啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)SD大鼠的胚胎毒性和致畸毒性

趙康濤，王清洪，林 健

（1.福建省疾病預(yù)防控制中心/福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350001）

啤酒在正常冷凍溫度下保藏時(shí)易形成一種不溶性膠質(zhì)蛋白質(zhì)——丹寧絡(luò)合物，這種影響產(chǎn)品感官質(zhì)量的混濁現(xiàn)象叫做“冷混濁”。納米SiO2吸附劑是由無(wú)定形SiO2和高分子材料組成的一種新型多功能啤酒防冷混濁劑，它具有多孔結(jié)構(gòu)，且內(nèi)部表面積大。其孔徑尺寸具有選擇性去除啤酒中造成混濁的蛋白質(zhì)的吸附能力[1]，又可選擇性去除啤酒中聚合多酚，而保留其他有益蛋白質(zhì)成分如相對(duì)分子質(zhì)量較大的泡沫穩(wěn)定性蛋白，可保持啤酒風(fēng)味不變[2]?；谏鲜隼碛桑【茝S家廣泛采用納米SiO2作為穩(wěn)定劑。目前世界上已有50%左右的啤酒采用SiO2法處理，并有增長(zhǎng)趨勢(shì)。

納米SiO2的毒理學(xué)研究熱點(diǎn)之一是肺毒理研究，納米SiO2對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺部毒性顯示納米SiO2較微米SiO2可能有更強(qiáng)的致脂質(zhì)過(guò)氧化、損害抗氧化系統(tǒng)傾向，能引起更嚴(yán)重的肺部急性損傷[3]。但有關(guān)納米SiO2生殖毒性及胚胎毒性、遺傳損傷等卻鮮見(jiàn)報(bào)道。為了解啤酒抗冷混濁硅基吸附劑(以下簡(jiǎn)稱硅基吸附劑)的胚胎毒性及致畸毒性，我們利用雌性SD受孕大鼠進(jìn)行了研究，為合理利用該硅基吸附劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

啤酒抗冷混濁硅基吸附劑為硅基產(chǎn)品，白色粉末，SiO2含量68%，由美國(guó)PQ公司惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器和試劑

解剖顯微鏡(星火TX800139，河南星火儀器廠)，電子天平(JJ500，常熟雙杰儀器廠)，不銹鋼電子數(shù)顯卡尺(廣陸111-102B，桂林廣陸數(shù)字測(cè)控有限公司)。茜素紅、氫氧化鉀、丙三醇(甘油)、冰醋酸、2,4,6-三硝基酚(苦味酸飽和液)、甲醛溶液均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)，13周齡(90~100 d)SD大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。雌性未交配過(guò)的大鼠80只，雄鼠40只。購(gòu)入后置于SPF級(jí)大鼠實(shí)驗(yàn)室[許可證號(hào)SYXK(閩) 2007-0006]觀察3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量組，分別為啤酒抗冷混濁硅基吸附劑低(0.83 g/kg)、中(1.63 g/kg)、高(3.33 g/kg)劑量的水混懸液(高劑量濃度以能灌胃的最高濃度為準(zhǔn)，其余劑量依次減半)，以及陰性對(duì)照組(蒸餾水)，共4組。

1.4 試驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)[3]，將性成熟雌、雄大鼠按1∶1同籠后，次日早晨觀察陰栓，陽(yáng)性表示受孕成功，當(dāng)天即定為孕期0 d。如果5 d內(nèi)未受孕成功，則更換雄鼠，直至每組達(dá)到20只孕鼠，交配結(jié)束。檢出的孕鼠稱體質(zhì)量并編號(hào)，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組。在孕期的第7~16 d，每天經(jīng)口灌胃1次給予受試物(灌胃容積為10 mL/kg)。孕鼠于孕期第0、7、12、16和20天稱取體質(zhì)量[3]。

1.5 胚胎檢查

大鼠妊娠第20天脫頸椎處死，剖腹取出子宮稱質(zhì)量，記錄并檢查吸收胎、死胎及活胎數(shù)[1]。并逐一記錄胎仔的體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)，檢查胎鼠外觀有無(wú)異常。

將每窩1/2的活胎鼠(編號(hào)為偶數(shù))去皮、去內(nèi)臟及脂肪后，放入茜素紅溶液染色，當(dāng)天輕搖2~3次，待骨骼染成紅色時(shí)為止。將胎鼠換入透明液A中1~2 d，放入透明液B中2~3 d。待骨骼染紅而軟組織基本褪色，將標(biāo)本放入小平皿中，檢查骨骼數(shù)目畸形等。每窩的1/2活胎鼠(編號(hào)為奇數(shù))放入Bouin’s液中，固定兩周后觀察胎鼠臟器的大小、形狀和相對(duì)位置。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 孕鼠一般情況

孕鼠的生理體征、外觀、行為、大小便、皮毛等均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

2.2 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)孕鼠體質(zhì)量的影響

與陰性對(duì)照組比較，啤酒抗冷混濁硅基吸附劑各劑量組孕鼠在不同時(shí)期的體質(zhì)量及妊娠期體質(zhì)量增量均未見(jiàn)明顯改變(P均>0.05)，見(jiàn)表1。各劑量組孕鼠的子宮連胎質(zhì)量及卵巢質(zhì)量與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)孕鼠給藥后不同時(shí)間體質(zhì)量的影響( -x ±s，g)

2.3 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胚胎形成的影響

啤酒抗冷混濁硅基吸附劑各劑量組孕鼠的著床數(shù)和活胎數(shù)與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；死胎率和吸收胎率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，亦未見(jiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)表2)。

表2 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胚胎形成的影響

2.4 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胎仔生長(zhǎng)發(fā)育的影響

啤酒抗冷混濁硅基吸附劑各劑量組胎仔平均體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等發(fā)育指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，各劑量組也未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胎仔生長(zhǎng)發(fā)育的影響(±s，g)

表3 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胎仔生長(zhǎng)發(fā)育的影響(±s，g)

2.5 啤酒抗冷混濁硅基吸附劑對(duì)胎鼠外觀形態(tài)、內(nèi)臟、骨骼的影響

啤酒抗冷混濁硅基吸附劑各劑量組胎鼠外觀畸形率、內(nèi)臟畸形率、骨骼畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，對(duì)照組1例內(nèi)臟畸形為消化道發(fā)育不全，可能屬偶發(fā)病例；所有骨骼畸形均為2、5胸骨缺失，認(rèn)為屬正常發(fā)育階段，無(wú)生物學(xué)意義(見(jiàn)表4)。

3 討 論

本試驗(yàn)主要研究經(jīng)口給予納米SiO2吸附劑后對(duì)SD雌性大鼠的致畸作用。過(guò)往研究主要著眼于SiO2顆粒的大小，即經(jīng)鼻給予樣品后，微米級(jí)的SiO2可引起肺組織損傷，肺部炎癥、纖維化、DNA損傷甚至肺癌[4]，而納米SiO則可以穿透血腦屏障、血眼屏障、血睪屏障甚至進(jìn)入細(xì)胞核中，從而危害生物體的安全[5]。體外實(shí)驗(yàn)也表明納米SiO所引起的細(xì)胞毒性，效應(yīng)比微米SiO嚴(yán)重[6]。基于上述原因，納米SiO對(duì)大鼠生殖毒性的研究相關(guān)報(bào)道中，其染毒方式也多是鼻腔滴注法[7]，納米SiO可致雄性大鼠睪丸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，并影響精子數(shù)量、活力致生精障礙[8]。經(jīng)口灌胃給予納米SiO2染毒后，是否具有同樣的生殖毒性效應(yīng)，對(duì)大鼠胎仔是否有致畸作用，卻鮮有相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)經(jīng)口給予SD大鼠納米級(jí)SiO2吸附劑，檢測(cè)其致畸毒性。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，0.83、1.67、3.33 g/kg硅基吸附劑染毒組胎鼠窩平均活胎數(shù)、活胎率、吸收胎數(shù)、吸收胎率、死胎數(shù)及死胎率與陰性對(duì)照組比較均未見(jiàn)明顯差異；胎鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等各項(xiàng)發(fā)育指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較也未見(jiàn)明顯異常(P>0.05)。此前有報(bào)道納米SiO2粉體對(duì)妊娠小鼠呼吸道染毒，發(fā)現(xiàn)各染塵組的母鼠體質(zhì)量、胚胎數(shù)、活胎數(shù)、活胎平均體質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組；而死胎率和吸收胎率較對(duì)照組均顯著增高。妊娠期間母鼠體質(zhì)量變化值與活胎體質(zhì)量之間存在顯著的相關(guān)性[9]。而本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與之前報(bào)道并不相符，我們推測(cè)與染毒方式不同致其吸收代謝差異有關(guān)。上海大學(xué)楊怡新[10]用納米SiO2食品添加劑對(duì)體外胃腸道細(xì)胞毒性的研究發(fā)現(xiàn)，納米SiO2不造成細(xì)胞膜損傷、形態(tài)改變、細(xì)胞凋亡與壞死，只會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，且存在劑量和時(shí)間效應(yīng)。對(duì)納米SiO2在Caco-2細(xì)胞單層膜的跨膜情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)納米SiO2穿膜率很低，據(jù)此推測(cè)納米SiO2很難穿越小腸膜[10]。本試驗(yàn)樣品經(jīng)胃腸道給藥而未見(jiàn)致畸毒性，與之前致畸相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不符，是否為納米SiO2穿膜率低而不易經(jīng)腸道吸收所致，有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中胎鼠的外觀、內(nèi)臟未見(jiàn)畸形，骨骼畸形均為2、5胸骨發(fā)育不全，其畸形胎鼠數(shù)量也未超出正常范圍。因此我們認(rèn)為，本試驗(yàn)在3.33 g/kg劑量以下，該硅基吸附劑產(chǎn)品對(duì)SD大鼠胎仔無(wú)致畸作用。其機(jī)制是否與前述研究中胃腸道對(duì)納米SiO2的屏蔽作用有關(guān)，有待我們進(jìn)一步研究。而試驗(yàn)中，我們可見(jiàn)孕鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)及妊娠期第0、7、12、16和20天體質(zhì)量與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但3.33 g/kg組孕鼠體質(zhì)量在 第 1 6和20天 的體質(zhì)量卻略低于對(duì)照組，且體質(zhì)量增量絕對(duì)數(shù)值也略低于對(duì)照組，是否因該劑量組樣品抑制動(dòng)物胃腸道細(xì)胞增殖從而影響飼料攝入有關(guān)，也有待我們進(jìn)一步試驗(yàn)考證。

納米SiO2是我國(guó)目前產(chǎn)量最大的納米材料之一，因具有優(yōu)越的穩(wěn)定性、易散性和融變性等特點(diǎn)， 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于塑料工程、生物醫(yī)學(xué)工程、殺菌劑、食品加工等多個(gè)領(lǐng)域。這就意味著納米SiO2的研究者、生產(chǎn)者、消費(fèi)者乃至消費(fèi)品處理者以及其進(jìn)入環(huán)境后涉及的整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)接觸它的機(jī)會(huì)大大增加。因此，對(duì)其相關(guān)產(chǎn)品的安全評(píng)估必將引起越來(lái)越多的重視。