ADIPOQ基因多態(tài)性與前列腺癌易感性的相關(guān)性研究

顧成元，吳俊龍，朱 煜，許 華，秦曉健，朱 耀，戴 波，葉定偉

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

肥胖往往伴隨著胰島素抵抗、高血糖癥、高胰島素血癥、脂代謝紊亂、高血壓、高凝和促炎狀態(tài)等一系列代謝異常和內(nèi)分泌紊亂［1］，進而影響前列腺癌等激素依賴性腫瘤的發(fā)生。脂肪組織可以被認為是一種新陳代謝旺盛的內(nèi)分泌器官，其分泌的一系列激素、生物活性多肽和細胞因子統(tǒng)稱為脂肪因子。與大多數(shù)脂肪因子不同，脂聯(lián)素是唯一的負性調(diào)節(jié)因子，低脂聯(lián)素血癥與肥胖、代謝綜合征及血脂代謝紊亂等密切相關(guān)［1］。同時前列腺癌患者的脂聯(lián)素水平明顯降低，且與Gleason評分以及腫瘤分期等均呈負相關(guān)［2］，因此脂聯(lián)素可能是一種“抗癌因子”，能預防前列腺癌的發(fā)生［2］。脂聯(lián)素由ADIPOQ基因編碼，據(jù)文獻報道其多個位點的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與腫瘤的易感性及預后有關(guān)，但在不同種族中的研究結(jié)果存在差異［3］。本研究旨在探討ADIPOQ基因標簽SNP rs266729和rs182052的多態(tài)性與漢族男性前列腺癌易感性之間的關(guān)系，并分析其與臨床特征的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

采用患者對照研究，納入2007年1月—2012年1月在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院就診的917例前列腺癌患者，所有患者均經(jīng)病理組織學確診。排除標準為病理類型非前列腺腺癌、既往有腫瘤病史以及由其他部位轉(zhuǎn)移而來的前列腺癌。按照年齡匹配（±5歲），從同期前列腺特異抗原（prostate-specific antigen，PSA）＜4 ng/mL、肛指檢查正常及無前列腺癌家族史的同一地區(qū)健康男性中隨機抽取1 036例作為正常對照組。以問卷調(diào)查和收集臨床患者資料的方法采集全部研究對象的有關(guān)資料，包括人口統(tǒng)計學特征、環(huán)境暴露因素及腫瘤家族史等。測量身高和體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標準，將BMI≥25 kg/m2作為亞洲人群中肥胖的界定值［4］。

1.2 基因分型檢測

每個研究對象均捐獻5 mL外周靜脈血以獲取基因組DNA用于基因分析。采用德國Qiagen公司試劑盒，按照操作步驟提取全基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，采用美國Biotek公司的Hybrid Synergy H4酶標儀檢測DNA的濃度和純度，定量標化至5 ng/μL，于4 ℃下分裝備用。采用TaqMan探針法進行基因分型,設(shè)計引物和探針購自美國ABI公司。反應(yīng)體系5 μL，包括1 μL DNA模板、0.125 μL引物探針、2.5 μL TaqMan Universal Master Mix及1.375 μL去離子水。在每個384孔反應(yīng)板中設(shè)置陰性空白對照。擴增條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增之后用ABI PRISM 7900HT熒光定量PCR儀檢測熒光分布情況，并應(yīng)用SDS 2.4軟件進行基因分型。隨機抽取10%的樣本重復實驗進行驗證，基因型符合率為100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性。數(shù)值變量用非配對的t檢驗，分類變量采用χ2檢驗。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。以非條件Logistic回歸模型，對可能的混雜因素（年齡、吸煙狀況及BMI）進行校正，計算比值比（odds ratio，OR）和95%CI來評估各種基因型與前列腺發(fā)病風險的相關(guān)性以及與各有關(guān)環(huán)境因素之間交互作用的大小。所有統(tǒng)計分析使用SAS 9.1軟件完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及臨床特征

患者組平均年齡（69.1±7.9）歲，其中≤69歲者占51.0%。對照組平均年齡（68.7±9.0）歲，其中≤69歲者占52.6%。患者組中有吸煙史者559例（61.0%），無吸煙史者358例（39%）?；颊呓M平均BMI為（24.9±2.8）kg/m2，其中超重者388例（42.3%）。對照組平均BMI為（24.2±3.1） kg/m2，其中超重者405例（39.1%）。兩組間平均年齡、年齡分布及吸煙情況等差異無統(tǒng)計學意義（P=0.32、0.23和0.74）。但患者組BMI顯著高于對照組（P＜0.001），將在進一步的多元Logistic分析進行調(diào)整?；颊呓M中Ⅰ/Ⅱ期占46.7%，Ⅲ/Ⅳ期占53.3%。Gleason評分≤7（3+4）者占34.0%，≥7（4+3）者占64.6%，評分不詳者占1.4%。

2.2 ADIPOQ rs266729和rs182052多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風險的關(guān)系

經(jīng)檢驗對照組中ADIPOQ rs266729和rs182052兩位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.29和0.83），表明本研究人群具有良好的群體代表性。

ADIPOQ rs266729和rs182052兩位點的基因型和等位基因頻率在患者組和正常對照組中的分布差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。對年齡、吸煙狀況及BMI校正后的非條件Logistic分析顯示，與野生型CC及GG基因型相比，兩位點的雜合型及突變型攜帶者患病風險差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在顯性遺傳效應(yīng)模型及隱形遺傳效應(yīng)模型下，差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表 1 ADIPOQ rs266729和rs182052基因型分布及其與前列腺癌發(fā)病風險的關(guān)系Tab. 1 Logistic regression analysis of associations between the ADIPOQ polymorphisms and prostate cancer risk［n (%)］

2.3 ADIPOQ rs266729和rs182052多態(tài)性與前列腺癌患者臨床特征的相關(guān)性分析

進一步按照患者的年齡、BMI、吸煙狀況、Gleason評分及臨床分期進行分層分析（表2）。結(jié)果顯示，在年齡≤69歲的人群中，ADIPOQ rs182052 AA基因型攜帶者的前列腺癌發(fā)病風險僅為AG或GG基因型攜帶者的73%（95%CI：0.54～0.99），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.04）。兩位點基因型分布差異與其他臨床特征之間無顯著相關(guān)性。

2.4 ADIPOQ rs266729和rs182052多態(tài)性與BMI的相關(guān)性分析

為了解前列腺癌患者肥胖程度與ADIPOQ基因多態(tài)性是否有關(guān)，我們比較了患者組中不同基因型攜帶者的BMI。結(jié)果顯示，rs182052各基因型攜帶者的BMI差異有統(tǒng)計學意義（P=0.03），GG型攜帶者的BMI顯著高于AA型或GG型攜帶者（表3）。

表 2 ADIPOQ rs266729和rs182052基因型與前列腺癌發(fā)病風險的分層分析Tab. 2 Stratification analysis for associations between the ADIPOQ polymorphisms and prostate cancer risk(n)

表 3 ADIPOQ rs266729和rs182052多態(tài)性與BMI的相關(guān)性Tab. 3 ADIPOQ polymorphisms and BMI among cases

3 討論

在全球范圍內(nèi)，亞洲男性前列腺癌的發(fā)病率和死亡率最低，但研究顯示，在過去的20年中絕大部分亞洲國家的發(fā)病率快速上升［5］。此外，前列腺癌發(fā)病率在美國本土居民和亞洲移民之間差異的縮小，反映了環(huán)境危險因素對亞洲移民的潛在影響［6］。環(huán)境因素在前列腺癌發(fā)病機制中的作用，尤其是高脂肪攝入飲食、缺乏體力活動等引起的肥胖逐漸受到重視。前列腺癌與肥胖之間關(guān)系的潛在分子機制多種多樣且涉及多個層面。其中脂聯(lián)素等脂肪因子不同程度地參與調(diào)節(jié)細胞的分化、凋亡、增殖和血管生成，既可通過自分泌和（或）旁分泌方式在局部發(fā)揮作用，也可通過進入外周循環(huán)來激活靶細胞受體的內(nèi)分泌方式作用于全身發(fā)揮生物學效應(yīng)，尤其是前列腺癌突破包膜和發(fā)生淋巴結(jié)浸潤后，腫瘤細胞暴露于高濃度的增殖因子中，增強其進一步生長和轉(zhuǎn)移的能力［7］。作為外周血中含量最豐富的脂肪因子，脂聯(lián)素水平的降低不僅意味著總體脂肪含量增加，而且與脂肪分布相關(guān)，內(nèi)臟型肥胖者血漿脂聯(lián)素水平降低更為顯著［8］。我們前期的研究已經(jīng)證實內(nèi)臟型肥胖是高危前列腺癌發(fā)生的危險因素［9］。其潛在的生物學機制可能與脂聯(lián)素水平下降導致氧自由基的清除機制受到抑制有關(guān)，在肥胖者的前列腺組織中可以觀察到明顯的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)、失控的氧化應(yīng)激和氧化DNA損傷［1］。

由此我們推測ADIPOQ基因多態(tài)性可能通過影響脂聯(lián)素的表達水平，從而影響一般人群散發(fā)性前列腺癌的發(fā)病風險。事實上Kaklamani等［10］在高加索人群中評估了5個ADIPOQ潛在功能SNP與前列腺癌的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了包括rs266729在內(nèi)的4個SNP與發(fā)病風險相關(guān)。Dhillon等［11］研究發(fā)現(xiàn)，ADIPOQ基因SNP rs266729和rs182052不僅影響高加索人群的血漿脂聯(lián)素水平，同時與前列腺癌發(fā)病風險顯著相關(guān)。本研究在分層分析中發(fā)現(xiàn)rs182052 AA基因型在較低齡人群中會降低前列腺癌的發(fā)病風險，而在＞69歲的人群中則沒有這種保護作用。這可能是由于隨著年齡的增長，血漿脂聯(lián)素水平逐漸下降而造成的。

本研究未觀察到rs266729和rs182052的遺傳變異與中國漢族人群總體前列腺癌發(fā)病風險的相關(guān)性。與我們的結(jié)果相似，在一項非洲裔美國男性［12］和另一項芬蘭男性［13］的研究中，均未發(fā)現(xiàn)rs266729和rs182052與前列腺癌發(fā)病風險有關(guān)。這表明研究結(jié)果之間的差異可能由遺傳背景及地區(qū)不同造成。例如在Dhillon等［11］的高加索研究人群中，ADIPOQ基因rs182052的A等位基因頻率為0.32，而在我們的漢族研究人群中觀察到的頻率為0.47，兩者存在較大差異。并且Dhillon等［11］的患者組多數(shù)為局限性前列腺癌患者（83.9%），而我們的研究對象中進展期前列腺癌占多數(shù)（53.3%），這可能也是造成研究結(jié)果不同的原因之一。此外與我們的研究相比，Kaklamani等［10］的研究樣本量偏小、平均年齡更年輕可能也是造成結(jié)果不同的原因。

我們的研究也存在一定的局限性，文獻報道rs266729和rs182052位于ADIPOQ基因轉(zhuǎn)錄起始點上游，其多態(tài)性顯著降低啟動子活性進而影響脂聯(lián)素水平的表達［14］。但由于未能對研究對象的脂聯(lián)素水平及其基因表達水平進行檢測，因此在后續(xù)的功能研究中需要明確脂聯(lián)素基因多態(tài)性、脂聯(lián)素水平及前列腺癌發(fā)病風險之間的關(guān)聯(lián)。另外還需要對該基因上其他的標簽SNP進行檢測，以全面探討ADIPOQ基因多態(tài)性在前列腺癌發(fā)病機制中的作用。