同型半胱氨酸增加阿爾茲海默癥患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

胡夏練，郭錫漢，馬曉玲，汪 旭，3，*

( 1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500；2．上海三譽(yù)華夏基因科技有限公司，上海 201100；3．云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500 )

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是由甲硫氨酸經(jīng)脫甲基作用產(chǎn)生的一種含硫的非必需氨基酸，其不參與蛋白質(zhì)的合成。在一碳代謝中，甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(methionine adenosyltransferase，MAT)催化甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)，SAM可作為細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)的甲基供體參與甲基化，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)，SAH經(jīng)過可逆的 水 解產(chǎn)生Hcy。Hcy在甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MS)以維生素B12為輔酶的作用下再甲基化合成甲硫氨酸和四氫葉酸；也可在維生素B6為輔酶的胱硫醚 β合成酶(cystathionine synthase，CBS)催化下合成半胱氨酸。此外，Hcy也可與甜菜堿在甜菜堿羥甲基轉(zhuǎn)移酶(betaine hydroxymethyltransferase，BHMT)的催化下合成甲硫氨酸，Hcy代謝途徑見圖1[1-2]。MS、CBS和BHMT等的遺傳缺陷以及B6、B12等輔酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)存留過量的Hcy，進(jìn)入血液中，造成高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。正常人血漿Hcy濃度為5~15 μmol/L，15～30 μmol/L為輕度增高，30～100 μmol/L為中度增高，大于100 μmol/L為重度增高[3]。

阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，是癡呆癥中最常見的類型，其主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶喪失、認(rèn)知衰退、學(xué)習(xí)障礙等癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活[4]。AD是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，且隨著年齡的增長，個(gè)體患AD的風(fēng)險(xiǎn)增加，一些環(huán)境因素(如肥胖、抽煙和不健康的生活方式等)也會(huì)增加個(gè)體AD患病風(fēng)險(xiǎn)[5]。大量流行病學(xué)和臨床研究顯示，AD的發(fā)生和發(fā)展伴隨著血漿Hcy的升高，HHcy使個(gè)體AD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加一倍[3-5]?，F(xiàn)就Hcy增加AD患病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 Hcy誘導(dǎo)β -淀粉樣蛋白沉積

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一種存在于全身組織細(xì)胞上的單次跨膜蛋白，廣泛存在于腦細(xì)胞中。APP蛋白的裂解主要由 β-分泌酶(如BACE-1)和 γ-分泌酶(如早老素PS-1/PS-2)催化， β-分泌酶剪切APP形成一個(gè)可溶性細(xì)胞外N-末端(sAPPβ) ，隨后 γ-分泌酶進(jìn)一步剪切形成一個(gè)跨膜的C-末端(CTFβ)，這種結(jié)構(gòu)易于形成 β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)[6]。Aβ具有一定神經(jīng)毒性，可通過氧化應(yīng)激、影響Ca2+平衡、激活caspase途徑、誘導(dǎo)線粒體損傷等途徑造成神經(jīng)細(xì)胞死亡[7-8]。 Zhang等[6]在HHcy小鼠中發(fā)現(xiàn)Aβ水平增加的同時(shí)，APP蛋白量下降，PS-1的mRNA和蛋白水平均上調(diào)，但是 β-分泌酶的表達(dá)無顯著變化，還發(fā)現(xiàn)APP裂解的關(guān)鍵位點(diǎn)——蘇氨酸-668的磷酸化水平增加。另一方面，諸多研究證實(shí)PS-1的表達(dá)受其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的嚴(yán)格調(diào)控，Hcy誘導(dǎo)其啟動(dòng)子區(qū)CpG島的胞嘧啶甲基化水平降低，造成PS-1過表達(dá)[9]，PS-1上調(diào)增加APP異常裂解為Aβ4 0和Aβ42[10]，而過磷酸化的APP蘇氨酸-668則增加APP與BACE-1的結(jié)合，BACE-1剪切APP形成A β[11]。此外，近期有研究發(fā)現(xiàn)高Hcy通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)SAH/SAM比(SAH/SAM ratio)增加，SAH量增多，甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低，導(dǎo)致5-脂氧合酶(5 LO)基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA低甲基化并最終上調(diào)5LO蛋白，5LO通過激活cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)來增加γ-分泌酶的表達(dá)，形成Aβ沉積[12]。另外，5LO能夠促進(jìn)花生四烯酸合成白三烯，白三烯是許多炎癥和過敏癥狀的重要介質(zhì)，繼而誘發(fā)神經(jīng)炎癥[13]。

2 Hcy誘發(fā)Tau蛋白過磷酸化

Tau蛋白是1975年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的微管相關(guān)蛋白，由位于17q21.31的 M APT基因編碼。Tau蛋白為含磷酸基蛋白，是細(xì)胞骨架的重要組成成分，其與微管結(jié)合以提高微管的穩(wěn)定性，并參與神經(jīng)細(xì)胞中的軸突運(yùn)輸，正常腦細(xì)胞中一個(gè)Tau分子含2～3個(gè)磷酸基[14]。在高水平Hcy暴露下，神經(jīng)元細(xì)胞中與Tau磷酸化作用相關(guān)的去磷酸酶和磷酸激酶的表達(dá)發(fā)生改變，如蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)和糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)等。PP2A是一種Tau蛋白去磷酸化酶，Sontag等[15]的研究表明，高水平Hcy能夠降低PP2A、亮氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(leucine carboxyl methyltransferase 1，LCMT1)以及PP2A/Bα全酶的甲基化水平，導(dǎo)致PP2A的表達(dá)下調(diào)，減弱Tau的去磷酸化，這可能是Hcy增加AD風(fēng)險(xiǎn)的一種新機(jī)制。與PP2A相反，CDK5和GSK-3都是Tau蛋白主要的磷酸化激酶，高水平Hcy能夠通過激活CDK5和GSK-3通路，以增加Tau蛋白的磷酸化水平[16]，Tau蛋白的高磷酸化位點(diǎn)主要在蘇氨酸-231/絲氨酸-235和絲氨酸-396[17]。此外，Hcy可激活含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)，caspase-3能夠識(shí)別Tau蛋白C-末端并參與剪切Tau蛋白形成C-末端截?cái)郲18]。C-末端截?cái)嘣黾雍蚑au蛋白特異位點(diǎn)的高磷酸化，導(dǎo)致兩個(gè)Tau單體易結(jié)合形成Tau二聚體，隨后形成Tau低聚復(fù)合物(Tau oligomer complex 1，TOC1)，Tau二聚體和TOC1不能與微管結(jié)合，導(dǎo)致微管穩(wěn)定性下降。隨后，Tau二聚體成對(duì)聚集形成螺旋纖絲，最終在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)，損傷神經(jīng)細(xì)胞[17-18]。近年來，也有研究顯示，CDK5的激活與P35和P25有關(guān)，而由Hcy誘導(dǎo)上調(diào)的5LO可通過提高P35和P25的表達(dá)增加CDK5的活性，導(dǎo)致Tau高磷酸化，且5LO對(duì)Tau蛋白的高磷酸化作用獨(dú)立于其對(duì)Aβ的作用[17-19]。

3 Hcy誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷

研究表明，Hcy可能通過對(duì)細(xì)胞的DNA造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂[20]。在神經(jīng)細(xì)胞中，DNA損傷是其凋亡的一個(gè)主要原因，而細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的神經(jīng)元大量丟失可能導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSCs)在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用，NSCs對(duì)DNA損傷十分敏感，如DNA鏈斷裂、端粒長度縮短和DNA鏈間交聯(lián)等[21]。 Wang等[21]的研究發(fā)現(xiàn)Hcy呈劑量依賴性地誘導(dǎo)NSCs的DNA鏈間交聯(lián)，并誘發(fā)活性氧產(chǎn)生。Lin等[22]發(fā)現(xiàn)Hcy通過誘導(dǎo)SAH的增加，并伴DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)和活性均降低，導(dǎo)致DNA甲基化異常，影響神經(jīng)細(xì)胞的增殖。Currò等[24]發(fā)現(xiàn)Hcy誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞活性下降35%，拖尾細(xì)胞增加30%，DNA損傷指數(shù)增加2倍，活性氧水平增加4倍，且與DNA損傷相關(guān)的 B ax、Bcl-2、 P 53、 P 16和 P21基因均顯著上調(diào)。因此，高濃度Hcy可能通過破壞DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷和遺傳毒性。

此外，自由基可使DN A的堿基和脫氧核糖發(fā)生化學(xué)變化，引起堿基改變、破壞或脫落，脫氧核糖分解，形成 D NA蛋白質(zhì)交聯(lián)和磷酸二酯鍵斷裂等，自由基可與核酸反應(yīng)，形成許多類型的堿基修飾產(chǎn)物，最常見的如8-羥基-2'-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)[25]。8-OHdG可作為DNA氧化損傷的重要指標(biāo)，近年來，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，許多能誘導(dǎo)活性氧生成的外源化學(xué)物質(zhì)或物理因素均可導(dǎo)致8-OHdG的增加。Chen等[26]的研究表明，高水平Hcy處理加重大腦皮質(zhì)和海馬齒狀回區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷。此外，Hcy水平升高還顯著伴隨著線粒體復(fù)合物I~III酶活性的抑制以及細(xì)胞色素C的增加，同時(shí)8-OHdG水平增加。體外研究顯示，使用谷胱甘肽乙酯(一種ROS抑制劑)能夠抑制Hcy介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的過度激活，降低ROS。

4 Hcy誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬異常

自噬(autophagy)是一種由基因調(diào)控 的 對(duì)細(xì)胞內(nèi)變性和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及受損細(xì)胞器進(jìn)行降解的過程。適度的自噬可為細(xì)胞修復(fù)和動(dòng)態(tài)平衡提供營養(yǎng)和能量，還能降低活性氧和促凋亡蛋白的表達(dá)，但是自噬作用不足或過強(qiáng)均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)，如自噬性細(xì)胞死亡[27]。

近期研究表明自噬在神經(jīng)細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)中具有重要作用。雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)是與細(xì)胞合成、分解和代謝緊密相關(guān)的主要激酶，mTORC1通過對(duì)自噬特征性蛋白ATG13磷酸化而抑制細(xì)胞自噬[28]。 Khayati等[29]發(fā)現(xiàn)高濃度Hcy導(dǎo)致mTORC1活性顯著增加。推測Hcy通過激活mTORC1，抑制細(xì)胞內(nèi)自噬作用，并造成Aβ和Tau等異常蛋白的積累[29-30]。此外，Notch信號(hào)通路在細(xì)胞分化中具有重要作用，已有研究表明Notch與自噬的信號(hào)調(diào)控有關(guān)[31]。發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy enhancer of split 1/5，hes1/5)是Notch1受體下游信號(hào)分子，介導(dǎo)神經(jīng)元再生，其缺乏會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。Zhang等[32]在高水平Hcy小鼠中發(fā)現(xiàn)hes1和hes5的表達(dá)均降低，線粒體空泡化、神經(jīng)元凋亡增加、自噬體增多，推測Hcy可能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞過度自噬和凋亡。另外，有研究表明PS-1/PS-2在介導(dǎo)自噬過程中也具有重要意義[33]，PS-1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致自噬不足，而高水平Hcy能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中PS-1過表達(dá)引起神經(jīng)細(xì)胞自噬過度[34]。 Zhao等[35]的研究表明，Hcy可通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中8-OHdG含量的增加，造成神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，且與自噬相關(guān)的蛋白輕鏈 3( light chain 3，LC3)和beclin-1表達(dá)增加，引起自噬過度。

5 結(jié)語

Hcy是一碳單位代謝中的重要中間產(chǎn)物，是AD風(fēng)險(xiǎn)增加的主要因素之一，維生素B12、B6和葉酸的缺乏，甲硫氨酸的過量攝入等都能夠?qū)е麦w內(nèi)Hcy濃度升高。HHcy通過誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞外Aβ沉積、細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過磷酸化、神經(jīng)元DNA損傷、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡和自噬異常等在AD發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。基于年齡(以65歲為界限)可將AD分為兩類：早發(fā)性阿爾茲海默癥(early-onset Alzheimer’s disease，EOAD)和晚發(fā)性阿爾茲海默癥(late-onset Alzheimer’s disease，LOAD)[4，36]。高濃度Hcy可通過對(duì)基因表達(dá)的影響，誘發(fā)一系列的細(xì)胞應(yīng)答及信號(hào)通路。有研究顯示，Hcy可能通過影響相關(guān)基因如APP、 P S-1、 P S-2等的遺傳變異，增加EOAD的發(fā)生和發(fā)展，造成AD的發(fā)病年齡提早化[37]。此外，近年來有研究用孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization，MR)從遺傳學(xué)和基因角度系統(tǒng)評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)因素與AD之間的因果關(guān)系，認(rèn)為端粒長度(telomere length，TL)縮短與AD風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)[38]。但是，Hcy對(duì)神經(jīng)細(xì)胞TL的影響鮮有報(bào)道，因此，設(shè)立較好的MR研究有助于確定AD風(fēng)險(xiǎn)與遺傳因素之間的關(guān)系。雖然Hcy誘導(dǎo)AD風(fēng)險(xiǎn)增加的分子機(jī)制仍存在許多未知，需要更為深入的體內(nèi)外研究以及動(dòng)物模型研究來探討，但是Hcy對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步揭示可以為AD等神經(jīng)退行性疾病的防治提供新的策略和方向。