生物玻璃復(fù)合P-15多肽修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

王帥，李成庫，周延民（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院科研科，貴州遵義563000；.吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林長春300）

大體積骨缺損仍是醫(yī)學(xué)尚未解決的重大難題之一。自體骨移植仍被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而其應(yīng)用受到許多限制，如需開辟第二術(shù)區(qū)、手術(shù)時(shí)間長、引起供區(qū)損傷、可取骨量有限、植入后骨吸收等。近年來，異質(zhì)移植材料及人工合成材料的研究應(yīng)用取得了很大進(jìn)展。已有許多生物活性蛋白與各類支架材料復(fù)合以提高人工骨替代材料成骨能力的文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]；但蛋白與支架材料的吸附與緩釋，以及重組蛋白的成本及活性問題等限制了其臨床應(yīng)用。而黏附肽類保留了相關(guān)蛋白中發(fā)揮生理作用的主要成分，參與了細(xì)胞生物力信號的傳導(dǎo)，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化等，且空間構(gòu)象相對固定，合成簡單，P-15多肽就是其中的代表。

骨的有機(jī)成分中90%以上是由Ⅰ型膠原構(gòu)成的，在其α1鏈上一段與間充質(zhì)細(xì)胞結(jié)合且高度保守的15個(gè)氨基酸序列被稱為P-15[3]。其能與各種前體細(xì)胞上的整合素受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞黏附，釋放生成因子，協(xié)同促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化。攜帶P-15多肽的無機(jī)牛骨（PepGen P-15TM）在口腔上頜竇提升術(shù)[4]、牙周組織再生[5]，以及同富血小板纖維蛋白合用于骨再生[6]多有文獻(xiàn)報(bào)道，顯示了這種骨替代材料一定的優(yōu)越性。

生物玻璃是通過美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的人工骨材料，其與體液接觸后經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)，在材料表面形成富含硅的凝膠層，在此表面磷酸鈣聚集晶化形成碳酸羥基磷灰石，膠原和一些黏多糖也被吸附，新生的骨質(zhì)層可與生物玻璃緊密結(jié)合在一起[7]。因此，本研究聯(lián)合生物玻璃與P-15多肽各自的優(yōu)點(diǎn)用于骨缺損動物模型的修復(fù)，為以仿生多肽為基礎(chǔ)的生物材料的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 P-15序列為GTPGPQGIAGQRGVV，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；高效液相色譜法分析其純度為96.28%，質(zhì)譜圖報(bào)告結(jié)果相對分子質(zhì)量為1 393.58 D。生物玻璃購自北京國藥前景公司，速眠新麻醉劑Ⅱ、陸醒寧通用名等由解放軍軍需大學(xué)提供，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自奧地利PAA公司，堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、超凈工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41型）、GIOTTO鉬靶軟X線機(jī)（意大利IMS公司）、石蠟切片機(jī)（德國Letiz公司）、紫外分光光度儀U-2910（日本日立公司）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 選取Wistar大鼠10只（體重90.0～110.0 g）、5月齡雄性日本大耳白兔18只（體重2.1～2.8 kg），由吉林大學(xué)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 將Wistar大鼠采用速眠新麻醉劑Ⅱ進(jìn)行局部麻醉，固定于木板上，放血處死。完整取下股骨至足部，去皮，于75%乙醇內(nèi)浸泡5 min，全程保證大鼠骨骺段組織完整。在超凈工作臺上小心擰下股骨遠(yuǎn)心端，暴露干骺端，用20 mL注射器吸取約10 mL培養(yǎng)基，插入骨骺內(nèi)抽取骨髓，邊吸取邊注入離心管內(nèi)。脛骨給予相同處理。雙下肢吸取完畢后用吹管吹打離心管內(nèi)組織塊，1 000 r/min離心5 min，輕輕吹打離心管底部沉淀制成細(xì)胞懸液，移至100 mm培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使細(xì)胞及組織均勻分布，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞多層懸浮，置于37℃、含5%二氧化碳及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。48 h后首次換液，去除血細(xì)胞及其他懸浮細(xì)胞。視野內(nèi)可見圓形細(xì)胞、梭形多角細(xì)胞集簇分布。以后3 d更換1次培養(yǎng)液。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化。待細(xì)胞生長匯合達(dá)80%以上時(shí)消化傳代。用第3代細(xì)胞接種材料。

1.2.2 材料與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及ALP活性檢測 用電子分析天平稱取2 mg P-15多肽，溶于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，用0.22 μm濾器抽濾，制成1 mg/mL的 P-15 多肽液。然后分別稀釋成 100、200、400 μg/mL各200 μL。在超凈工作臺內(nèi)用分析天平稱取10 mg生物玻璃，置于24孔板的16孔內(nèi)，均勻鋪開，然后滴加40 μg/mL 的多肽液 100、200、400 μg/mL 各 4 孔作為實(shí)驗(yàn)組，另留4孔生物玻璃作為陰性對照組，4孔不加生物玻璃作為空白對照組。嚴(yán)密包扎孔板，置于150 r/min搖床中離心12 h，干燥后備用。第2代細(xì)胞生長匯合達(dá)80%以上時(shí)消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液為2×105/mL-1，接種在已鋪好復(fù)合材料（生物玻璃/P-15）的24孔板內(nèi)。分別于1、3、7、10 d檢測各組骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性和考馬斯亮藍(lán)總蛋白含量，通過紫外分光光度儀檢測光密度值。

1.2.3 兔顱骨缺損模型制備及材料植入 將18只5月齡健康雄性大耳白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，肌內(nèi)注射速眠新通用名0.7 mL麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺，顱頂區(qū)常規(guī)消毒備皮，沿顱頂中線自眼眶后緣向頸根部做一3 cm直線切口，用剝離子分離骨膜。在距眼眶后緣、顱中縫0.5 cm處用裂鉆磨制1 cm×1 cm的全層骨缺損區(qū)[復(fù)合材料組（生物玻璃復(fù)合質(zhì)量濃度為200μg/mL的P-15多肽）、陰性對照組（未復(fù)合P-15的生物玻璃）、空白對照組（不加生物玻璃）]，全程使用生理鹽水降溫。將預(yù)先準(zhǔn)備好的材料植入缺損區(qū)，拉攏縫合骨膜以固定材料，縫合皮膚。術(shù)后視動物狀態(tài)酌情給予蘇醒藥物，并肌肉注射60萬U青霉素。材料植入4、6、8周后麻醉、處死動物，迅速完整取下眶部以上的顱骨部分。立即放入預(yù)先配好的4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 組織學(xué)標(biāo)本制作及染色 標(biāo)本于4%多聚甲醛中固定24～48 h后沿冠狀面片切，用甲酸進(jìn)行脫鈣1周。常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE染色），封片觀察。改良Gomori染色：（1）常規(guī)脫蠟，天青石藍(lán)染液5 min；（2）水洗，常規(guī)HE染色用明礬蘇木精染液染細(xì)胞核，顯藍(lán)同HE染色；（3）用變色酸2R酸性復(fù)紅染色5～10 min；（4）用0.2% 醋酸水溶液洗 2～3次，肉眼觀察骨組織呈紅色，其他部分無色即可；（5）用亮綠染液復(fù)染；（6）用95%至無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。經(jīng)此法染色后骨組織紅染，膠原纖維等礦化程度較低的組織綠染。

1.2.5 軟X射線檢查 采用GIOTTO鉬靶軟X射線攝片，將所攝X線片用數(shù)碼單反相機(jī)拍照，采用Image pro plus選取骨缺損區(qū)域，segmentation工具定義正常骨組織顏色，以排除未降解材料的影響，然后計(jì)算各組兔顱骨缺損X線片中骨缺損處成骨面積（area sum）。將4周空白對照組兔顱骨缺損area sum定義為1，對4、6、8周復(fù)合材料組兔顱骨缺損成骨面積與4周空白對照組的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用多樣本均數(shù)單因素方差分析（one-wayANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性的影響 復(fù)合材料與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞排列具有一定方向性，呈魚群密集生長，材料周圍可見細(xì)胞緊密排列，平行或垂直于材料接觸面。實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)1 d后ALP活性即高于對照組，且質(zhì)量濃度為200 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性培養(yǎng)1、4、7、10 d后均明顯高于質(zhì)量濃度為100、400 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組及對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 復(fù)合材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性的影響

2.2 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的軟X射線分析 4周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)局部X射線阻射影面積較陰性對照組大，射區(qū)域之間高密度影像連接較廣泛，缺損處area sum明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)X射線阻射影密度較陰性對照組均勻，缺損處area sum明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但仍可見未降解的材料和少部分低密度區(qū)域。8周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)X射線阻射面積明顯大于陰性對照組、空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的軟X射線分析

2.3 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的HE染色分析 4周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)復(fù)合材料周邊有新生骨小梁和部分纖維組織，周圍有少量炎癥細(xì)胞，骨細(xì)胞陷窩較多;材料中心已可見到細(xì)胞及類骨基質(zhì)成分；材料之間有骨小梁連接。陰性對照組兔顱骨缺損區(qū)在生物玻璃周圍有薄層新骨形成，材料之間缺少骨組織的連接，由較多纖維組織包繞。6周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)復(fù)合材料中心骨基質(zhì)沉積明顯，有細(xì)胞與周圍骨小梁相連接，但材料周圍新生骨的基質(zhì)成分排列較紊亂；陰性對照組兔顱骨缺損區(qū)生物玻璃中心很少能觀察到細(xì)胞成分，但顆粒狀材料之間的骨組織比4周時(shí)明顯增多、增寬。8周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)復(fù)合材料中心有明顯骨樣組織沉積或可見梭形細(xì)胞呈網(wǎng)狀，周圍有成骨細(xì)胞緊密排列，形成的新骨可見板層樣結(jié)構(gòu)；陰性對照組兔顱骨缺損區(qū)生物玻璃中心可見細(xì)胞及基質(zhì)，顆粒狀材料之間新生骨組織較6周時(shí)繼續(xù)增多，但結(jié)構(gòu)紊亂。見圖3。

圖3 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的HE染色分析（HE染色，200×）

2.4 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的改良Gomori染色分析 4周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)復(fù)合材料（無色或綠染）周邊有新生骨小梁形成，材料與顆粒之間及材料與正常骨組織之間緊密相連，但礦化程度不高；陰性對照組兔顱骨缺損區(qū)材料顆粒周圍可見纖維組織，之間僅有薄層低礦化組織相連。6周時(shí)復(fù)合材料組兔顱骨缺損區(qū)復(fù)合材料顆粒之間連接廣泛，有類似髓腔結(jié)構(gòu)形成，部分材料中心可見礦化組織沉積明顯；陰性對照組兔顱骨缺損區(qū)材料之間彼此連接，但礦化程度稍低。見圖4。

圖4 不同材料修復(fù)兔顱骨缺損的改良Gomeri染色分析（Gomori染色，100×）

3 討 論

骨的有機(jī)成分中90%是由Ⅰ型膠原構(gòu)成的，在其α1鏈上一段與間充質(zhì)細(xì)胞結(jié)合且高度保守的15個(gè)氨基酸序列（766-GTPGPQGIAGQRGVV-780）被稱為P-15。其促進(jìn)成骨原理是這15個(gè)氨基酸殘基組成的多肽能與成骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的整合素受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞黏附。因提供了更多的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，使整個(gè)修復(fù)過程從骨缺損灶內(nèi)進(jìn)行三維式的成骨，創(chuàng)造了一種有利于細(xì)胞各種生理活動和新骨生成的微環(huán)境，導(dǎo)致高度血管化的大量新骨生成。本研究結(jié)果顯示，生物玻璃復(fù)合P-15多肽后在植入6周時(shí)即可形成大量新骨，且材料內(nèi)部形成類髓腔樣結(jié)構(gòu)，提示有新生血管。

KüBLER等[8]將人成骨細(xì)胞分別接種于Bio-base?、Bio-Oss?、PepGen P-15?等骨替代材料，6、9 d 后測定不同組細(xì)胞活力和增殖情況，結(jié)果顯示，PepGen P-15組細(xì)胞線粒體脫氫酶活性最強(qiáng)。用相差倒置顯微鏡觀察，PepGen P-15組成骨細(xì)胞圍繞材料多層排列，且在顆粒之間形成橋連。掃描電鏡也證實(shí)了其他材料表面的細(xì)胞數(shù)量和層次均不及PepGen P-15[8]。

國內(nèi)學(xué)者在制備胎牛骨無機(jī)骨基質(zhì)（FABM）上培養(yǎng)了人頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-15能更有效地促進(jìn)細(xì)胞與牛骨無機(jī)骨基質(zhì)之間的黏附；在P-15對人頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞的彈性模量研究中發(fā)現(xiàn)，P-15改變了細(xì)胞膜彈性模量，從而影響了細(xì)胞黏附，表明多肽P-15可作為有效的促成骨生長因子用于骨粉表面修飾[9]。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)合材料組骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性較陰性對照組明顯增加；當(dāng)復(fù)合的P-15多肽質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)與復(fù)合材料共培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞ALP活性明顯高于質(zhì)量濃度為100、400 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這種差異在接種后的前4 d尤為明顯，且細(xì)胞在復(fù)合材料周圍生長良好，排列規(guī)則。

本研究采用復(fù)合材料的主體為生物玻璃。生物玻璃是由鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽和二氧化硅組成的一類生物材料。當(dāng)其與體液接觸時(shí)會誘發(fā)3個(gè)階段的反應(yīng)，即擴(kuò)散、溶出、凝集沉淀。最終通過縮聚反應(yīng)和一系列重新排布形成了硅凝膠層[10]。該凝膠層具有較大的表面積，對蛋白多肽類具有一定吸附作用[11]。因此，本研究選擇生物玻璃作為P-15多肽的載體。本研究軟X射線結(jié)果顯示，復(fù)合材料組與陰性對照組比較，新骨形成面積較多，密度較均勻；組織學(xué)切片結(jié)果顯示，復(fù)合材料內(nèi)部較早出現(xiàn)細(xì)胞成分，未降解顆粒之間有眾多骨小梁相連，骨細(xì)胞陷窩多見，新骨形成速度及礦化程度均優(yōu)于陰性對照組。

鄧飛龍等[12]對P-15類材料的研究也證實(shí)了P-15多肽能將更多的細(xì)胞成分引入缺損處，從而加速新骨生成。另有動物實(shí)驗(yàn)研究表明，PepGen P-15的早期骨修復(fù)能力強(qiáng)于Bio-Oss及Cerasorb[13]。國外學(xué)者的2項(xiàng)多中心實(shí)驗(yàn)證明了PepGen P-15在治療牙周病骨缺損中的成骨效果[14]。但因體外與體內(nèi)環(huán)境具有差異，本研究中細(xì)胞與材料的體外共培養(yǎng)篩選出的多肽質(zhì)量濃度對體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)意義具有局限性。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)篩選出適宜成骨的P-15多肽質(zhì)量濃度，與生物玻璃復(fù)合后植入兔顱骨缺損模型中經(jīng)軟X射線分析和組織學(xué)檢查結(jié)果證實(shí)，復(fù)合材料的骨修復(fù)能力得到了一定的提高。本研究采用膠原仿生多肽來提高原有材料的成骨活性，希望能為骨替代材料的研究開辟思路。