轉(zhuǎn)錄因子KLF4與miR-106a的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移的影響

朱 萌 翟華亮 趙婉瑩張 寧 * 和水祥*

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750004；3. 解放軍第三二三醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710061；4. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061）

RNA是生命活動(dòng)的中心。其中，非編碼RNA分子已被越來(lái)越多的證據(jù)證明其在生命活動(dòng)中起著不可替代的作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類主要的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，僅17~22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通過(guò)識(shí)別1個(gè)或多個(gè)mRNA分子的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)而 在 轉(zhuǎn) 錄 后 水 平 抑 制mRNA翻譯或降解mRNA[1-2]。這一經(jīng)典理論明確了miRNA下游的調(diào)控機(jī)制，集中于miRNA與靶基因的相互作用，對(duì)于miRNA自身如何被調(diào)控的機(jī)制卻鮮見報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-106a靶向TIMP2調(diào)控胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，是腫瘤特異性RNA分子，可能成為預(yù)防和治療進(jìn)展期胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。然而，正如現(xiàn)有大多數(shù)研究報(bào)道一樣，關(guān)于miR-106a的研究多局限于對(duì)其靶基因的鑒定和細(xì)胞表型的檢測(cè)上，而對(duì)其自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍知之甚少。因此，本研究擬從miRNA上游水平入手，構(gòu)建miR-106a啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，篩選并驗(yàn)證能夠與啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)；構(gòu)建KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，探索KLF4在上游轉(zhuǎn)錄水平對(duì)miR-106a成熟體的表達(dá)調(diào)控及對(duì)下游事件胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，以期為深入闡明miR-106a在胃癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、Trizol購(gòu)自TaKaRa公司，T4連接酶、 K pn I、XhoI購(gòu)自Thermo公司，Biospin DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司，Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，胰蛋白棟、酵母粉購(gòu)自O(shè)xiod公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Bestar qPCR RT Kit購(gòu)自DBI?Bioscience公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，DMEM、RPMI-1640購(gòu)自Hyclone公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司。人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞株GES、人胃中分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901及HEK293T購(gòu)自上?？茖W(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 miR-106a啟動(dòng)子野生型和突變型報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)miR-106a啟動(dòng)子和載體pGL3-basic的序列設(shè)計(jì)引物，見表1。200 μL GES細(xì)胞，采用Biospin DNA提取試劑盒提取模板DNA。目的基因PCR擴(kuò)增體系：PrimeSTAR?HS DNA聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR緩沖液5 μL，dNTP Mix 2 μL，F(xiàn)/R引物各0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 15.75 μL ，共25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min。miR-106a啟動(dòng)子PCR 產(chǎn)物回收后與pGL3-basic載體雙酶切，酶切體系：PCR回收產(chǎn)物/載體10 μL，Kpn I 1.5 μL， X ho I 1.5 μL，10× 緩 沖液5 μL，ddH2O 32 μL ，共50 μL，37 ℃水浴2 h。使用T4 DNA 連接酶連接目的片段與載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D H5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落，接種于裝有800 μL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)基中，取1 μL菌液為模板，行菌落PCR鑒定，PCR體系：rTaq 0.5 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，F(xiàn)/R 引 物各0.4 μL，ddH2O 8.1 μL，共20 μL。選取陽(yáng)性克隆的菌液按1∶100的比例接種至5 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)LB培養(yǎng)基中，洗脫質(zhì)粒。重組質(zhì)粒酶切鑒定：質(zhì)粒3 μL， K pn I 0.4 μL，XhoI 0.4 μL，10× 緩 沖液1 μL，ddH2O 5.2 μL ，共10 μL，37℃、2 h。酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、送測(cè)序。

表1 miR-106a 啟動(dòng)子野生型和突變型引物序列

1.2.2 KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) K LF4基因和載體pcDNA3.0的序列設(shè)計(jì)引物。KLF4-F：GGGGTACCA TGAGGCAGCCACCTGGC；KLF4-R：CCGCTCGAGTT AAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGG。Trizol 法提取GES細(xì)胞 模 板RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系：5×RT 緩 沖液4 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，Primer Mix 1 μL，RNase Free ddH2O 4 μL，RNA 1 μg 10 μL ，共20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃、60 min，98 ℃ 、 10 min。PCR擴(kuò)增體系：PrimeSTAR?HS DNA聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR 緩沖液5 μL，dNTP Mix 2 μL，F(xiàn)/R引物各0.5 μL，模板 1 μL，ddH2O 15.75 μL ，共25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、5 min，94℃、30 s，62 ℃、30 s，72 ℃、 2 min，72 ℃、5 min。后續(xù)步驟同上。

1.2.3 雙熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證miR-106a轉(zhuǎn)錄因子KLF4 HEK293T細(xì)胞以8×105/mL接種于24孔培養(yǎng)板，分4組：pmiR-106a-WT+KLF4+-pcDNA3.0，pmiR-106a-WT+KLF4--pcDNA3.0，pmiR-106a-MUT+KLF4+-pcDNA3.0，pmiR-106a-MUT+KLF4--pcDNA3.0。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒/miR-106a啟動(dòng)子質(zhì)粒濃度0.8 μg，轉(zhuǎn)染后48 h測(cè)定熒光值。每孔細(xì)胞加入100 μL Passive裂解液，室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液，GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取背景值2 s，每樣品加入100 μL LAR Ⅱ工作液，讀值2 s，再加入100 μL Stop&Glo?Reagent，讀值2 s，計(jì)算相對(duì)熒光活性值。

1.2.4 qPCR檢測(cè)胃癌組織中miR-106a、KLF4 mRNA表達(dá)水平 收集2017年1月—2017年11月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院行胃癌根治術(shù)切除的胃組織標(biāo)本，癌灶和對(duì)應(yīng)癌旁組織(距癌灶中心≥5 cm)各30例。所有患者術(shù)前均已經(jīng)胃鏡活檢確診為胃腺癌，并通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。使用Trizol法提取RNA，RNA質(zhì)量管控采用美國(guó)Bioteck公司Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)核酸純度， D ( 2 60)/D(280)比值在1.8~2.0認(rèn)為符合要求。KLF4-F：CGTTGAACTCCTC GGTCTC；KLF4-R：GACGCCTTCAGCACGAACT。miR-106a逆轉(zhuǎn)錄引物：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGCTACCTGC；miR-106a-F：ACACTCC AGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA。統(tǒng)一的反向引物CTCAACTGGTGTCGTGGA。內(nèi)參分別為GAPDH、U6。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、15 min；98 ℃、5 min。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，94 ℃、20 s，58 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)。熔融解曲線分析：94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，94 ℃、30 s。重復(fù)3次。以2-??CT計(jì)算基因相 對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞遷移能力 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901按2×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，分4組：miR-106a mimic，mimic NC，miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0，miR-106a mimic+pcDNA3.0 vector。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，收集細(xì)胞，安裝小室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后固定染色，顯微鏡下選取10個(gè)互不重疊高倍視野計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.-0統(tǒng) 計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)描述采用x± s 表 示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)(t-test)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用方差分析(One-Way AVONA)，變量之間關(guān)系的比較采用直條圖表示，采用箱式圖表示變量原始數(shù)據(jù)的分布特征，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-106a上游啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子

使用美國(guó)加州大學(xué)圣克魯茲分校生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(University of California Santa Cruz，UCSC genome browser)檢索hsa-miR-106a啟動(dòng)子序列，獲得miR-106a上游啟動(dòng)子區(qū)域2 000 bp序列。miR-106a啟動(dòng)子序列和突變位點(diǎn)見圖1。使用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR，選擇脊椎動(dòng)物JASPAR CORE Vertebrata，篩選調(diào)控miR-106a的轉(zhuǎn)錄因子，考慮結(jié)合位點(diǎn)與起始位點(diǎn)近、理論值達(dá)90%、CDS區(qū)片段長(zhǎng)度等因素確定KLF4作為miR-106a轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)象，并獲得轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的位點(diǎn)。

圖1 miR-106a 上 游 2 0 00 b p 啟 動(dòng)子序列(http: //genome.ucsc.edu/)

2.2 miR-106a啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒的鑒定

如圖2所示，miR-106a啟動(dòng)子重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示目的基因條帶位于100~250 bp之間，理論值191 bp，符合預(yù)期片段大小，初步證明miR-106a啟動(dòng)子擴(kuò)增成功。雙酶切電泳圖顯示pmiR-106a-WT位于200 bp左右，pGL3 basic位于加樣孔處(4 000 bp左右，原本4 818 bp)，提示miR-106a啟動(dòng)子野生型重組質(zhì)粒構(gòu)建符合預(yù)期。miR-106a啟動(dòng)子定點(diǎn)突變重組質(zhì)粒送測(cè)序后顯示已成功在目的突變位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)突變。

2.3 KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

圖2 miR-106a啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒的鑒定

如圖3所示，KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖顯示電泳條帶位于1 000~2 000 bp之間，理論值1 440 bp，提示 K LF4基因擴(kuò)增順利，雙酶切電泳圖顯示KLF4基因酶切產(chǎn)物1 500 bp左右，大片段pcDNA3.0位于加樣孔下方，原本 5 427 bp，提示KLF4重組質(zhì)粒構(gòu)建符合預(yù)期。

2.4 miR-106a轉(zhuǎn)錄因子KLF4的鑒定

雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，pmiR-106a-WT+KLF4+-pcDNA3.0和pmiR-106a-WT+KLF4--pcDNA3.0，在應(yīng)用KLF4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒處理后，miR-106a野生型報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性下降，t檢驗(yàn)得出，與空載體相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-24.378，P=0.000)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)的KLF4對(duì)報(bào)告載體上miR-106a啟動(dòng)子下游的螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)有抑制作用。pmiR-106a-MUT+KLF4+-pcDNA3.0和pmiR-106a-MUT+ KLF4--pcDNA3.0，KLF4過(guò)表達(dá)處理后，miR-106a啟 動(dòng)子突變型報(bào)告基因活性下降不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= - 0.647，P =0.553)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)KLF4對(duì)miR-106a突變型報(bào)告基因的熒光素酶活性無(wú)明顯影響。

2.5 KLF4 mRNA和miR-106a在人胃癌組織中的表達(dá)水平

qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，KLF4 mRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.716±0.624，配對(duì)t檢驗(yàn)得出，二者 差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 4.228， P=0.000)，說(shuō)明KLF4 mRNA在胃癌組織中呈低水平表達(dá)。miR-106a的相對(duì)表達(dá)量為3.367±2.165，t檢驗(yàn)得出兩者 差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義(t= -6.259， P=0.000)，說(shuō)明miR-106a在胃癌組織中高表達(dá)。提示miR-106a與轉(zhuǎn)錄因子KLF4在人胃癌中可能具有負(fù)調(diào)控關(guān)系。

2.6 miR-106a的表達(dá)調(diào)控對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

人胃癌SGC-7901細(xì)胞行transwell小室實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，miR-106a mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)量為100.50± 53.56， mimic NC組 為 49.90± 12.53， miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0組為67.30±18.26，miR-106a mimic+pcDNA3.0 vector組為99.50±37.28。方差分析得出 F= 5.239， P=0.004，說(shuō)明不同處理的 4組細(xì)胞遷移能力不全相同。與mimic NC組相比，miR-106a mimic組細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P=0.002)；但當(dāng)合并KLF4處理后，miR-106a mimic+KLF4-pcDNA3.0 組細(xì)胞數(shù)量減少，與miR-106a mimic組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)，而KLF4空載體對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化(P=0.949)。提示miR-106a mimic對(duì)胃癌細(xì)胞遷移有促進(jìn)作用，但該促進(jìn)作用可被 KLF4部分阻遏。

3 討 論

miRNA的表達(dá)失控與多種人類疾病尤其是惡性腫瘤密切相關(guān)[4]。miR-106a是由約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的前體miR-106a~363經(jīng)Dicer酶剪切形成約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的產(chǎn)物，構(gòu)成miR-17家族成員之一，該家族成員在大多數(shù)的惡性腫瘤中被認(rèn)為具有癌基因樣的作用[5]。本文研究miR-106a的自身表達(dá)調(diào)控機(jī)制。之前有學(xué)者報(bào)道通過(guò)構(gòu)建pre-miR-122啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝星狀細(xì)胞HSCs，以熒光素酶活性值可以初步判斷miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制[6]。本研究選擇轉(zhuǎn)錄因子KLF4與miR-106a啟動(dòng)子的相關(guān)關(guān)系開展研究，探討miR-106a的表達(dá)調(diào)控對(duì)人胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

通常，啟動(dòng)子區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)附近，主要是在TSS上游1 kb的范圍內(nèi)。已知，miRNA的轉(zhuǎn)錄主要是由Ⅱ類RNA聚合酶(RNA-pol)介導(dǎo)[7]。RNA-polⅠ和Ⅱ多位于TSS上游，RNA-polⅢ位于TSS下游[8]。本研究于miR-106a上游2 000 bp序列預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域，序列分析發(fā)現(xiàn)，其廣泛富含TATA盒 (TATA box)、 CAAT盒 (CAAT box)和 GC(GC box)等真核生物基因上游順式作用元件，據(jù)此推測(cè)miR-106a轉(zhuǎn)錄可能由RNA-polⅠ或RNA-polⅡ介導(dǎo)。根據(jù)真核生物的轉(zhuǎn)錄起始是由能直接或間接辨認(rèn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段的反式作用因子啟動(dòng)、控制基因轉(zhuǎn)錄。而反式作用因子中，轉(zhuǎn)錄因子是與RNA聚合酶直接或間接結(jié)合的。故針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子，篩選在胃癌中異常表達(dá)并能夠與miR-106a啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子KLF4作為研究對(duì)象，使用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)考察KLF4對(duì)miR-106a啟動(dòng)子的調(diào)控。結(jié)果顯示KLF4的過(guò)表達(dá)載體對(duì)miR-106a啟動(dòng)子的野生型報(bào)告基因的熒光素酶活性具有明顯的抑制作用，但對(duì)突變型質(zhì)粒的作用不明顯，提示miR-106a啟動(dòng)子區(qū)含有可能與轉(zhuǎn)錄因子KLF4結(jié)合的位點(diǎn)。KLF4是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，隸屬于轉(zhuǎn)錄因子家族[9-10]。很多研究認(rèn)為KLF4在多種類型實(shí)體腫瘤中是作為一種抑癌基因的角色而存在。KLF4的敲低具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和黏附的作用[11]，激活KLF4則減少轉(zhuǎn)移灶周遭環(huán)境的形成悖于轉(zhuǎn)移，且是一種KLF依賴性的過(guò)程[12]。有研究報(bào)道KLF4可與miR-544的啟動(dòng)子序列互補(bǔ)結(jié)合調(diào)節(jié)miR-544在宮頸癌中的表達(dá)[13]。但KLF4與miR-106a在胃癌中的調(diào)控關(guān)系尚未見報(bào)道。我們此次在人胃癌組織中對(duì)比研究KLF4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)KLF4在胃癌組織中低表達(dá)，結(jié)合miR-106a在胃癌組織中高表達(dá)，提示在胃癌中，KLF4表達(dá)降低，KLF4結(jié)合于miR-106a啟動(dòng)子區(qū)域，低表達(dá)的KLF4對(duì)miR-106a的抑制作用弱，miR-106a表達(dá)升高；當(dāng)應(yīng)用KLF4過(guò)表達(dá)載體使其表達(dá)升高后，KLF4發(fā)揮抑癌基因樣作用，在轉(zhuǎn)錄水平減少miR-106a野生型報(bào)告基因的熒光素酶活性，使miR-106a成熟體表達(dá)減少；再結(jié)合我們前期的研究結(jié)果，高表達(dá)的miR-106a在胃癌細(xì)胞中因具有顯著地促使癌細(xì)胞獲得更高水平的遷移能力的作用，使其在一定程度上體現(xiàn)促癌基因樣的表型特征，此次KLF4在上游水平對(duì)其啟動(dòng)子的結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，致使在表觀現(xiàn)象上我們看到miR-106a對(duì)胃癌細(xì)胞的促癌基因樣作用得以削弱[3]，細(xì)胞的遷移能力下降，部分阻遏或一定程度逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的侵襲性。

總之，本研究一定程度上揭示了轉(zhuǎn)錄因子KLF4與miR-106a啟動(dòng)子的結(jié)合和調(diào)控關(guān)系，KLF4和miR-106a結(jié)合于上游轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移事件中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這將為進(jìn)一步研究miRNA表達(dá)調(diào)控機(jī)制打開新窗口。