兩種柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定醬腌菜中生物胺的比較

郭曉麗，李二虎，宋雅東，鐘武，王美玉，郭小，潘思軼

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）（2.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢 430012）

生物胺是一類含氨基的芳香族、脂肪族及雜環(huán)類的低分子有機(jī)化合物，廣泛存在于發(fā)酵和腐敗食品中，大多數(shù)生物胺是通過(guò)微生物分泌的氨基酸脫羧酶催化特定的氨基酸脫羧而形成，少數(shù)是通過(guò)醛或酮氨基化形成[1～3]。低濃度的生物胺是生物體內(nèi)不可缺少的生理活性物質(zhì)[2,4]，然而攝入高濃度的生物胺可損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)和腸道，引起頭疼、腹瀉及嘔吐等中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧黐5～7]。此外，腐胺和尸胺能抑制組胺和酪胺相關(guān)代謝酶的活性，而增加組胺和酪胺的毒性，尸胺、腐胺、亞精胺及精胺也易與亞硝酸鹽反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝基胺[8～11]。食品中的生物胺含量也可以作為食品的新鮮或腐敗程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]。因此，食品中生物胺的定量測(cè)定對(duì)于有效監(jiān)控食品的質(zhì)量安全起到重要作用。

醬腌菜是以新鮮蔬菜為主要原料，經(jīng)不同腌漬工藝制作而成的各種蔬菜制品的總稱[13]。按傳統(tǒng)分類方法醬腌菜可分為發(fā)酵型醬腌菜和非發(fā)酵型醬腌菜[14]。但這兩類蔬菜腌漬品在腌漬過(guò)程中都存在著不同程度的發(fā)酵，可生成高濃度的生物胺[15～17]。目前國(guó)內(nèi)外已有不少研究發(fā)現(xiàn)腌制蔬菜中存在高濃度的生物胺[16～20]。

目前食品中生物胺的檢測(cè)方法很多，如離子色譜法（IC）[21]、氣相-質(zhì)譜串聯(lián)色譜法（GC）[22]、薄層色譜法(TLC)[23]、毛細(xì)管電泳法(CSE)[24]、液相-質(zhì)譜串聯(lián)色譜法(LC-MS)[25]、高效液相色譜法（HPLC）等，其中HPLC因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而應(yīng)用最廣[26,27]。由于大多數(shù)生物胺是缺乏紫外或熒光發(fā)色基團(tuán)的極性分子，衍生化反應(yīng)是其進(jìn)行色譜分析的關(guān)鍵，衍生劑不僅可以標(biāo)示出生物胺分子的氨基基團(tuán)，還可以降低其極性而增大其在色譜柱中的分離效果，提高檢測(cè)的靈敏度[28]。丹磺酰氯（DNS-Cl）作為衍生劑能與單、多胺反應(yīng)，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于測(cè)定食品中的生物胺，但DNS-Cl衍生法存在試劑消耗大、耗時(shí)長(zhǎng)和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)[17～19]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[29,30]，4-氟-3-硝基-三氟甲苯（FNBT）作為衍生劑除能與單、多胺反應(yīng)，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定外，F(xiàn)NBT衍生法還具有高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。然而該方法存在試劑消耗大、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，限制了在食品中生物胺的高效準(zhǔn)確測(cè)定。而經(jīng)優(yōu)化建立的FNBT衍生法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，具有測(cè)定食品中生物胺的廣泛應(yīng)用前景[20]。但FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法測(cè)定生物胺比較的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本文在FNBT衍生法研究的基礎(chǔ)上[20,30]，分別用FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法測(cè)定醬腌菜中的8種生物胺（組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺、亞精胺及精胺），比較這兩種檢測(cè)方法的差異性，完善FNBT衍生法的不足，以期獲得更高效的醬腌菜中生物胺的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

組胺、酪胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺、色胺、精胺、亞精胺（純度98%以上），丹磺酰氯（DNS-Cl），純度為99%，美國(guó)Sigma公司；4-氟-3-硝基-三氟甲苯（FNBT），純度為99%，N,N-二異丙基乙胺（DIPEA），純度為99%，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、丙酮和甲醇為色譜純，德國(guó) Merck公司；H3BO3，Na2B4O7·10HO4，Na2CO3、NaOH、氨水和乙酸乙酯等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高效液相色譜儀 Dionex Ultimate 3000，戴安公司；Milli-Q超純水處理器，美國(guó)Millipore公司；3-18K型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)sigma公司；微型旋蝸混合儀器，滬西分析儀器廠；24孔可調(diào)式氮吹儀，上海泉島科貿(mào)有限公司；PHS-3E酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；恒溫震蕩水浴鍋。

1.2 材料

市售醬腌菜樣品，購(gòu)自于武漢市東西湖區(qū)超市。

1.3 實(shí)驗(yàn)部分

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)生物胺溶液：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（精確到0.001 g），用0.1 mol/L鹽酸溶解，并定容至100 mL得標(biāo)準(zhǔn)生物胺儲(chǔ)備液(1 mg/mL)。分別準(zhǔn)確移取8種生物按標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合均勻，再用0.1 mol/L鹽酸稀釋成終濃度分別為100、50、20、10、5、2、1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，4 ℃避光保存。

丹磺酰氯（DNS-Cl）衍生劑：稱取1 g DNS-Cl，加入100 mL丙酮配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，4 ℃冰箱貯藏。

4-氟-3-硝基三氟甲苯（FNBT）衍生劑：用甲醇稀釋20倍，室溫儲(chǔ)藏。

1.3.2 樣品提取

稱取攪碎的醬腌菜樣品5.0 g于50 mL的離心管中，加入20 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液超聲30 min，離心（6000 r/min，10 min，4 ℃），移取上清液，再加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL。

1.3.3 FNBT衍生法

1.3.3.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6×250 mm×5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙腈，流速為1.0 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3.3.2 FNBT衍生條件

在Tang[31]和Jastrz?bska[30]的研究方法上改進(jìn)，具體衍生過(guò)程參考[20]。

0.5 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液或樣品提取液，用H3BO3-Na2B4O7緩沖液調(diào)節(jié) pH 為 9.5，加入 1 mL FNBT（稀釋20倍）和20 μL DIPEA，置于60 ℃恒溫震蕩水浴鍋，30 min后取出加入20 μL HCL(2 mol/L)終止反應(yīng)，去除多余的 FNBT，混合均勻，靜置反應(yīng)5 min，用5 mL乙酸乙酯提取，離心（6000 r/min，10 min，4 ℃），收集上層有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并提取液，40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?.0 mL甲醇溶解殘留物，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.3.4 DNS-Cl衍生法

1.3.4.1 色譜條件

采用 Agilent TC-C18(色譜柱（4.6×250 mm×5 μm）)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙腈，流速為1.0 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.4.2 DNS-Cl衍生條件

在參考瞿鳳梅等人[19]的研究方法上稍作修改，0.5 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液或樣品提取液，加300 μL飽和 Na2HCO3溶液，200 μL NaOH 溶液(2 mol/L)，1 ml DNS-Cl(10 mg/L)，置于60 ℃恒溫震蕩水浴鍋（避光），30 min后取出加入200 μL氨水（1：1）終止反應(yīng)，暗室下靜置反應(yīng)30 min(避光)，用5 mL乙酸乙酯提取，離心（6000 r/min，10 min，4 ℃），收集上層有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并提取液，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，用l.0 mL甲醇溶解殘留物，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007和SPSS 21.0軟件對(duì)樣品中生物胺的兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并比較分析兩種檢測(cè)方法的差異性，重復(fù)6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺的色譜分離效果

圖1和圖2分別為FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法檢測(cè)生物胺的 HPLC色譜圖，生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖1（a）和圖2（a）。結(jié)果顯示：8種生物胺在30 min內(nèi)色譜峰完全分離，峰形對(duì)稱，雜質(zhì)干擾少。FNBT衍生法檢測(cè)8種生物胺的出峰順序依次為組胺，色胺，β-苯乙胺，腐胺，酪胺，尸胺，亞精胺，精胺。

圖1 FNBT柱前衍生RP-HPLC檢測(cè)生物胺的HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of biogenic amines by RP-HPLC with FNBT derivatization

圖2 DNS-Cl柱前衍生RP-HPLC檢測(cè)生物胺的HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC chromatograms of biogenic amines by RP-HPLC with DNS-Cl derivatization

DNS-Cl衍生法檢測(cè)8種生物胺的出峰順序依次為色胺，β-苯乙胺，腐胺，尸胺，組胺，酪胺，亞精胺，精胺。醬腌菜樣品中生物胺的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖1（b）和圖2（b）。

結(jié)果顯示：同一樣品，F(xiàn)NBT衍生法檢測(cè)到樣品中的8種生物胺，DNS-Cl衍生法只檢測(cè)到樣品中的7種生物胺，β-苯乙胺未被檢出。說(shuō)明FNBT衍生法對(duì)β-苯乙胺檢測(cè)的靈敏度更高。

注：1.色胺；2.β-苯乙胺；3.腐胺；4.尸胺；5.組胺；6.酪胺；7.亞精胺；8.精胺。

2.2 兩種方法的回歸方程和檢測(cè)限

由表3可知，F(xiàn)NBT和DNS-Cl衍生法檢測(cè)8種生物胺時(shí)，8種生物胺在質(zhì)量濃度為1.0～100 mg/L范圍內(nèi)具有顯著的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù) R2均大于0.999。樣品濾液衍生物用乙腈適當(dāng)稀釋，以信噪比(S/N)大于3和信噪比(S/N)大于10作為檢出限和定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見(jiàn)表3。8種生物胺的FNBT衍生法的檢出限（0.016～0.071 mg/L）和定量限（0.053～0.236 mg/L）比 DNS-Cl衍生法的檢出限（0.066～0.191 mg/L）和定量限（0.219～0.637 mg/L）低。說(shuō)明FNBT衍生法對(duì)8種生物胺檢測(cè)的靈敏度高于DNS-Cl衍生法。

表3 8種生物胺的回歸方程和檢測(cè)限Table 3 The regression equations and detection limits of eight biogenic amines

2.3 兩種方法的精密度和加標(biāo)回收率的比較

選擇空白醬腌菜樣品，添加4、15、25 mg/L三個(gè)水平質(zhì)量濃度，分別按DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法做加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定6次。DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法的加標(biāo)平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表4和表5所示。

FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法測(cè)定醬腌菜中8種生物胺的平均回收率分別為 92.87%～100.18%和83.52%～102.33%，其中FNBT衍生法測(cè)定精胺的準(zhǔn)確性（精胺的加標(biāo)平均回收率為93.87%）優(yōu)于DNS-Cl衍生法（精胺的加標(biāo)平均回收率為 83.52%），F(xiàn)NBT衍生法測(cè)定精胺的加標(biāo)回收率比DNS-Cl衍生法提高了10.35%。

兩種方法的精密度由 RSD表示，分別為0.78%～4.27%和0.41%～4.16%，RSD均小于5%，說(shuō)明兩種方法均符合醬腌菜中生物胺的定量要求。

2.4 兩種方法測(cè)定市售醬腌菜中生物胺種類和含量的比較

為了考察FNBT衍生法和DNS-Cl衍生法對(duì)實(shí)際樣品中生物胺含量檢測(cè)結(jié)果的差異性，分別用已建立并優(yōu)化的FNBT衍生法[20]和DNS-Cl衍生法，對(duì)采集的7個(gè)醬腌菜樣品的生物胺含量和種類進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 FNBT衍生法加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the recovery testes by FNBT derivative method(n=6)

表6 DNS-Cl衍生法和FNBT衍生法測(cè)定醬腌菜中生物胺的含量(mg/kg)Table 6 Contents of biogenic amines in pickled vegetable samples measured with FNBT and DNS-Cl derivative methods(mg/kg)

注：ND表示未檢出；表中同一種醬腌菜樣品中某一生物胺含量的不同字母代表這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異（p＜0.05）。

對(duì)相同樣品中同一生物胺FNBT和DNS-Cl衍生法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法均能滿足醬腌菜中8種生物胺的檢測(cè)，但這兩種方法檢測(cè)醬腌菜樣品中總生物胺的含量存在顯著差異（p＜0.05）。由樣品3，6可知，對(duì)于色胺含量較低的醬腌菜樣品FNBT衍生法能檢測(cè)出，而DNS-Cl衍生法未檢出，說(shuō)明FNBT衍生法對(duì)色胺檢測(cè)的靈敏度高于DNS-Cl衍生法。對(duì)7種醬腌菜樣品中精胺及樣品2、3、4、5醬腌菜樣品中β-苯乙胺、腐胺及酪胺的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果差異性不顯著。對(duì)相同醬腌菜樣品中組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺和亞精胺的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異（p＜0.05），F(xiàn)NBT衍生法檢測(cè)組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、亞精胺和精胺的含量均高于 DNS-Cl衍生法。說(shuō)明 FNBT衍生法較DNS-Cl衍生法衍生效果更好，F(xiàn)NBT衍生法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性更可靠。

3 結(jié)論

3.1 本文比較了FNBT和DNS-Cl衍生法這兩種方法的方法學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明：兩種方法均在30 min內(nèi)完成8種生物胺的良好分離，各生物胺衍生物線性關(guān)系良好，F(xiàn)NBT衍生法的檢出限（0.016～0.071 mg/L）優(yōu)于DNS-Cl衍生法（0.066～0.191 mg/L），F(xiàn)NBT衍生法的加標(biāo)平均回收率（92.87%～100.18%）略優(yōu)于DNS-Cl衍生法的加標(biāo)平均回收率（83.52%～102.33%），F(xiàn)NBT衍生法對(duì)8種生物胺檢測(cè)的靈敏度高于DNS-Cl衍生法。

3.2 利用FNBT和DNS-Cl衍生法測(cè)定了7種不同市售醬腌菜樣品中8種生物胺的含量，結(jié)果進(jìn)行配對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)于色胺含量較低的醬腌菜樣品FNBT衍生法能檢測(cè)出，而DNS-Cl衍生法未檢出。FNBT衍生法檢測(cè)組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亞精胺和精胺的含量均高于DNS-Cl衍生法。兩種方法檢測(cè)醬腌菜樣品中的 8種生物胺存在顯著差異（p＜0.05）。FNBT衍生法，衍生試劑消耗少、操作簡(jiǎn)便、快速、檢出限低及靈敏度高優(yōu)于DNS-Cl衍生法，具有測(cè)定食品中生物胺的廣泛應(yīng)用前景。