飼糧添加魚油對蛋雞免疫機能的影響

龍 爍 武書庚 崔闖飛 張海軍 王 晶 齊廣海 馬友彪 楊林林

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室，生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京100081)

作為一種營養(yǎng)調(diào)控劑，ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)在調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫功能等方面的作用，逐漸受到重視。其在體內(nèi)參與氧化供能，調(diào)節(jié)脂類介質(zhì)的合成以及細胞因子的釋放和激活，還參與細胞膜組成，影響細胞膜結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控機體炎癥反應(yīng)并影響多種免疫細胞的功能[1]。營養(yǎng)免疫是在利用特殊營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控機體免疫情況、增強免疫功能，已受到國內(nèi)外許多學(xué)者重視。免疫營養(yǎng)劑能改變機體對病原體的免疫應(yīng)答，當(dāng)以高于適宜量飼喂時，可改變機體免疫反應(yīng)，膳食補充ω-3 PUFA的人群炎癥和自身免疫病的發(fā)病率較低，表明ω-3 PUFA具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性[2]。當(dāng)前在家禽中使用的免疫調(diào)節(jié)劑多系人類疾病模型中發(fā)揮抗炎作用的物質(zhì)[3]。

作為一種免疫營養(yǎng)劑，PUFA在臨床上常被用作治療炎性疾病。當(dāng)機體受到炎癥或免疫的刺激時，磷脂酶A2(PLA2)會催化磷脂甘油裂解，產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LPC)和類二十烷酸前體[1]。類二十烷酸的代表物質(zhì)有花生四烯酸(AA)、前列腺素(PG)等，急性炎癥反應(yīng)中，PGE2(以AA為前體)不僅發(fā)揮自身的促炎作用，還會誘發(fā)信號通路下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)途徑，使促炎細胞因子——腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)水平升高。ω-3 PUFA作為前體時，會產(chǎn)生促炎效果偏弱的PGE3，并以此削弱炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生抗炎效果[1]，同時也通過抑制樹突細胞中主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)的表達，抑制抗原呈遞削弱炎癥反應(yīng)[2]。ω-3 PUFA對家禽免疫應(yīng)答有潛在調(diào)節(jié)作用[4-5]。魚油是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的優(yōu)質(zhì)原料，是炎癥反應(yīng)的脂類介質(zhì)的前體物質(zhì)，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[6]，當(dāng)前對ω-3 PUFA的免疫作用的研究多集中在人體健康的研究中，對家禽尤其是高峰期產(chǎn)蛋雞的研究較少。因此，本試驗在高峰期產(chǎn)蛋雞飼糧中加入不同水平的魚油，探索ω-3 PUFA對蛋雞免疫器官指數(shù)、體液和細胞免疫的影響，以期為ω-3 PUFA對蛋雞免疫機能的調(diào)節(jié)作用提供試驗科學(xué)指導(dǎo)，為臨床營養(yǎng)與免疫關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼糧

試驗選用31周齡體況良好、產(chǎn)蛋率接近的海蘭褐蛋雞450只，采用單因子完全隨機設(shè)計，隨機分為5個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞。對照組(1組)飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗組(2～5組)在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上分別添加0.54%、1.08%、2.17%和4.34%的魚油，DHA含量分別為0.67、1.35、2.70和5.40 mg/g(測定值為0.76、1.13、2.73和4.55 mg/g)。魚油購自佛山市大茂飼料有限公司，實測DHA含量為125 mg/g。各組飼糧(組成及營養(yǎng)水平見表1)等氮等能，參照NY/T 33—2004配制，飼糧脂肪酸組成見表2。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items 組別 Groups12345蛋氨酸 Met0.360.360.360.360.44賴氨酸 Lys0.890.890.890.890.89

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of diets:VA 12 500 IU，VD34 125 IU，VE 15 IU，VK 2 mg，硫胺素 thiamine 1 mg，核黃素 riboflavin 8.5 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 11 mg，煙酸 niacin 32.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 8 mg，生物素 biotin 0.5 mg，二氫葉酸 dihydrofolic acid 1.25 mg，VB120.02 mg，Mn 65 mg，I 1 mg，F(xiàn)e 60 mg，Cu 8 mg，Zn 66 mg，膽堿 choline 1 000 mg，植酸酶 phytase 300 mg；蒙脫石 montmorillonite 1 000 mg，酵母培養(yǎng)物 yeast culture 10 g。

2)抗氧化劑為每千克飼糧提供 Antioxidant provided the following per kg of diets:乙氧基喹啉 ethoxyquin 150 mg，VE 100 mg，茶多酚 tea polyphenols 50 mg。

3)代謝能和有效磷為計算值，其余為實測值。The ME and AP were calculated values, while the others were measured values.

表2 飼糧脂肪酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗雞采用3層立體籠養(yǎng)，每籠3只，采用隨機編號安排組位，避免環(huán)境和位置影響。試驗雞自由采食和飲水，自然光照加人工補光(16 h/d)，光照強度20 lx，舍溫(20±2) ℃，相對濕度50%～60%，自然通風(fēng)結(jié)合縱向負壓通風(fēng)；每天清糞2次，每周消毒1次，常規(guī)免疫。每天喂料3次(08：00、13：00和18：00)，撿蛋1次。試驗預(yù)試期1周，正試期12周。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 免疫器官指數(shù)測定

正試期12周末，每重復(fù)取2只體重相近的蛋雞，稱重，頸靜脈放血致死，取脾臟和胸腺，分別稱重。

胸腺指數(shù)(%)=100×胸腺濕重/體重；脾臟指數(shù)(%)=100×脾臟濕重/體重。

1.3.2 血清免疫球蛋白A(IgA)含量測定

正試期12周末，每重復(fù)取1只雞，用含促凝劑采血管，空腹無菌翅靜脈采血2～3 mL，37 ℃水浴鍋水浴孵育6～7 h，取上層血清，分裝，-20 ℃儲存。用Abcam公司禽類IgA試劑盒檢測血清中IgA含量。

1.3.3 血清新城疫、禽流感H9抗體水平測定

對照組(1組)和3～5組蛋雞肌肉注射新久安(雞新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9亞型，SS/94株)二聯(lián)滅活疫苗。分別于注射前和注射后7、14和28 d采血，制備血清(方法見1.3.2)。使用IDVET禽流感H9抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測抗體水平，結(jié)果以S/N%[100×吸光度(OD)樣品值/OD陰性值]表示，S/N%越低，表明H9抗體水平越高。使用IDVET新城疫抗體ELISA試劑盒檢測新城疫抗體水平。

1.3.4 脾臟細胞因子基因表達測定

正試期12周末，每重復(fù)取1只雞，頸靜脈放血致死，取脾臟10 g左右置于RNA保護液中，置于液氮。4 ℃溶解RNA保護液，取80 mg置于含1 mL Trizol的1.5 mL無酶管中，置于樣品研磨儀(上海凈信科技)60 Hz研磨60 s，充分裂解脾臟細胞；加入200 μL氯仿振蕩30 s，4 ℃孵育3 min，12 000 r/min離心15 min；上清水相轉(zhuǎn)移至新無酶管中，加入等體積異丙醇，4 ℃孵育30 min，10 000 r/min離心10 min；棄上清留沉淀，75%酒精洗滌2次，棄上清留沉淀并晾干，用20～50 μL無酶水溶解沉淀，-80 ℃保存。紫外可見分光光度計(日本BioSpec-nano公司)測定總RNA濃度及純度，所有樣品OD比值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.0，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性(北京市六一儀器廠，DYY-6C型)。

使用天根FastQuant RT Kit(with gDNase)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[具體參照FastQuant RT Kit(with gDNase)說明書]，所得cDNA于-20 ℃保存或直接用于實時熒光定量PCR檢測。

實時熒光定量PCR檢測目的基因表達情況：使用天根SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒檢測白細胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細胞介素-10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)基因的表達量，并用實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)測定。本研究根據(jù)GenBank上公布的雞IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ基因的保守核苷酸序列，用Primer設(shè)計并合成5對特異性引物(引物序列見表3)，以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。以β-肌動蛋白(β-actin)表達量為參比，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，其中：△Ct=待測基因Ct-內(nèi)參基因Ct；△△Ct=試驗組△Ct-對照組△Ct。

1.3.5 脾臟淋巴細胞增殖和凋亡測定

脾臟淋巴細胞的制備：正試期12周末，對照組、3～5組每重復(fù)取1只雞，無菌剖檢取脾臟，迅速取10 g左右置于200目細胞過濾網(wǎng)上，同時加入1～2 mL無菌Hank’s液，用無菌玻璃研磨杵將脾臟組織磨碎，制成單個細胞懸液，1 000 r/min離心10 min(4 ℃)，Hank’s液重懸，1 000 r/min離心10 min(4 ℃)，將細胞懸浮于2 mL RPMI1640培養(yǎng)基，并稀釋到2×107個/mL。

表3 引物序列

增殖檢測：淋巴細胞培養(yǎng)：終濃度為2×107個/mL的脾淋巴細胞，使用96孔細胞培養(yǎng)板，每孔10 μL加2孔，第一孔加入90 μL含有刀豆球蛋白(ConA，SIGMA公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(ConA濃度為20 μg/mL)，第二孔加入90 μL RPMI1640培養(yǎng)基。設(shè)置4個空白對照孔(只加RPMI1640培養(yǎng)基)，于5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)72 h。使用Abcam Brdu Cell Proliferation ELISA Kit試劑盒進行淋巴細胞增殖情況測定。第48～72 h內(nèi)，每孔加入稀釋后的BruU標(biāo)記液10 μL，培養(yǎng)12～24 h。按照BrdU ELISA檢測試劑盒中步驟完成對脾臟淋巴細胞增殖程度測定，在450/540 nm雙波長下測定每孔OD值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)程序，進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較和指標(biāo)的相關(guān)分析；顯著水平為P<0.05，趨勢水平為P<0.10。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

本試驗生產(chǎn)性能結(jié)果表明(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，不同水平魚油對試驗全期蛋雞產(chǎn)蛋率、平均蛋重、產(chǎn)蛋量和平均日采食量無顯著影響(P>0.05)，其中4.34%魚油組(5組)料蛋比顯著高于對照組(P<0.05)。

2.1 飼糧添加魚油對蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

由表4可知，飼糧添加魚油對蛋雞脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著影響(P>0.05)，對蛋雞血清IgA含量也無顯著影響(P>0.05)，其中4.34%魚油組血清IgA含量最高。免疫后不同時間點血清禽流感H9抗體水平檢測結(jié)果(圖1)表明，免疫后7和14 d，試驗組血清禽流感H9抗體S/N%值顯著低于對照組(P<0.05)，表示試驗組血清禽流感H9抗體水平顯著高于對照組(P<0.05)，其中2.17%魚油組抗體水平最高，但不同試驗組間無顯著差異(P>0.05)；免疫后28 d，試驗組血清禽流感H9抗體S/N%值有低于對照組的趨勢(P<0.10)，表示試驗組血清禽流感H9抗體水平有高于對照組的趨勢，其中4.34%魚油組抗體水平最高。隨著免疫后時間延長，各組血清禽流感H9抗體S/N%值均降低，表明血清禽流感H9抗體水平逐漸升高。免疫后不同時間點血清新城疫抗體水平檢測結(jié)果(圖2)表明，免疫后7 d，試驗組血清新城疫抗體水平顯著高于對照組(P<0.05)，其中1.08%魚油組血清新城疫抗體水平最高；免疫后14 d，試驗組血清新城疫抗體水平顯著高于對照組(P<0.05)，但各試驗組間無顯著差異(P>0.05)；免疫后28 d，試驗組血清新城疫抗體水平與對照組無顯著差異(P>0.05)，其中1.08%魚油組血清新城疫抗體水平最高。同時，隨著免疫后時間延長，各組血清新城疫抗體水平均升高。

表4 飼糧添加魚油對蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。圖2同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05). The same as Fig.2.

圖1飼糧添加魚油對蛋雞免疫后不同時間點血清禽流感H9抗體水平的影響

Fig.1 Effects of dietary fish oil on serum avian influenza virus H9 subtype antibody levels of laying hens at different time points after immunization

圖2 飼糧添加魚油對蛋雞

2.2 飼糧添加魚油對蛋雞脾臟細胞因子基因表達的影響

飼糧添加魚油對蛋雞脾臟細胞因子基因表達的影響結(jié)果見圖3。由圖可知，0.54%、1.08%、2.17%魚油組蛋雞脾臟IL-2和IL-6基因相對表達量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，4.34%魚油組蛋雞脾臟IL-2和IL-6基因相對表達量顯著低于對照組和其他試驗組(P<0.05)。與對照組相比，1.08%和2.17%魚油組蛋雞脾臟IL-10基因相對表達量極顯著升高(P<0.01)，0.54%和4.34%魚油組無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，0.54%和2.17%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對表達量顯著升高(P<0.05)，1.08%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對表達量極顯著升高(P<0.01)，4.34%魚油組蛋雞脾臟IFN-γ基因相對表達量顯著降低(P>0.05)。

2.3 飼糧添加魚油對蛋雞脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

飼糧添加魚油對蛋雞脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響結(jié)果見圖4。由圖可知，與對照組相比，1.08%和2.17%魚油組蛋雞脾臟淋巴細胞在ConA刺激下轉(zhuǎn)化率(刺激指數(shù))無顯著差異(P>0.05)，4.34%魚油組顯著降低(P<0.05)。各組間蛋雞脾臟淋巴細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼糧添加魚油對蛋雞免疫器官指數(shù)和體液免疫的影響

本試驗中，飼糧添加不同水平魚油對蛋雞免疫器官指數(shù)無顯著影響，但有研究發(fā)現(xiàn)肉雞飼糧補充3%的魚油(DHA占總脂肪酸的21.9%)對胸腺重量有顯著影響、對脾臟重量無顯著影響[7]，這與本試驗結(jié)果不完全一致，可能是由于魚油中脂肪酸組成有差異或家禽品種、日齡不一致。IgA是外分泌液中主要的免疫球蛋白，分為血清型IgA和分泌型IgA(sIgA)2種，血清型IgA主要由腸系膜淋巴組織的漿細胞產(chǎn)生，具有抗菌、抗病毒作用。膳食魚油在許多動物疾病模型中有顯著的臨床、免疫和生物化學(xué)作用，包括顯著增加人體器官移植存活率并降低患有自身免疫性腎小球腎炎(IgA腎病)的小鼠的蛋白尿，這可能是通過魚油中ω-3 PUFA競爭性抑制環(huán)加氧酶及脂加氧酶對AA的作用，使中性粒細胞和單核細胞產(chǎn)生的白三烯B4(LTB4)減少，取而代之產(chǎn)生非炎癥的PGE3和白三烯B5(LTB5)[8]，從而減少IgA在腎小球系膜處沉積。在機體處于炎性狀態(tài)時，魚油中ω-3 PUFA會減少IgA的產(chǎn)生，緩解炎性疾病。當(dāng)前對健康機體外周血IgA水平的影響的研究也較少。本試驗研究表明，飼糧添加不同水平魚油對蛋雞血清IgA含量無顯著影響，可能是因為蛋雞處于健康生理狀態(tài)，體內(nèi)類二十烷酸分泌未出現(xiàn)異常。關(guān)于魚油對健康禽類血清型IgA水平的影響的相關(guān)研究目前較少，還需進一步研究。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖4同。

* mean significantly different (P<0.05), ** mean extremely significantly different (P<0.01). The same as Fig.4.

圖3飼糧添加魚油對蛋雞脾臟細胞因子基因表達的影響

Fig.3 Effects of dietary fish oil on cytokine gene expression in spleen of laying hens

體液免疫包括外周血免疫球蛋白含量和抗體介導(dǎo)的特異與非特異性免疫。禽流感是一種由A型流感病毒引起的禽類感染疾病綜合征，嚴(yán)重影響禽類養(yǎng)殖。本試驗結(jié)果中，免疫后7和14 d試驗組禽流感H9抗體水平顯著高于對照組且28 d后仍有高于對照組的趨勢。采用血凝抑制反應(yīng)法測定新城疫抗體水平發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3%的魚油，血清新城疫抗體水平顯著高于對照組[7]。He等[9]在家禽飼糧中補充4.5%的魚油，1次免疫后14 d和2次免疫后9 d，正常組和注射環(huán)磷酰胺組的新城疫抗體水平顯著高于玉米油組，說明肉仔雞正常生理狀態(tài)或免疫抑制狀態(tài)下，含ω-3 PUFA的魚油均能提高體液免疫水平，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，這與Guo等[10]的研究結(jié)果一致。也有報道家禽中補充魚油對體液免疫沒有改善作用[11]。不同的試驗結(jié)果可能是由于不同的飲食基礎(chǔ)、脂肪酸水平或抗原類別不同。

圖4 飼糧添加魚油對蛋雞脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

本試驗免疫二聯(lián)苗后蛋雞無不良反應(yīng)，飼糧補充ω-3 PUFA可改善動物體液免疫水平，提高抗體效價。

3.2 飼糧添加魚油對蛋雞脾臟細胞因子基因表達的影響

細胞因子是在炎癥和免疫應(yīng)答過程中由免疫細胞產(chǎn)生的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子多肽或蛋白質(zhì)。細胞因子的產(chǎn)生受類二十烷酸的調(diào)節(jié)[5]，飲食脂肪酸會影響類二十烷酸的產(chǎn)生，所以膳食脂質(zhì)尤其是ω-3 PUFA會影響細胞因子的產(chǎn)生。研究表明DHA可調(diào)節(jié)免疫細胞增殖及自然殺傷細胞的活化，進而影響細胞因子的產(chǎn)生[1]。T細胞可發(fā)展為功能不同的Th1和Th2亞群，IL-2和TNF主要由Th1型細胞分泌，而白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)和IL-10由Th2型細胞分泌[12]。細胞因子中IL-2、IL-6和TNF都是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[13]。Friedman等[14]研究表明，過高或過低ω-3 PUFA會抑制體內(nèi)或體外IL-2的分泌。與對照組(低ω-3 PUFA)相比，膳食補充ω-3 PUFA可降低人外周血單核細胞中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α水平[2]。

有些體外試驗表明，高水平ω-3 PUFA會降低動物細胞因子白細胞介素-1(IL-1)和IL-2基因表達量[15]。本試驗表明，IL-2基因相對表達量隨魚油添加水平升高而下降，可能是由于飼糧中ω-3 PUFA含量的增加，導(dǎo)致LTB4減少，來源于ω-6 PUFA的LTB4能增加血管的滲透性和血液的流動性，調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)TNF-α、IL-2、IL-6和IL-1的產(chǎn)生[13]。同時，因為2、4型Toll樣受體(TLR)及活化分子表達減弱，介導(dǎo)的外周血單核細胞內(nèi)信號蛋白表達下降，導(dǎo)致膳食魚油降低人的IL-2和TNF-α表達[16]。Mayer等[17]研究表明魚油類ω-3 PUFA能明顯抑制單核細胞在受到內(nèi)毒素刺激時對IL-6和IL-8的釋放，盡管表面黏附因子表達無顯著改變，但其對內(nèi)皮細胞的黏附能力跨膜轉(zhuǎn)運受到抑制。本試驗結(jié)果表明IL-6相對表達量也隨著飼糧魚油添加水平升高而降低。ω-3 PUFA抑制NF-κB的激活也是抑制炎性因子產(chǎn)生及降低炎性細胞反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫的重要機制[18]。研究表明人體每天補充1.1～5.0 g的EPA+DHA數(shù)周，可減少外周血單核細胞的增殖，且IL-2、IL-1、IL-6和TNF-α的表達量降低[19]。

IL-10是抗炎類細胞因子，創(chuàng)傷后炎性因子釋放機體立即產(chǎn)生IL-10、白細胞介素-13(IL-13)等抗炎因子對抗原發(fā)促炎反應(yīng)[19]。食用適當(dāng)比例DHA和EPA后2個月后，適當(dāng)ω-3 PUFA可以活化人體白細胞同時促進IFN-γ的分泌[20]。給小鼠飼喂富含魚油的飼糧提高了體內(nèi)IFN-γ含量[21]。Sijben等[22]報道，在飲食中添加魚油(作為ω-3脂肪酸的來源)可以增加細胞因子如IFN-γ的產(chǎn)生。飼糧中補充3%的魚油(DHA占總脂肪酸的21.9%)，能顯著提高脾臟中IFN-γ基因的相對表達量，可能歸因于補充魚油提高了先天免疫細胞活性如Th2細胞并降低類二十烷酸的產(chǎn)生[7]。另外，也有體外試驗表明魚油通過降低PGE2的產(chǎn)生進而促進IFN-γ的分泌[22]。創(chuàng)傷患者在補充魚油后3和6 d外周血IFN-γ水平顯著上升。表明補充ω-3 PUFA可顯著降低創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)程度，促進細胞免疫功能恢復(fù)，避免過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。

高劑量的魚油組降低細胞因子的基因表達，可能是由于免疫細胞膜磷脂中不飽和脂肪酸含量增加，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強，造成膜損傷影響免疫細胞功能。本試驗結(jié)果表明，在正常生理狀態(tài)下，沒有病毒或其他誘生劑的作用，各種細胞因子表達結(jié)果符合正常機體免疫應(yīng)答狀態(tài)，飼糧補充魚油對機體是有利的，能增強先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答能力，同時也取決于免疫應(yīng)答的狀態(tài)。

3.3 飼糧添加魚油對蛋雞脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)和凋亡率的影響

本試驗結(jié)果表明，除4.34%魚油組外，其他各組飼糧補充魚油對脾臟淋巴細胞增殖和凋亡沒有顯著影響。Pompos等[23]研究表明ConA刺激下淋巴細胞體外增殖不受ω-3 PUFA添加影響。Calder等[24]研究表明富含ω-3 PUFA的魚油能降低小鼠對ConA刺激下淋巴細胞的分裂，同時觀察到降低了小鼠淋巴細胞發(fā)育所必需的白細胞介素和TNF產(chǎn)量。飼糧添加7%的魚油抑制淋巴細胞增殖[11]，因為T細胞產(chǎn)生的IL-2可誘導(dǎo)T細胞的分化，過量ω-3 PUFA導(dǎo)致IL-2表達量降低，進而影響T淋巴細胞的增殖[25]。有研究發(fā)現(xiàn)低濃度(50 nmol/L)的AA、DHA、EPA在體外對臍血源單核細胞凋亡無影響，中濃度(100 nmol/L)情況下DHA會顯著增加單核細胞凋亡率[26]。之前有研究表明，當(dāng)補充EPA+DHA在2.4～9.6 g/d時，會降低嗜中性粒細胞和單核細胞的活性，通過減少單核細胞數(shù)量減少IL-6、IL-2和IFN-γ的表達[27]，同時也會減少淋巴細胞的增殖[28]。Kew等[29]在150名健康志愿者中分別提供0.77或1.7 g/d EPA+DHA持續(xù)6個月，發(fā)現(xiàn)攝入不同水平的EPA+DHA并未改變ConA刺激下外周血淋巴細胞的增殖情況，說明適當(dāng)攝入ω-3 PUFA不會對免疫細胞活性產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加魚油未見影響蛋雞免疫器官指數(shù)和血清IgA水平。

② 免疫后7和14 d，魚油組禽流感H9和新城疫抗體水平顯著高于對照組，28 d各組間無顯著差異。

③ 飼糧添加4.34%魚油顯著降低脾臟IL-2和IL-6基因的相對表達量，添加1.08%和2.17%魚油顯著提高脾臟IL-10和IFN-γ基因的相對表達量。

④ 飼糧添加4.34%魚油顯著降低脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)，其余試驗組未見顯著影響脾臟淋巴細胞刺激指數(shù)和凋亡率。