p53在調(diào)控DNA 損傷所致MDA-MB-231細(xì)胞死亡中的作用及其機(jī)制

姜朋濤，胡志芳，高興春，郭 娜，張 典，姜鳳良*

（西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室，西安 710021）

全球乳腺癌占女性癌癥發(fā)病總例數(shù)的25%，占女性癌癥死亡總例數(shù)的15%[1]。中國乳腺癌統(tǒng)計數(shù)據(jù)雖顯著低于此數(shù)值，但是人口基數(shù)大，而且發(fā)病數(shù)和死亡率均逐年上升[2]。所以，乳腺癌嚴(yán)重威脅女性的健康，對乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究具有重大意義。目前乳腺癌發(fā)病機(jī)制的探索主要集中在癌細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制等多個方面，其中基因組遺傳學(xué)改變是其中一個重要的研究方向[3]?；蚪M遺傳學(xué)改變(DNA損傷等)可以自發(fā)產(chǎn)生，但是更多見于各種理化因素所致，比如紫外線、電離輻射、某些藥物等。DNA損傷嚴(yán)重時可以引起乳腺細(xì)胞的死亡，而低劑量的DNA損傷可引起乳腺細(xì)胞功能蛋白發(fā)生突變導(dǎo)致細(xì)胞癌變的發(fā)生。p53蛋白是一個重要的DNA損傷修復(fù)蛋白，一旦其自發(fā)或者誘發(fā)產(chǎn)生突變，均會引起細(xì)胞癌變[4]。所以，探索DNA損傷及損傷后修復(fù)過程中p53等相關(guān)蛋白的功能改變對于深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有重要意義。本文擬初步研究在紫外線照射引起的乳腺癌細(xì)胞DNA損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生輕度死亡過程中乳腺癌細(xì)胞基因組遺傳學(xué)改變相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，這將為治療乳腺癌尋找新靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細(xì)胞系購自上海細(xì)胞研究所；用于此細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒為日本同仁化學(xué)公司產(chǎn)品。剪切PARP抗體(c-PARP，1∶2 000，兔)、p21(1∶ 2 000， 兔 )、 Actin(1∶ 5 000， 鼠 )為 Cell Signaling公司產(chǎn)品；磷酸化p53(p-p53，1∶500，兔)，p53(1∶500，鼠)，磷酸化H2AX(p-H2AX，1∶500，鼠)為Abcam公司產(chǎn)品；NF-90(1∶1 000，鼠)為Santa Cruz公司產(chǎn)品。羊抗鼠-HRP(1∶2 500，115-035-003)和羊抗兔-HRP(1∶2 500，111-035-003)均為美國Jackson Immuno公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA損傷誘導(dǎo) 本實驗應(yīng)用短波紫外線(UVC，簡稱UV，100 nm<波長<280 nm)照射誘導(dǎo)DNA損傷。根據(jù)紫外線輸出功率計算本實驗所用UVC照射箱為距離光源30 cm處時，照射1 s為1 J/m2。本實驗選擇照射5和20 s時劑量分別為5和20 J/m2，同時設(shè)未照射細(xì)胞為對照組。照射完成后細(xì)胞繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中孵育相應(yīng)時間后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過不同劑量紫外線(5和20 J/m2)處理后，繼續(xù)孵育24 h，按照CCK-8試劑盒說明書的步驟進(jìn)行檢測，每孔加入10 μL CCK-8后2 h，用全自動酶標(biāo)儀讀取 D(450)值，檢測不同強(qiáng)度紫外線處理后細(xì)胞的增殖情況。

1.2.3 Western blot檢測紫外線處理后不同時間磷酸化H2AX及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 由于磷酸化H2AX蛋白是DNA損傷的標(biāo)志物[5]，通過檢測其表達(dá)水平可以反映是否引起了細(xì)胞DNA損傷，同時檢測與DNA損傷機(jī)制相關(guān)的p-p53、 p 53、 NF-90等蛋白。收集5 J/m2紫外線處理后不同時間點(0.5、1、2、4、8、12和24 h)的細(xì)胞，用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，BCA(bicinchoninic acid)法測定細(xì)胞提取上清中的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)上樣量為50 μg，配置SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶孵育2 h后滴加一抗(詳見材料部分)，4 ℃孵育過夜；第2天， 滴 加二抗室溫孵育1 h。常規(guī)顯影、定影。應(yīng)用FIJI 軟件(http://fiji.sc/，基于Image J的圖像分析軟件)對Western blot膠片進(jìn)行灰度分析，計算相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量[6]。

1.2.4 紫外線處理后不同時間點c-PARP和p21蛋白表達(dá)的變化 檢測PARP剪切(c-PARP)水平，可提示DNA損傷的修復(fù)功能受到影響的程度，這也是細(xì)胞死亡有一定增多的原因。而p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase，CDK)家族中的重要成員，p21的表達(dá)增加，最終引起細(xì)胞周期G1阻滯的發(fā)生。為了探究紫外線引起細(xì)胞死亡的原因，我們通過Western blot實驗檢測了5 J/m2紫外線處理細(xì)胞不同時間點(0.5、1、2、4、8、12和24 h)后c-PARP和p21蛋白表達(dá)的變化。Western blot檢測方法同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用Excel作圖及進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以x± s表示，兩組間比較采用t檢驗，以α =0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同強(qiáng)度紫外線照射對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組(未照射組)比較，5和20 J/m2的UV C照 射MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，5 J/m2處理組即可以引起細(xì)胞死亡增加、增殖減慢(存活率89%，P<0.05)，而當(dāng)細(xì)胞在20 J/m2的紫外線照射后，細(xì)胞發(fā)生明顯死亡(存活率僅為22%， P<0.01)。由于本文目的為檢測DNA損傷時乳腺癌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，所以后續(xù)實驗將使用引起細(xì)胞死亡較溫和的5 J/m2處理細(xì)胞。

圖1 不同強(qiáng)度紫外線處理后細(xì)胞的存活情況

2.2 紫外線照射引起p-H2AX水平的變化

圖2 為Western blot蛋白免疫印跡法檢測DNA損傷和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白c-PARP、p-p53、p53、p21、NF-90和p-H2AX結(jié)果。圖3所示為p-H2AX與對照組比較的相對表達(dá)量，5 J/m2紫外線處理后0.5 h即可引起細(xì)胞DNA損傷(p-H2AX)增加(P<0.05)，到2 h后，引起細(xì)胞DNA損傷增加非常明顯(P<0.05)，12 h時磷酸化H2AX蛋白達(dá)峰值(P<0.05)，直到我們的檢測終點24 h，DNA損傷較12 h時降低，但仍顯著高于對照組(P<0.05)。以上結(jié)果說明紫外線處理后DNA損傷非常明顯。

圖2 Westernblot檢 測U VC 處理不同時間后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

圖3 UVC處 理后不同時間點 p -H2AX蛋白表達(dá)的變化

2.3 UVC通過p21-PARP通路引起細(xì)胞死亡增加

如圖4A所示，與對照組比較，UVC處理8、12和24 h后c-PARP水平均明顯升高(P<0.05)，這提示細(xì)胞發(fā)生死亡，DNA損傷的修復(fù)功能受到影響。而p21在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷中均發(fā)揮著重要作用，它的降解將直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)功能的損傷，與細(xì)胞死亡直接有關(guān)[7]。圖4B顯示在紫外線處理0.5 h后即開始出現(xiàn)p21的降解，并且p21的表達(dá)水平持續(xù)偏低(P<0.05)，所以DNA損傷的修復(fù)功能受損與p21的快速降解密切相關(guān)。

2.4 p53參與調(diào)控DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

圖4 UVC處 理后不同時間點 c- PARP 和 p21蛋白表達(dá)的變化

在p21蛋白持續(xù)低水平表達(dá)時，乳腺癌細(xì)胞并沒有發(fā)生細(xì)胞大部分死亡。那么，什么因素參與調(diào)控這一過程呢？p21是p53重要的下游分子，同時，野生型p53可以參與對p21的調(diào)控。所以我們檢測了p53的改變。如圖5A所示，與DNA損傷一致，在處理早期就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA損傷相關(guān)分子p53的磷酸化增加，在此過程中，p53并未見顯著性變化(圖5B)。由于核因子NF-90與NF-45形成異源二聚體在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控p53和p21的表達(dá)[8]。所以我們同時對NF-90的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-90的表達(dá)并無明顯改變，這就提示我們這一過程不依賴于NF-90蛋白量的改變(圖6)。這些結(jié)果提示p53并未參與p21降解引起的細(xì)胞死亡增多，那么它的增多發(fā)揮什么作用及其具體機(jī)制仍有待我們進(jìn)一步研究。

圖5 UVC處理后不同時間點p-p53和p53蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素導(dǎo)致的乳腺細(xì)胞DNA損傷修復(fù)缺失密切相關(guān)，DNA損傷引起細(xì)胞周期阻滯后細(xì)胞啟動DNA修復(fù)過程，這其中包括多種功能蛋白的參與，比如ATM、BRCA-1、p53和PARP-1等[9]。在此過程中任何步驟或分子發(fā)生改變均可引起細(xì)胞癌變的發(fā)生，所以細(xì)胞對于DNA損傷后啟動的保護(hù)機(jī)制需要我們進(jìn)一步闡明[10]。

本文通過紫外線體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，發(fā)現(xiàn)在低劑量時雖然有PARP的剪切發(fā)生，這一過程與p21的快速降解密切相關(guān)，細(xì)胞發(fā)生少量死亡。p21作為一種細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑，它的表達(dá)水平在多種DNA損傷刺激時均可增高，引起細(xì)胞阻滯的發(fā)生，為DNA損傷的修復(fù)提供時間。但是對于其在DNA修復(fù)中的作用仍有爭議[11]。有報道發(fā)現(xiàn)p21 由于受到DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素化降解[12]。本實驗觀察的DNA損傷后p21快速降解(圖4B)也驗證了這一結(jié)果。另外，p21在細(xì)胞死亡中的作用也存在巨大爭議。一般認(rèn)為，p53引起p21的表達(dá)增加，可以有效抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生，但也有相反的報道，如p21高表達(dá)的細(xì)胞在UV刺激的時候可以引起p53依賴的細(xì)胞死亡增加[13]?？傊?，p21由于細(xì)胞類型、細(xì)胞定位、p53狀態(tài)和DNA損傷刺激的不同發(fā)揮著不同作用[14-15]。本文中我們的實驗結(jié)果提示p21的快速降解導(dǎo)致DNA修復(fù)功能的缺失，PARP剪切增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，但是細(xì)胞死亡并不十分明顯(與高劑量相比)。那么，在這一過程中抑制細(xì)胞死亡的機(jī)制是什么呢？

p53是一個重要的抑癌基因，它在DNA損傷修復(fù)中也發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時，p53磷酸化增加，從而導(dǎo)致與鼠雙微粒體(murine double minute 2， M DM2)親和力降低，p53被功能性釋放繼而激活下游DNA損傷修復(fù)蛋白，同時它募集下游分子如p21，引起細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，這樣細(xì)胞就有足夠的時間對基因組進(jìn)行修復(fù)，如果不能有效修復(fù)，p53又可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。但是，由于p53被鑒定出是癌癥中最容易發(fā)生突變的蛋白之一，突變導(dǎo)致上述功能的缺失，最終引起細(xì)胞癌變的發(fā)生[18]。乳腺癌相關(guān)的實體瘤或者細(xì)胞系中存在多種p53突變，在MDA-MB-231細(xì)胞中存在p53 R280K突變，此突變可以參與促進(jìn)細(xì)胞存活的調(diào)控[19]，并最終參與抑制DNA損傷對MDAMB-231細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)作用。綜上所述，結(jié)合我們的實驗結(jié)果，突變的p53磷酸化增加促進(jìn)其參與抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生。

同時，我們對p53和p21的調(diào)控進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示NF-90的表達(dá)水平并未發(fā)生明顯改變。NF-90是剪切體的一個成員，含有雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域，它可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞漿結(jié)合在p21的3′UTR區(qū)從而穩(wěn)定p21 mRNA[20]。在后續(xù)實驗中我們將繼續(xù)研究NF-90的轉(zhuǎn)位對p53和p21的調(diào)控，同時我們將研究這一過程中細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。

由于癌癥細(xì)胞中一些DNA修復(fù)相關(guān)分子多發(fā)生結(jié)構(gòu)或者功能的改變，所以基于這些分子研究其靶向治療藥物是腫瘤靶向治療的一個重要方向，多種相關(guān)藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)上市[21]。p53和p21既參與腫瘤抑制作用，又能通過抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性、協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，促進(jìn)腫瘤存活，所以它們在不同細(xì)胞系，不同刺激狀態(tài)作用下所表現(xiàn)的功能改變均可以作為腫瘤藥物個體化治療的靶分子。本研究初步揭示了在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中DNA損傷引起細(xì)胞死亡及其保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步明確了在MDA-MB-231細(xì)胞中DNA損傷時p53和p21的改變，為基于p53或者p21的腫瘤治療提供了實驗支持。