陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮提取工藝響應曲面法的優(yōu)化

張爽　劉治飛　高潔　問娟娟

摘要 目的：評價響應曲面法優(yōu)選出超聲輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮類化合物的最優(yōu)方案。方法：實驗以陜產(chǎn)瞿麥為原料，乙醇為提取劑，在單因素實驗的基礎上，通過響應面實驗對超聲輔助法提取陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的工藝進行優(yōu)化。結(jié)果：優(yōu)選出了超聲輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的最佳工藝條件：液料比10倍、提取功率140W、乙醇濃度80%時，總黃酮的提取率最大可以達到0.851%。結(jié)論：工藝的實驗值與預測值基本相符，采用響應曲面法優(yōu)選超聲輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中黃酮類化合物的提取工藝穩(wěn)定可行，為陜產(chǎn)瞿麥資源的開發(fā)和利用提供一定的參考依據(jù)。

關鍵詞 陜產(chǎn)瞿麥；黃酮類化合物；超聲提取；響應曲面法；單因素試驗；紫外可見分光光度法；工藝條件；提取率

AbstractObjective：ToselecttheoptimizedplanofultrasonicassistedextractingtotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxibytheresponsesurfacemethod.Methods：Inthisexperiment，ShaanxiproducingHerbaDianthiwastakenasrawmaterial，andethanolasextractionagent.Onthebasisofsinglefactorexperiment，theextractionprocessoftotalflavonoidsfromHerbaDianthiofShaanxibyultrasonicassistedmethodwasoptimizedwiththeresponsesurfacemethod.Results：TheultrasonicassistedextractionconditionsoftotalflavonoidsinHerbaDianthifromShaanxiwereoptimized：liquidandmaterialratiowas10times，extractionpower140W，80%ethanolconcentration，andtheextractionrateofflavonoidscouldreach0.851%.Conclusion：Theprocessoftheexperimentalvaluesarebasicallyconsistentwiththepredictedvalue，indicatingusingresponsesurfacemethodologytooptimizeultrasonicassistedextractiontechnologyofflavonoidsinHerbaDianthiinShaanxiProvinceisstableandfeasible，andprovidingreferenceforthedevelopmentandutilizationofHerbadianthiresourcesinShaanxiProvince.

KeyWordsHerbaDianthiinShaanxiProvince；Flavonoids；Ultrasonicextraction；Responsesurfacemethod；Singlefactortest；UVvisiblespectrophotometry；Processconditions；Extractionrate

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.056

瞿麥又名野麥、石柱花、十樣景花等，為石竹科石竹屬植物瞿麥DianthussuperbusL.的干燥地上部分。瞿麥是我國常用的傳統(tǒng)中藥，性味苦、寒；歸心經(jīng)、小腸經(jīng)、膀胱經(jīng)。具有清熱利水，破血通經(jīng)之功效，主治小便不通、熱淋、血淋、砂石淋、目赤腫痛、經(jīng)閉等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學的研究表明，瞿麥具有抗腫瘤、利尿、興奮子宮、抗菌、免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化作用、溶血作用等作用。其主要成分有皂苷類、環(huán)肽類、黃酮類、蒽醌類、有機酸類、揮發(fā)油類、生物堿類、維生素、色素及多糖等[2-3]。

響應曲面法是一種統(tǒng)計學試驗設計方法，該法通過建立連續(xù)變量曲面模型，對影響過程的因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平，而且所需要的觀察組數(shù)相對較少，可節(jié)省人力物力。中藥有效成分復雜，有效成分含量相對較低，且在提取過程中會受到很多因素的影響，響應曲面法可以有效的優(yōu)化中藥有效成分的提取工藝，其實驗次數(shù)少，可以在一定程度上縮短實驗周期[4]。本實驗以陜產(chǎn)瞿麥作為研究對象，采用響應曲面法對超聲波輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中的活性成分總黃酮進行了工藝的優(yōu)化。以期為陜產(chǎn)瞿麥中黃酮類化合物的提取及陜產(chǎn)瞿麥資源的進一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與儀器

1.1實驗材料瞿麥（陜西省眉縣藥材總公司，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為石竹科植物瞿麥DianthussuperbusL.的帶花全草）；蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；氫氧化鈉（分析純）。

1.2實驗儀器微波萃取儀XH100B（北京詳鋯發(fā)展有限公司）；高速萬能粉碎機FW100（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104型電子分析天平（天津鑫博得儀器有限公司）；紫外分光光度計UV2400（天津精密科學儀器有限公司）。

2方法

2.1溶液的配制

對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品0.0109g，置于50mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，繼續(xù)加70%乙醇溶液至刻度，搖勻，制成每1mL含0.218mg的對照品溶液，然后給溶劑貼上標簽備用。

供試品溶液的制備取陜產(chǎn)瞿麥粉末5g，精密稱取，置于100mL具塞錐形瓶中，加入80%的乙醇50mL，精密稱量，超聲提取25min，取出放置至室溫，加80%的乙醇適量，補足失去的質(zhì)量，抽濾棄去藥渣，取濾液置于25mL的容量瓶中，得到供試品溶液。

2.2測定波長的選擇

取試驗樣品適量，在亞硝酸鈉溶液為1.0mL5%存在的堿性條件下，經(jīng)溶液硝酸鋁顯色后，以試劑作為空白參比液在420～700nm波長范圍內(nèi)測定吸光度，在506nm波長處有最大吸收，故測定時選用此波長。

2.3標準曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液2、3、4、5、6、7mL，分別置于25mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液lmL，搖勻，放置5min；加人10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入4%氫氧化鈉溶液10mL，用80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min，以上述試劑作為空白對照，分別在506nm處測定吸光度[5]。以吸光度（A）為縱坐標，以質(zhì)量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。

2.4陜產(chǎn)瞿麥中黃酮得率的計算

陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮得率（%）=提取的總黃酮質(zhì)量/瞿麥粉末質(zhì)量×100%。

2.5陜產(chǎn)瞿麥中黃酮的提取工藝的條件

2.5.1單因素實驗以乙醇的濃度、液料比、提取功率及超聲時間為單因素，考查各因素對陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮得率的影響。

2.5.2響應曲面實驗設計根據(jù)Box-Behnken軟件提供的數(shù)據(jù)模型，以陜產(chǎn)瞿麥總黃酮提取率作為響應面值，并選擇乙醇濃度A、液料比B、功率C這3個因素為自變量，采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert8.0.6中的響應面進行分析，從而獲取最佳工藝參數(shù)。見表1。

3結(jié)果與分析

3.1蘆丁標準曲線

按照2.3的方法繪制蘆丁標準曲線，以蘆丁對照品的質(zhì)量（mg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到蘆丁對照品的標準曲線為Y=0.4637X-0.0426，相關系數(shù)R2=0.9966，由此說明蘆丁對照品的質(zhì)量在0.4～1.6mg范圍時吸光度與質(zhì)量呈良好的線性關系。

3.2單因素實驗

3.2.1超聲時間對總黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數(shù)80%，提取溫度40℃，液料比10（倍），功率160W，準確稱取5g瞿麥粉末5份，提取時間分別按10min、15min、20min、25min、30min、35min，進行超聲提取，根據(jù)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的得率確定最佳超聲功率。見圖1。

從圖1可以看出，總黃酮得率隨著超聲時間的增加逐漸上升，到25min時上升較平緩，其原因可能為隨著超聲時間的增長，是黃酮類化合物溶出不明顯，已經(jīng)達到飽和[6]。因此，雖然提取時間增長了，但總黃酮的得率變化不大。所以，選擇25min為最佳提取時間。

3.2.2乙醇濃度對總黃酮提取率的影響固定液料比10（倍），功率160W，提取溫度40℃，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別用乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超聲提取，根據(jù)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的得率確定最佳乙醇濃度。見圖2。

從圖2可以看出，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加逐漸上升，開始時黃酮得率增加明顯，但當乙醇濃度達到80%以后黃酮得率開始下降。其原因可能是隨著乙醇濃度的增加，脂溶性的成分被溶解出來，從而干擾了黃酮類化合物的提取，導致總黃酮的得率反而降低[7]。因此，乙醇濃度以80%左右較為合適。

3.2.3料液比對總黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數(shù)80%，功率160W，提取溫度40℃，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別按液料比（倍）為8、9、10、11、12，進行超聲提取，根據(jù)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的得率確定最佳液料比。見圖3。

由圖3可以看出，總黃酮的得率隨液料比的增加而逐漸增大，當料液比大于10（倍）時，總黃酮的得率逐漸降低，其原因可能是當液料比增大到一定程度時導致一些非黃酮類物質(zhì)溶出，與黃酮類物質(zhì)競爭溶出，干擾了黃酮類物質(zhì)的溶出[8-9]。因此選取10（倍）為最佳液料比。

3.2.4超聲功率對黃酮提取率的影響固定乙醇體積分數(shù)80%，提取溫度40℃，液料比10（倍），功率160W，提取時間25min，準確稱取5g瞿麥粉末5份，分別按80W、100W、120W、140W、160W，進行超聲提取，根據(jù)陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的得率確定最佳超聲功率。見圖4。

由圖4可知，總黃酮得率隨著超聲功率的增加逐漸上升，當超聲功率為140W時瞿麥總黃酮的得率最高，140W以后總黃酮得率逐漸下降。理論上講超聲功率越大，細胞壁越容易被破壞，越有利于物質(zhì)的溶出，但在黃酮類物質(zhì)溶出的同時也導致黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞或是其他非黃酮類物質(zhì)的溶出，干擾了總黃酮的得率[10]。因此超聲功率選用140W最合適。

3.3響應面試驗及結(jié)果分析

3.3.1響應曲面法在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert8.0.6軟件，以乙醇濃度A、液料比B、功率C作為超聲輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮提取率的影響因素，再通過以總黃酮的提取率作為響應平表數(shù)據(jù)進行帶入分析，得到表2和表3的回歸分析結(jié)果。

3.3.2回歸模型方程根據(jù)表3.6中，陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的提取率作為響應值，再使用Design-Expert8.0.6對數(shù)據(jù)進行全面的分析，最終得到了多元二次回歸模型方程：

其中：Y為陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的提取率，A、B、C為3因素的編碼值。

從回歸方程方差分析表中可發(fā)現(xiàn)，P模型<0.0001，F(xiàn)模型=76.89>0.05，表明了本研究選用的二次回歸方程模型非常顯著，可以用于實際的預測。陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的提取率F失擬=1.44>0.05，P失擬=0.3564>0.05，表示失擬不顯著。表中的決定系數(shù)R2=0.9093，調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.9771，說明此模型的實驗值與擬合值之間有很好的擬合度。

綜上所見，該模型可以很好表示出自變量和響應值之間的關系[12-13]。結(jié)合表2和表3我們可以分析看出，A、B、AB和BC對陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的提取率都產(chǎn)生顯著的影響，其中A和AB對陜產(chǎn)瞿麥中總黃酮的提取率極顯著。各因素對于陜產(chǎn)瞿麥總黃酮的提取率影響的排序：乙醇濃度A>料液比B>超聲功率C。