DDX46調(diào)控食管鱗癌TE-11細胞惡性生物學(xué)行為的機制探討

李 斌，藺軍平，馮海明，楊建寶，宋鐵牛，敬 濤，孟于琪

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院胸外科，蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030

最近研究發(fā)現(xiàn)，DNA和蛋白質(zhì)之間的中介物質(zhì)mRNA可能成為一種很有前景的抗腫瘤藥物靶點［1］。涉及RNA的生物進程需要RNA解旋酶。它參與RNA代謝的所有環(huán)節(jié)［2-3］，RNA解旋酶還可以通過改變癌基因表達水平，調(diào)控腫瘤啟動和進展相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4］。DDX46是DDX蛋白家族RNA解旋酶成員，其在人類腫瘤中的表達及與腫瘤的相關(guān)性罕見報道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中DDX46蛋白和mRNA的表達均明顯高于相對應(yīng)食管正常組織，DDX46基因沉默能夠顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖［5］。然而，DDX46表達與食管鱗癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系及可能的調(diào)控機制目前尚不清楚。本研究采用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾技術(shù)，觀察靶向沉默DDX46基因?qū)κ彻荀[癌TE-11細胞惡性生物學(xué)行為的影響，探討其可能的分子機制，為尋找食管鱗癌新型腫瘤標志物和治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

本實驗所用主要試劑包括：RNAlater（德國Qiagen公司），TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），胎牛血清（澳大利亞Ausbian公司），胰蛋白酶、EDTA（上海生工生物工程股份有限公司），dNTPs、Rnase Inhibitor及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（美國Promega公司），Primer（廣州銳博生物科技有限公司），SYBR premix ex taq、PCR擴增試劑盒（日本TaKaRa公司），RPMI-1640細胞培養(yǎng)基（美國Lonza公司），Giemsa（上海鼎國生物技術(shù)有限公司），D-Hanks液（美國Sigma公司），GAPDH、Akt及P-Akt抗體（美國Santa Cruz公司），mTOR、Beclin 1抗體（美國Cell Signaling Technology公司），DDX46、PIK3CG、PTEN及LC3抗體（美國Abcam公司），Annexin V-APC single-staining凋亡試劑盒（美國eBioscience公司），ECL蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）Substrate試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人食管鱗癌細胞株TE-11購自上海拜力生物科技有限公司，置于RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。DDX46基因RNAi靶點序列和shRNA慢病毒（shDDX46）制備和包裝由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計完成，DDX46基因shRNA序列：5’-AGAAATCACCAGGCTCATA-3’，陰性對照序列（shCtrl）應(yīng)用公認序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’［6］。胰蛋白酶消化對數(shù)生長期TE-11細胞，然后RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸制成（3～5）×104個細胞/mL的懸液，均勻接種至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；鋪板量達到30%左右時，更換感染培養(yǎng)基，加入最適病毒量進行感染（感染復(fù)數(shù)為10），實驗組（shDDX46組）病毒滴度2×108TU/mL、病毒感染用量10 μL，對照組（shCtrl組）病毒滴度4×108TU/mL、病毒感染用量5 μL；感染后12 h，更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；觀察細胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，實驗組與對照組細胞狀態(tài)相當(dāng)；感染后72 h，使用熒光顯微鏡觀察報告基因綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的表達情況，熒光率即為陽性感染率，細胞感染率達到70%以上者可以繼續(xù)下游實驗。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3 RT-PCR

收集對數(shù)生長期的目的細胞，經(jīng)TRIzol試劑充分裂解后提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測其純度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定樣品的完整性。依據(jù)美國Promega公司的M-MLV操作說明書反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA。引物來自廣州市銳博生物科技有限公司，以GAPDH基因為內(nèi)參（表1）。兩步法進行RT-PCR，2-??CT法計算DDX46基因mRNA的相對表達量（?CT=目的基因CT值－內(nèi)參基因CT值；??CT=樣品?CT值－對照組?CT平均值）。實驗重復(fù)3次。

表 1 PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences of PCR

1.4 細胞計數(shù)檢測

收集對數(shù)生長期的目的細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細胞成懸液并計數(shù)；以2 000個細胞/孔接種于96孔板中，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)體系為100 μL/孔，鋪板過程中每孔加入細胞數(shù)一致，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；鋪板后第2天開始，每天用Cellomics高內(nèi)涵篩選成像系統(tǒng)（high content screening，HCS）檢測讀板1次，連續(xù)5 d；計算出每次HCS檢測掃描孔板中帶綠色熒光的細胞數(shù)量，繪出5 d的細胞增殖曲線圖：根據(jù)細胞計數(shù)值和時間點，繪制基于細胞計數(shù)值的細胞生長曲線；計算各組細胞各時間點細胞計數(shù)值與該組第1天的細胞計數(shù)值的比值，獲得該組細胞各時間點的增殖倍數(shù)，根據(jù)該增殖倍數(shù)和時間點，繪制基于細胞增殖倍數(shù)的細胞生長曲線。

1.5 克隆形成實驗

收集對數(shù)生長期的目的細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細胞成懸液并計數(shù)；以600個細胞/孔接種于6孔板培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)體系為2 mL/孔；將接種細胞置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)15 d，中途每5 d換液并觀察細胞狀態(tài)。實驗終止時PBS洗滌細胞1次；每孔加入4%多聚甲醛溶液1 mL，固定細胞30～60 min，PBS洗滌細胞1次；每孔加入Giemsa染液500 μL，染色細胞10～20 min；ddH2O洗滌細胞數(shù)次，晾干后拍照，克隆計數(shù)（含有50個以上細胞的克隆計為1個細胞克隆）。

1.6 細胞凋亡檢測

收集6孔板對數(shù)生長期目的細胞胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細胞成懸液，與孔板上清液細胞收集于同一5 mL離心管中（細胞數(shù)≥5×105個），每組設(shè)3個孔；1 300 r/min離心5 min，棄去上清液，4 ℃預(yù)冷的D-Hanks液（pH值為7.2～7.4）洗滌細胞沉淀1次；Binding Buffer洗滌細胞沉淀1次，1 300 r/min離心3 min收集細胞；200 μL Binding Buffer重懸細胞沉淀；加入10 μL Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min，上流式細胞儀檢測。

1.7 蛋白表達Western blot檢測

取出目的細胞，PBS洗滌2次后，刮下細胞轉(zhuǎn)移入EP管中，經(jīng)10～15 min冰上裂解后，超聲200 W破碎細胞4次（每次5 s，間隔2 s），4 ℃、12 000 r/min離心15 min，完成細胞總蛋白抽提。取上清BCA法測定蛋白濃度，按每孔上樣量20 μg進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），4 ℃穩(wěn)壓將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，封閉液室溫封閉PVDF膜1 h；封閉液稀釋一抗（DDX46稀釋度1∶200，PIK3CG稀釋度1∶1 000，Akt稀釋度1∶500，P-Akt稀釋度1∶500，PTEN稀釋度1∶1 000，mTOR稀釋度1∶1 000，Beclin 1稀釋度1∶1 000，LC3稀釋度1∶1 000，GAPDH稀釋度1∶2 000），然后稀釋的一抗溫育封閉好的PVDF膜4 ℃過夜，洗膜緩沖液洗膜3次，每次10 min；封閉液稀釋相應(yīng)的二抗（稀釋度1∶2 000），然后稀釋的二抗室溫下溫育PVDF膜2 h，洗膜緩沖液再洗膜3次，每次10 min；按照ECL Western Blot Substrate試劑盒說明書完成X線顯影，晾干后用凝膠成像處理系統(tǒng)掃描拍照，進行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用x±s表示，均數(shù)間差異的比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)的RNAi有效抑制DDX46基因的表達

慢病毒感染72 h后，熒光顯微鏡觀察目的細胞GFP的表達情況，100倍視野計數(shù)各組熒光細胞數(shù)（shCtrl組：446±13，shDDX46組：465±16）和總細胞數(shù)（shCtrl組：539±21，shDDX46組：560±23），熒光細胞占比即為陽性感染率，本實驗細胞感染率達到80%以上。經(jīng)shDDX46慢病毒轉(zhuǎn)染后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，TE-11細胞DDX46基因mRNA表達明顯受到抑制（圖1，P＜0.001），敲減效率為86.5%；Western blot檢測結(jié)果見圖1，條帶灰度分析顯示，TE-11細胞DDX46蛋白表達明顯受到抑制（P＜0.001）。

圖 1 熒光顯微鏡觀察慢病毒目的細胞感染率（×100），RT-PCR和Western blot檢測DDX46基因敲減效率Fig. 1 Transfection eciency monitored under fluorescence microscope (×100), RT-PCR and Western blot analysis showing that lentivirusmediated RNAi eciently decreased DDX46 expression***: P＜ 0.001

2.2 靶向沉默DDX46基因抑制TE-11細胞生長

感染慢病毒的目的細胞帶有綠色熒光，HCS可連續(xù)讀取帶熒光信號的細胞并拍照，然后通過軟件分析計算出各孔板中不同組別含有的目的細胞數(shù)目。慢病毒感染目的細胞3 d后，HCS連續(xù)檢測5 d，記錄同一視野各時間點帶綠色熒光的細胞數(shù)目，分別繪制計數(shù)值細胞生長曲線和增殖倍數(shù)細胞生長曲線。與對照組（shCtrl組）相比，實驗組（shDDX46組）TE-11細胞生長被顯著抑制（P＜0.01，圖2）。

2.3 靶向沉默DDX46基因抑制TE-11細胞克隆形成

單個細胞在體外持續(xù)6次傳代以上所組成的細胞群稱為克隆。通過計數(shù)克隆形成率，可以了解細胞的獨立生存和增殖成瘤能力。目的細胞持續(xù)培養(yǎng)15 d后終止實驗，數(shù)碼相機拍照，克隆計數(shù)，收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。每組3個重復(fù)平板，相對于shCtrl組克隆形成數(shù)（133±8），靶向沉默DDX46基因后，TE-11細胞克隆形成數(shù)（shDDX46組，37±2）顯著減少（P＜0.01），細胞增殖能力被顯著抑制（圖3）。

圖 2 細胞計數(shù)檢測顯示沉默DDX46基因抑制TE-11細胞生長Fig. 2 HCS monitoring showed that silencing DDX46 inhibited proliferation of TE-11 cells A: Dynamic growth of GFP-labeled TE-11 cells transfected with shCtrl and shDDX46 was monitored once a day for 5 consecutive days using HCS (×50).B and C: GFP-labeled transfected TE-11 cells were counted and cell growth curves were drawn accordingly; P＜0.01, compared with shCtrl group

圖 3 克隆形成實驗顯示靶向沉默DDX46基因抑制TE-11細胞克隆形成Fig. 3 Silencing DDX46 suppressed colony formation capacity in TE-11 cells**: P＜0.01, compared with shCtrl group

2.4 靶向沉默DDX46基因誘導(dǎo)TE-11細胞凋亡

用Annexin V-APC單染法流式細胞儀檢測細胞凋亡能力，相對于shCtrl組（13.2%±0.23%），靶向沉默DDX46基因后，TE-11細胞凋亡率（shDDX46組，25.6%±0.28%）顯著升高（P＜0.01，圖4）。

2.5 Western blot檢測蛋白的表達水平

靶向沉默DDX46基因后，Western blot檢測PI3K-Akt-mTOR信號通路關(guān)鍵信號分子以及自噬相關(guān)蛋白的表達水平，條帶灰度分析結(jié)果顯示，PIK3CG、Akt、P-Akt和mTOR表達水平顯著下降（P＜0.01），PTEN表達水平無顯著變化（P＞0.05），而Beclin 1和LC3表達顯著上調(diào)（P＜0.01，圖5），提示靶向沉默DDX46可能通過下調(diào)PI3K-Akt-mTOR信號通路，同時激活細胞凋亡和自噬，進而影響食管鱗癌細胞生長增殖。

圖 4 單染法流式細胞術(shù)凋亡檢測顯示靶向沉默DDX46基因誘導(dǎo)TE-11細胞凋亡Fig. 4 Flow cytometry showed that silencing DDX46 promoted apoptosis of TE-11 cells**: P＜0.01, compared with shCtrl group

圖 5 Western blot檢測關(guān)鍵信號蛋白表達Fig. 5 Expression levels of key signaling protein measured by Western blot

3 討論

基因表達水平可以揭示某一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與腫瘤細胞的增殖或分化。前期研究我們收集了19例食管鱗癌患者新鮮手術(shù)癌及癌旁組織（癌組織及距腫瘤邊緣5 cm以上食管正常組織）樣本，應(yīng)用人全基因組表達譜芯片進行成對分析篩選差異表達基因，并使用RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)一個先前未被關(guān)注的在食管鱗癌組織顯著高表達的基因DDX46，免疫組織化學(xué)染色顯示，DDX46蛋白主要定位于細胞核，食管鱗癌組織中的表達明顯高于相對應(yīng)食管正常組織［5］。

DDX46是17S U2 snRNP復(fù)合物的組分［7］，在mRNA前體剪接和核糖體組裝中發(fā)揮核心作用［8-9］。人類DDX46基因位于染色體5q31.1上，有26個外顯子，編碼的DDX46蛋白相對分子質(zhì)量為131×103［10］。有文獻報道，DDX46在人結(jié)腸腺癌中表達明顯上調(diào)［11］，沉默DDX46基因可顯著抑制結(jié)腸腺癌細胞的增殖能力，可能是DDX46沉默后Caspase-3和PARP表達上調(diào)誘導(dǎo)細胞凋亡的結(jié)果，但具體機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向沉默DDX46基因能夠顯著抑制TE-11細胞增殖和克隆形成能力，凋亡細胞占比顯著增加；DDX46基因沉默后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，PIK3CG、Akt、P-Akt和mTOR表達顯著下調(diào)，PTEN表達水平無顯著變化，而Beclin 1和LC3表達上調(diào)。眾所周知，PI3K-Akt信號通路在許多人類腫瘤中異常激活［12-13］。Akt作為PI3K下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、凋亡和自噬等通路的匯合點［12］。mTOR作為PI3KAkt信號通路下游的重要效應(yīng)蛋白，是控制細胞自噬的中心蛋白，可通過上游各種信號因子的激活或抑制引起自身活性的變化，同時通過調(diào)節(jié)下游自噬復(fù)合物的形成，發(fā)揮對細胞自噬的直接調(diào)控作用［14-15］。正常情況下，mTOR處于活化狀態(tài)，通過磷酸化自噬起始分子ULK1（自噬泡形成所必需的一種蛋白激酶），抑制自噬的發(fā)生；mTOR活性被抑制，mTOR對ULK1的磷酸化抑制作用減弱，使ULK1激活并磷酸化mAtg13、FIP200和ULK1自身，從而啟動自噬［16］。之后，ULK1蛋白復(fù)合體從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其他自噬發(fā)生的特定位置，形成自噬發(fā)生的原核，從而募集下游的PI3K復(fù)合物、LC3等分子產(chǎn)生自噬泡［17］，LC3是自噬泡形成的標志蛋白［18］。Beclin 1（調(diào)節(jié)自噬現(xiàn)象的關(guān)鍵蛋白）是Akt的一個靶標，Beclin 1上Akt特異性磷酸化作用位點突變可以提高自噬，并抑制Akt誘導(dǎo)的腫瘤形成；Akt通過磷酸化Beclin 1促進Beclin 1定位于細胞骨架，抑制它的自噬功能，這些結(jié)果確定了Beclin 1自噬功能與腫瘤抑制功能之間的關(guān)聯(lián)，兩者均通過Akt特異性磷酸化作用受到調(diào)控［19］。抑癌基因PTEN是PI3K-Akt信號通路中的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)分子，人類腫瘤中廣泛存在PTEN基因突變或缺失，使PTEN蛋白失活，PTEN低表達間接刺激PI3K-Akt活動從而導(dǎo)致腫瘤形成［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白在食管鱗癌TE-11細胞中低表達，并且PTEN蛋白表達水平在DDX46基因沉默后無明顯變化，而PI3K和Akt在DDX46基因沉默后表達水平明顯下調(diào)，提示DDX46可能是PI3K-Akt信號通路中的另一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變［21-23］，某些情況下，自噬抑制凋亡，是細胞的存活途徑，但自噬本身也會誘發(fā)細胞死亡，或與凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情況下作為備份機制誘導(dǎo)細胞死亡。細胞自噬和凋亡通路相互關(guān)聯(lián)、互為調(diào)控，兩者的多重交互作用方式間存在共同的信號通路和調(diào)節(jié)蛋白：凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3通過剪切滅活Beclin 1抑制自噬促進凋亡［24］，而Beclin 1可通過提高Caspase-9活性而增強凋亡誘導(dǎo)劑誘發(fā)的細胞凋亡［25］。目前自噬調(diào)控用于治療腫瘤的潛力，因與凋亡之間的復(fù)雜交互作用而尚不清楚，究竟二者之間如何對話共同決定食管鱗癌細胞的命運，是下一步研究面臨的主要問題。

綜上所述，DDX46的異常表達介導(dǎo)了食管鱗癌細胞的非正常增殖，沉默DDX46可能同時激活細胞自噬和凋亡，進而影響食管鱗癌細胞生長增殖，PI3K-Akt-mTOR信號通路可能扮演重要角色。進一步研究闡明DDX46調(diào)控自噬與凋亡的交互作用及分子機制，將為尋找食管鱗癌新型生物學(xué)標志物和潛在治療靶點提供實驗依據(jù)。