2]LimYS，KimWR.Theglobalimpactofhepaticfibrosisandend-stageliverdisease[J].ClinLiverDis，2008，12（4）：733-746，vii.

[3]BissellDM.Chronicliverinjury，TGF-beta，andcancer[J].ExpMolMed，2001，33（4）：179-190.

[4]BissellDM，RoulotD，GeorgeJ.Transforminggrowthfactorbetaandtheliver[J].Hepatology，2001，34（5）：859-867.

[5]LiR，XuL，LiangT，etal.PuerarinmediateshepatoprotectionagainstCCl4-inducedhepaticfibrosisratsthroughattenuationofinflammationresponseandameliorationofmetabolicfunction[J].FoodChemToxicol，2013，52：69-75.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)，肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329.

[7]LinHJ，ChenJY，LinCF，etal.HepatoprotectiveeffectsofYiGuanJian，anherbalmedicine，inratswithdimethylnitrosamine-inducedliverfibrosis[J].JEthnopharmacol，2011，134（3）：953-960.

[8]盛霞，劉紅勝，沈晶瑩，等.CD151及整合素α6在腸癌中的表達(dá)及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J].世界華人消化雜志，2015，23（5）：852-856.

[9]FirrincieliD，BoissanM，ChignardN.Epithelial-mesenchymaltransitionintheliver[J].GastroenterolClinBiol，2010，34（10）：523-528.

[10]李欣，朱英.肝纖維化發(fā)生相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志，2015，18（1）：101-104.

[11]呂濤.TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路與肝纖維化[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（6）：735-740.

[12]湯志杰，張茂娜，陳莉.肝癌和肝纖維化發(fā)生EMT及相關(guān)信號(hào)通路的分子機(jī)制[J].實(shí)用癌癥雜志，2014，29（1）：113-116.

[13]李萍，楊秋輝，王俊嶺，等.吡菲尼酮對(duì)牛血清蛋白誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝損害的保護(hù)作用觀察[J].實(shí)用肝臟病雜志，2015，18（1）：63-66.

[14]王曉晗，艾羅燕，許青青，等.A20在肝纖維化小鼠肝組織中的表達(dá)及相關(guān)研究[J].肝臟，2015，20（1）：27-29.

[15]李旭，蔡雙明，寧佐偉，等.螺內(nèi)酯對(duì)肝纖維化大鼠肝竇血管生成的抑制作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（8）：1135-1138，1142.

[16]FanW，ShiB，WeiH，etal.Γ-aminobutyricacidBreceptorimprovescarbontetrachloride-inducedliverfibrosisinrats[J].DigDisSci，2013，58（7）：1909-1915.

[17]張貴陽(yáng)，楊衛(wèi)平，陳皓.肝硬化動(dòng)物模型構(gòu)建的研究進(jìn)展[J].外科理論與實(shí)踐，2008，13（3）：266-269.

[18]NakamuraT，AkiyoshiH，SaitoI，etal.Adenovirus-mediatedgeneexpressionintheseptalcellsofcirrhoticratlivers[J].JHepatol，1999，30（1）：101-106.

[19]金明麗，潘志華，舒健，等.四氯化碳不同注射方式誘導(dǎo)大鼠不同分期肝纖維化模型的研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2018，39（3）：270-272.

[20]ChenBL，PengJ，LiQF，etal.Exogenousbonemorphogeneticprotein-7reduceshepaticfibrosisinSchistosomajaponicum-infectedmiceviatransforminggrowthfactor-β/Smadsignaling[J].WorldJGastroenterol2013，19（9）：1405-1415.

[21]TangLX，HeRH，YangG，etal.AsiaticacidinhibitsliverfibrosisbyblockingTGF-beta/Smadsignalinginvivoandinvitro[J].PLoSOne，2012，7（2）：e31350.

[22]ZhouJ，ZhongDW，WangQW，etal.PaclitaxelamelioratesfibrosisinhepaticstellatecellsviainhibitionofTGF-beta/Smadactivity[J].WorldJGastroenterol，2010，16（26）：3330-3334.

[23]喻勤，傅向陽(yáng)，羅偉生，等.荔枝核總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：223-227.

[24]趙昉，羅大有，謝慧珺，等.健脾軟肝方對(duì)肝纖維化TGF-β/Smad細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].中藥材，2012，35（4）：617-620.

[25]牛學(xué)敏，王寶玉，王洋，等.PTEN在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型中的作用及益氣活血方對(duì)其的影響[J].臨床肝膽病雜志，2018，34（1）：122-128.

[26]鄧?yán)?，申寶德，劉園，等.復(fù)方鱉甲軟肝片減方對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響及機(jī)制研究[J].中草藥，2018，49（6）：1371-1378.

[27]張智慧，陳芝蕓，葉蕾，等.銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟血管緊張素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2018，53（2）：91-93.

[28]尚雙艷，高翔.香附多糖對(duì)牛血清白蛋白誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清MMP-2、TIMP-2和TGF-β1水平的影響[J].實(shí)用肝臟病雜志，2018，21（1）：42-45.

[29]黃晨愷，甘達(dá)凱，張望，等.熊果酸對(duì)肝纖維化大鼠NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2018，38（4）：485-491.

[30]楊欣，李清林，陳卓輝，等.疏肝健脾活血方對(duì)肝纖維化過(guò)程中大鼠TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（4）：1694-1698.

[31]夏雪皎，林庚庭，滕飛，等.疏肝健脾活血方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織HIF-1α蛋白及VEGFmRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（4）：1357-1360.

[32]馬瀅，方萌，伍超，等.丹酚酸B調(diào)控pSmad3C/pSmad3L發(fā)揮抗肝纖維化-肝細(xì)胞癌作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2018，34（1）：44-50.

[33]張可鋒，黃思茂，陳毅飛，等.七味凈肝靈對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制[J].中藥材，2018，4（2）：464-467.

[34]張玉，周曦，易龍，等.二氫楊梅素通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化的作用研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，40（4）：282-289.

[35]楊文明，唐露露，謝文婷，等.肝豆扶木湯對(duì)TX小鼠肝纖維化TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（4）：404-407.

[36]呂建林，冉思邈，陳永洪，等.海珠益肝化纖方對(duì)肝纖維化大鼠α-SMA和TGFβ1表達(dá)影響的研究[J].大眾科技，2018，20（1）：42-44.

[37]章圣朋，何勇，徐濤，等.夏枯草總?cè)普{(diào)控ERK、TGF-β1/Smad通路對(duì)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（2）：261-266.

[38]張家富，姜輝，高家榮，等.肝樂(lè)顆粒對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β_1/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（6）：169-174.

[39]SunS，DaiJ，WangW，etal.MetabonomicEvaluationofZHENGDifferentiationandTreatmentbyFuzhenghuayuTabletinHepatitis-B-CausedCirrhosis[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2012，2012：453503.

[40]LiuC，HuY，XuL，etal.EffectofFuzhengHuayuformulaanditsactionsagainstliverfibrosis[J].ChinMed，2009，4：12.

[41]WangQL，YuanJL，TaoYY，etal.FuzhengHuayurecipeandvitaminEreverserenalinterstitialfibrosisthroughcounteractingTGF-beta1-inducedepithelial-to-mesenchymaltransition[J].JEthnopharmacol，2010，127（3）：631-640.

[42]任公平，張忠敏，孫琳林，等.扶正化瘀方對(duì)大鼠肝癌前病變細(xì)胞周期調(diào)控的影響[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（11）：1699-1700.

[43]王駱冰，閆秀川，曾貞，等.扶正化瘀方與黃芪湯合用對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠的治療作用[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（13）：1740-1744.

[44]姜春萌，劉成海，劉成.扶正化瘀膠囊對(duì)肝星狀細(xì)胞激活的干預(yù)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2003，11（5）：280-283.

[45]劉崇敏，胡坪，李醫(yī)明，等.扶正化瘀復(fù)方有效組分群的配伍篩選和驗(yàn)證[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，28（6）：85-90.

[46]肖作漢.扶正化瘀膠囊結(jié)合常規(guī)療法治療慢性乙型肝炎肝纖維化104例[J].上海中醫(yī)藥雜志2014，48（2）：29-30.

[47]梁擴(kuò)寰.肝臟病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：571-587.

[48]孫嘉臨，王先化.秋水仙堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（14）：1-2.

（2017-12-24收稿責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）