宮內暴露氟他胺對子鼠子宮和卵巢發(fā)育及氧化應激的影響

周小青，文可欣，尹洪萍，楊謹如，朱勇飛，*

（1. 湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410013；2. 杭州師范大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310018)）

氟他胺(flutamide)是一種有效的選擇性非甾體雄激素受體競爭性拮抗劑，臨床中常用于前列腺癌的治療[1]。近年來，國內外學者常利用孕期暴露氟他胺誘導雄性子代大鼠尿道下裂作為研究模型[2]；有研究發(fā)現宮內暴露氟他胺不僅可致雄性子代發(fā)育異常，也可致雌性子代動物卵巢發(fā)育受損[3]，但氟他胺是否也可作為誘導雌性子代子宮發(fā)育異常的模型尚未見研究報道。氧化應激(oxidative stress，OS)影響雌性、雄性配子以及胚胎的發(fā)育能力，其作用可以持續(xù)到孕后期[4]。已知氟他胺可以在體外誘導大鼠肝細胞發(fā)生OS反應，導致肝細胞受到損傷[5]，但尚未發(fā)現氟他胺是否也影響子宮、卵巢OS能力及相關基因的表達。本文擬對孕期暴露氟他胺所致雌性子鼠子宮和卵巢的發(fā)育異常及病理特征進行觀察，同時檢測OS反應相關酶、代謝物以及基因的表達。目的是進一步確認氟他胺對雌性子代生殖器官發(fā)育的影響，同時為進一步研究其損傷機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑有：氟他胺(Sigma公司)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(Thermo Scientific公司)。

主要儀器有：全自動樣品快速研磨機(上海凈信科技)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific公司)，Veriti型RTPCR儀(Thermo Scientific公司)，7500型實時熒光定量PCR儀 (ABI公 司 )， MULTISKAN FC全 自 動 酶 標 儀(Thermo Scientific公司)。

1.2 動物分組及染毒方法

取SPF級8周齡ICR雌鼠50只、雄鼠15只[湖南施萊克景達公司，許可證號SCXK(湘)2013-0004]，于室溫20~25℃、相對濕度40%~60%、循環(huán)光照為12/12 h 的飼養(yǎng)間中適應性飼養(yǎng)1周后，小鼠按雌雄比例2∶1 配對合籠，觀察到陰栓之日記為孕期(gestational day，GD)第0天(GD0)[6]。將40只自然受孕小鼠隨機分為實驗組與對照組，每組20只，根據文獻[7]和本實驗室既往研究數據[8]，在GD12~GD18連續(xù)7 d進行300 mg/ (kg·d)氟他胺灌胃，對照組給予等體積的大豆油灌胃。

1.3 樣品收集與測量

于子鼠出生7周后觀察外形，頸椎脫臼處死，隨機選取40只子代雌鼠(每窩隨機選取1只)，稱體質量，處死后立即取子宮、卵巢組織，去除周圍的脂肪、結締組織，用生理鹽水洗凈表面血污后用濾紙吸干，稱體質量并計算臟器系數，小鼠臟器指數計算公式：臟器指數=臟器質量/體 質量，即每克體質量相對應的臟器質量[8]。每組隨機取12只雌鼠按說明書檢測其子宮、卵巢中的MDA、SOD、GSH-Px；另外，兩組中各隨機取12只雌鼠的子宮和卵巢保存于-80 ℃冰箱。最后每組隨機選擇部分子鼠的子宮、卵巢組織置于10%甲醛溶液中固定。

1.4 組織病理檢測

取甲醛溶液中固定的子宮和卵巢組織，按常規(guī)方法經組織脫水處理后用石蠟包埋，制作石蠟標本，5 μm連續(xù)切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色法進行常規(guī)染色處理，在光學顯微鏡下觀察組織病變情況。

1.5 小鼠卵泡計數

對實驗組和對照組切片中的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡進行計數，各級卵泡以光學顯微鏡下看到卵母細胞核為計數的標準[9]。陰道脫落細胞學檢查法確定7周齡小鼠動情周期，每組獲得2只動情期子鼠，取其卵巢組織行5 μm連續(xù)切片，每隔3張切片取1片組織進行觀察，每組共選5張，每張切片隨機選擇5個視野，則每組小鼠卵巢各級卵泡數目為25個視野內各級卵泡數目總和[10]。

1.6 蛋白濃度測定及OS指標測定

分別剪碎子宮和卵巢組織，加入蛋白裂解液，用全自動樣品快速研磨機研磨組織，在低溫冷凍離心機中以4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清液，根據試劑盒說明書，用BCA法測定總蛋白濃度，配制檢測液后使用酶標儀測定各組織中MDA、SOD、GSH-Px吸光度數值，根據試劑盒說明按照蛋白濃度及標準曲線計算各指標的具體數值。

1.7 總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測基因表達

將保存于-80 ℃ 冰箱中的樣品用Trizol裂解，按試劑盒說明書提取總RNA，溶于無核酸酶水中，取約1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，反應體系和反應條件均參照試劑盒說明書。將所得cDNA進行PCR擴增，反應體系(10 μL)如下：SYBER緩沖液2.5 μL、cDNA1 μL、上下游引物各0.3 μL、DEPC水5.9 μL。反應條件為：95℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，循環(huán)40次。引物序列見表1。

通過各目標基因PCR擴增曲線的 CT值 與所設內參基因 β-actin的 CT值 相比較來進行定量分析。實驗組和對照組分別減去對應的內參基因 CT值 ，得到Δ CT， 對照 組差異倍數為實驗組2-??CT值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 孕期氟他胺暴露致雌性子鼠體質量、子宮和卵巢質量的改變

實驗組與對照組雌性子鼠數量分別為101和97只，兩組外觀無明顯差異。與對照組相比，實驗組雌性子鼠體質量、卵巢質量、子宮質量較對照組低(P <0.05)，但子宮臟器系數與卵巢臟器系數與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義( P >0.05)。見表2。

與對照組比較，*<0.05.P

2.2 子宮和卵巢病理學改變

結果發(fā)現實驗組所有子代雌鼠的子宮和卵巢均出現了組織病理學改變。如圖1所示，對照組子宮內腔淺皺襞狀，固有層淺層富含淋巴樣細胞，肌層內環(huán)外縱，其間血管層間質緊密(圖1A、1C)；實驗組子宮內腔皺襞形成不明顯，固有層淋巴樣間質細胞密度偏低，分布欠均勻，肌層平滑肌排列內環(huán)外縱，其間血管層間質疏松，境界分明(圖1B、1D)。觀察卵巢皮質及部分髓質結構發(fā)現，對照組卵巢皮質部可見多個不同發(fā)育階段的卵泡，早期為主，可見有次級或趨于成熟卵泡形成(圖1E)；實驗組卵巢皮質部可見較多處于早期發(fā)育階段的卵泡，未見成熟卵泡形成(圖1F)。

2.3 卵泡數量變化

對兩組子鼠卵巢按各級卵泡進行計數(表 3)，實驗組原始卵泡數量和成熟卵泡數量較對照組減少(P均<0.05)，而初級卵泡數量和次級卵泡數量與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 小鼠卵泡計數

2.4 子宮和卵巢氧化應激反應相關生化指標的改變

氧化應激反應相關生化指標測定結果見表 4。實驗組子宮內SOD活性較對照組降低、GSH-Px含量下降而MDA水平上升(P均<0.05)；實驗組卵巢內SOD活性較對照組降低(P<0.05)、GSH-Px含量下降(P<0.05)，而MDA水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 雌性子鼠子宮和卵巢形態(tài)學的比較

表4 孕期氟他胺暴露致雌性子鼠生殖器官氧化應激相關指標的改變(n =12)

2.5 子代雌鼠氧化應激相關基因mRNA表達水平的改變

如表5所示，子宮內Noxo1 mRNA表達水平較對照組升高(P<0.05)，Sod1表達水平較對照組降低(P<0.05)，而Gpx1表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組卵巢內Noxo1 mRNA表達水平較對照組升高(P<0.05)，Gpx1表達水平較對照組降低(P<0.05)，Sod1表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 實 驗組與對照組小鼠 氧 化應激相 關基因 m RNA的 相對表達水平(n =12)

3 討 論

生殖和發(fā)育功能障礙是當前嚴重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。因此，環(huán)境因素，特別是環(huán)境內分泌干擾物對生殖發(fā)育的影響及其機制，一直是近年來的研究熱點。揭示致畸機制首先需要一個良好的研究模型，但一直缺乏雌性生殖器官發(fā)育異常模型，這給機制研究造成了困難。近年來，有學者研究發(fā)現宮內暴露氟他胺不僅可致雄性子代尿道下裂等發(fā)育異常，也可致雌性動物性腺等發(fā)育受影響[3]。但該研究受試動物為豬[3，11]。我們在研究氟他胺對小鼠雄性子代生殖器官發(fā)育異常時，發(fā)現雌性子代生殖器官發(fā)育也有異常[8]。對氟他胺是否也可誘導作為雌性子代生殖器官發(fā)育異常模型尚未見研究報道。為了進一步驗證，本實驗觀察了300 mg/(kg·d)劑量氟他胺灌胃孕鼠對雌性子代生殖器官發(fā)育的影響。本實驗發(fā)現氟他胺暴露組雌性子鼠體質量降低，但子宮、卵巢臟器系數與對照組相比 差 異無統(tǒng)計學意義。組織病理學檢查發(fā)現子宮和卵巢發(fā)育遲緩，原始卵泡和成熟卵泡數量均少于對照組，表明在宮內暴露氟他胺條件下，可影響雌性子鼠子宮和卵巢的發(fā)育。組織病理學檢查還顯示，實驗組子宮內腔皺襞形成不明顯，推測可能是由于氟他胺阻斷雄激素的作用，抑制蛻膜化應答[12]，使宮腔內皺襞形成不明顯。實驗組卵巢中原始卵泡和成熟卵泡數量均較對照組少，提示氟他胺對雌鼠卵巢儲備功能以及卵泡發(fā)育有抑制作用，但尚需更深入的實驗研究來證實。

氟他胺為非類固醇雄激素拮抗劑，在靶組織內與雄激素競爭同一受體，阻斷雙氫睪酮與雄激素受體結合，抑制靶組織攝取睪酮，從而起到抗雄激素的作用[13]。在雌性，睪酮除了作為合成雌激素的前體，在出生前還支持卵巢卵泡的發(fā)育[2]。因此，如果宮內發(fā)育期間影響了睪酮水平以及與靶器官受體的結合，可能通過影響雌激素的合成和卵泡的發(fā)育。

氧化應激(OS)是很多化學物導致發(fā)育毒性的重要機理之一，已知氟他胺可以在體外誘導大鼠肝細胞發(fā)生OS反應，導致肝細胞受到損傷[5]。氟他胺所致子鼠發(fā)育異常，除藥理作用的延伸外，是否還可由于氧化應激引起，或兩種共同作用所致值得研究。本實驗發(fā)現氟他胺暴露組雌性子鼠子宮和卵巢中部分與氧化應激反應相關的生化指標(GSH-Px、SOD、MDA)及基因(S od1 、 N oxo1 、 G px1 )的表達發(fā)生改變。 N oxo1基因能調控 N ox1 基因[14]及 N ox3 基因[15]的表達，在細胞中產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[16]。本研究實驗組子宮組織中Noxo1 mRNA的表達水平升高，提示細胞內ROS含量的增加；GSH-Px活性降低，說明子宮組織內對過氧化物的分解能力可能下降；SOD的活性與Sod1表達水平較對照組降低，則反映子宮組織內催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用的反應減弱[17]；而脂質過氧化的代謝物MDA含量升高，與其他作者發(fā)現的氟他胺致大鼠肝細胞毒性的研究結果一致[5，18]。

在正常狀態(tài)下，卵泡內也會產生一定量的ROS，這些ROS有一定的生理功能，在卵泡發(fā)育、破裂排卵過程中發(fā)揮重要作用[19]。適量的自由基也不會對機體造成有害影響，但是在暴露于某些內源性因素(感染、高血壓、糖尿病等)和外源性因素(環(huán)境污染、重金屬、藥物、輻射等)時，產生過量的自由基會引起細胞內生物大分子氧化損傷，引起細胞凋亡、壞死[20]。本研究實驗組卵巢內GSH-Px與Gpx1均較對照組降低，SOD活性較對照組降低，Noxo1表達水平升高，我們推測氟他胺可能抑制GSH-Px與SOD的活性，導致ROS大量生成，從而對卵巢組織造成損傷。

綜上所述，用300 mg/(kg·d)氟他胺灌胃孕鼠可致雌性子鼠子宮和卵巢損傷，并對其抗氧化應激能力造成一定的影響。子鼠子宮和卵巢的損傷機制到底是由于氟他胺影響睪酮水平、競爭靶器官受體，還是由于氟他胺抑制其抗氧化應激能力而導致細胞凋亡、壞死，有待我們進一步研究。