基于張仲景學(xué)術(shù)思想的炮附子4種炮制方法的比較研究＊

彭詩濤，張先靈，袁金鳳，張語凡，王 鑫，孫美玲，李 飛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488）

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx子根的加工品，其味辛、甘，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛之功效[1]。附子于6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、須根及泥沙，習(xí)稱“泥附子”。現(xiàn)行藥典[1]制備附子飲片時(shí)均有“泥附子洗凈，浸入食用膽巴的水溶液中數(shù)日”的產(chǎn)地加工程序。其目的是防止腐爛[2]。研究表明，附子在膽巴溶液中浸泡20天后，能達(dá)到防腐的效果，但膽巴含量（以氯化鈣計(jì)）達(dá)到25%～30%，而單、雙酯型生物堿均流失70%左右[3-4]。新烏頭堿、次烏頭堿在飲片中的適當(dāng)配比存在是保證附子“回陽救逆”及安全性的關(guān)鍵[5]，本課題組研究發(fā)現(xiàn)[6-8]：藥典炮附片中雙酯型生物堿已檢測不到，而無膽砂燙生附片中保留了一定量的雙酯型生物堿且符合藥典對炮附片毒性成分的限量要求，主要藥效成分單酯型生物堿較藥典炮附片高約4倍。該無膽炮制品具有良好的抗心衰、抗炎和鎮(zhèn)痛作用。

張仲景臨床應(yīng)用附子具有“生熟異用”的特點(diǎn)[9]，治療陽虛重癥時(shí)，急用生附子回陽救逆，因其大辛大熱，取其峻猛、效速而力大持久之性。但生附子過于燥烈而容易傷陰，炮附子性較緩，既可溫少陰腎經(jīng)、溫陽散寒止痛，以充實(shí)衛(wèi)陽助水液氣化，又可防劫陰之弊?！秱s病論》中使用附子的經(jīng)方超過三十方，其中炮用者居多。古代文獻(xiàn)記載，“凡用附子、烏頭、天雄，皆熱灰微炮令坼，勿過焦”[10]，我們對張仲景使用附子的腳注進(jìn)行分析，認(rèn)為其炮制對象為生附子，“炮”法的實(shí)質(zhì)是干熱，包裹后加熱是為了炮制過程中藥物受熱更為均勻。課題組前期研究的無膽砂燙生附片采用生附子直接干熱法炮制，省略了藥典炮附片的加膽巴液的浸泡環(huán)節(jié)，減少了成分流失，能夠達(dá)到低毒高效的目的，符合張仲景使用炮附子的理念，值得進(jìn)一步深入研究。鑒于化學(xué)成分是中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，故采集四川江油的鮮附子，用秉承張仲景學(xué)術(shù)思想的古代干熱、現(xiàn)代烘烤、清炒和砂燙4種炮制方法制備炮附子飲片，以“內(nèi)外皆黃”、“坼”作為外觀性狀標(biāo)準(zhǔn)，以麻舌感結(jié)合3種雙酯型生物堿含量、3種單酯型生物堿含量、7種水溶性生物堿含量以及操作簡便性為指標(biāo)，比較4種炮附子飲片和藥典炮附片的質(zhì)量，分析附子生、炮異用的科學(xué)內(nèi)涵，為傳承和發(fā)展創(chuàng)新張仲景特色炮制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

sartorius BSA224S萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；SMART SENSOR AR882+手持紅外測溫儀（廣州市恒高精藝科技發(fā)展有限公司）；CM-5分光測色計(jì)（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀（美國FTC公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀及工作站（美國安捷倫公司）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循環(huán)多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號分別為110799-201106、110720-201111、110798-201106、111795-201102、111796-201002、111794-201303）；鹽酸多巴胺、鳥苷、腺苷對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號分別為100070-201507、111977-201501、110879-200202），胞苷（購于上海源葉生物科技有限公司，供含量測定用，批號為B20073），尿苷、去甲豬毛菜堿、去甲烏藥堿（購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司，供含量測定用，批號分別為 16120622、16110721、16113021）。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純（德國Merck公司)；其余試劑均為分析純；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

生附片、炮附片（購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號為20160701、20160901）。江油附子藥材（購于四川江油），經(jīng)北京中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的干燥子根。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品的制備

取大鍋，在鍋內(nèi)以木柴生火燃燒至明火盡，分別取大小分檔的生附子個(gè)適量，掩埋在鍋內(nèi)熱火灰中，加熱至附子表面有裂隙、內(nèi)外皆黃，取出。制得古代干熱品（S1）。

經(jīng)預(yù)試，以炮附子飲片內(nèi)外皆黃，且表面出現(xiàn)裂隙為標(biāo)準(zhǔn)，確定下列3種炮制方法的工藝條件，分別制備炮附子飲片：160℃烘制得到現(xiàn)代烘烤品（S2）。120℃炒制得到清炒品（S3）。砂溫220-250℃燙制得到砂燙品（S4）。

將炮附片（S5）、生附片（S6）和以上各炮制品分別粉碎，過三號篩，備用。

2.2 炮制品的質(zhì)量檢測

2.2.1 CM-5分光測色計(jì)量化檢測顏色

為對比各飲片內(nèi)外顏色的一致性，采用CM-5分光測色計(jì)分別對其飲片和粉末進(jìn)行顏色測定。以生附片及其粉末作為標(biāo)樣，對炮附片和其他4種炮附子飲片進(jìn)行檢測，求得差值dL*、da*、db*即代表顏色粉末數(shù)據(jù)。dL*為明暗度差值，正向趨于亮，負(fù)向趨于暗；da*為黃藍(lán)色差值，正向趨于黃色，負(fù)向趨于藍(lán)色；db*為紅綠色差值，正向趨于紅色，負(fù)向趨于綠色。炮附子的性狀要求為“內(nèi)外皆黃”，故選擇表征黃色的da*為主要指標(biāo)。檢測結(jié)果表明，古代干熱法飲片和粉末da*差值為2.85，顏色相差較大；藥典法和其他3種方法飲片和粉末da*差值在0.54之內(nèi)，顏色較為接近，與主觀觀察結(jié)果一致。說明古代干熱法不易控制炮制程度，易致“外焦內(nèi)生”，其他4種方法僅清炒法飲片局部出現(xiàn)焦斑。藥典法、現(xiàn)代烘烤法和砂燙法所制得的飲片內(nèi)外皆黃，且顏色均勻。

2.2.2 TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀量化檢測質(zhì)地

為檢測各炮制品的酥脆程度，采用TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀，對各飲片進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，古代干熱品所需的剪切力最大，為153.3 N；清炒品次之，為150.5 N；藥典炮附片和其他2種方法剪切力相近，在64.6-72 N之間。表明古代干熱法和清炒法所制得的飲片質(zhì)地較為堅(jiān)硬，現(xiàn)代烘烤法、砂燙法和藥典法所制得的飲片質(zhì)地較為酥脆。主觀感受古代干熱法與清炒法所制得的飲片部分堅(jiān)硬，部分酥脆，質(zhì)地不均勻。藥典法、砂燙法與現(xiàn)代烘烤法所制得的飲片質(zhì)地均勻酥脆。

表1 生附片、炮附片和4種炮附子飲片中6種生物堿含量（n=3） %

2.2.3 3種雙酯型生物堿和3種單酯型生物堿的含量測定

按照2015版《中國藥典》附子項(xiàng)下檢查和含量測定的方法對生品、藥典法和4種炮制方法所得飲片中3種雙酯型和3種單酯型生物堿進(jìn)行檢測（表1）。

藥典規(guī)定：附片含3種雙酯型生物堿總量不得過0.020%，含3種單酯型生物堿總量不得少于0.010%。但未有炮附片的量化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。從表中可以看出，生附片中3種雙酯型生物堿總量為0.169 8%，藥典炮附片未檢出雙酯型生物堿，4種模擬炮附子中雙酯型生物堿含量較生品降低幅度達(dá)88.87%～93.46%，含量在0.011 1%～0.018 9%，均符合藥典附片含3種雙酯型生物堿總量不得過0.020%的要求。藥典炮附片中單酯型生物堿的總量為生附片含量的66.85%，4種模擬炮附子中單酯型生物堿總量為生品的3.6＞4.9倍。說明4種模擬炮附片均可達(dá)到減毒增效的炮制目的且優(yōu)于藥典炮附片。

2.2.4 7種水溶性生物堿的含量測定

2.2.4.1 對照品溶液的制備

取胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、鳥苷、腺苷、去甲烏藥堿對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含胞苷0.03 mg、鹽酸多巴胺0.04 mg、尿苷0.1 mg、去甲豬毛菜堿0.1 mg、鳥苷0.12 mg、腺苷0.22 mg、去甲烏藥堿0.134 mg的混合對照品溶液。

2.2.4.2 供試品溶液的制備

精密稱定60℃干燥40 min的飲片粉末2 g，加水50 mL，回流提取1.5 h，濾過，濾渣加50 ml水，再回流提取1.5 h，合并濾液，減壓濃縮至10 mL，加80%乙醇醇沉24 h，回收乙醇至無醇味，用水定容至5 mL，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，作供試品溶液。

2.2.4.3 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm 250 mm，5 μm)；流動相：0.1 mL·L-1NaH2PO4水溶液(A)-50%甲醇(B)，梯度程序：0-25 min，0-1%B；25-32 min，1%-9%B；32-75 min，9%-35%B；75-95 min，35%-65%B；95-110 min，65%-85%B。柱溫：30℃，流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：280 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.4.4 方法學(xué)考察

精密度精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、鳥苷、腺苷、去甲烏藥堿的峰面積RSD均＜3%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在制備后的0、2、4、8和12 h進(jìn)樣測定,記錄峰面積。計(jì)算胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、鳥苷、腺苷、去甲烏藥堿的峰面積RSD均＜3%，結(jié)果表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性按供試品制備方法平行制備6份供試液，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。計(jì)算胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、鳥苷、腺苷、去甲烏藥堿的峰面積RSD均＜3%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收率取供試品6份，每份1 g，精密稱定，分別加入含胞苷14.6 μg·mL-1、鹽酸多巴胺2.8 μg·mL-1、尿苷42.2 μg·mL-1、去甲豬毛菜堿 25.6 μg·mL-1、鳥苷37.6 μg·mL-1、腺 苷 227.8 μg·mL-1、去 甲 烏 藥 堿51.6 μg·mL-1的溶液2 ml，按照“2.2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試液，“2.2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，計(jì)算胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、鳥苷、腺苷、去甲烏藥堿平均回收率，結(jié)果均在95%～105%范圍內(nèi)，RSD均小于3.0%（表2）。

表2 線性范圍結(jié)果

表3 4種炮附子7種水溶性生物堿含量（n=3） %

2.2.4.4 炮制品檢測

精密量取7種對照品溶液和供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算各供試品溶液中胞苷、鹽酸多巴胺、尿苷、去甲豬毛菜堿、腺苷、鳥苷及去甲烏藥堿的含量。檢測生附片、藥典炮附片和其他4種炮附子中7種水溶性生物堿含量。結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7種水溶性生物堿總量：現(xiàn)代烘烤品＞生品＞古代干熱品＞砂燙品＞清炒品＞藥典炮附片，現(xiàn)代烘烤品含量較生品高，其他3種炮制品含量較生品低，推測其可能與炮制過程中溫度高低的影響不同有關(guān)。

2.3 炮附子飲片的綜合評分

對各指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評分，評分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照，將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再按各指標(biāo)的重要性給出權(quán)重系數(shù)。

賦值依據(jù)：

顏色（M1）：以肉眼觀察結(jié)合顏色量化測定結(jié)果，以飲片內(nèi)外皆黃、顏色均勻?yàn)榧?，總?0分。外焦內(nèi)生，顏色不均勻者分?jǐn)?shù)逐減。

質(zhì)地（M2）：以人體主觀感受結(jié)合質(zhì)地量化測定結(jié)果，以飲片片型完整、質(zhì)地均勻酥脆為佳，總分10分。片型不完整、質(zhì)地不均勻者分?jǐn)?shù)逐減。

表4 4種炮附子飲片各項(xiàng)指標(biāo)評分結(jié)果

雙酯型生物堿含量（M3）：以含量測定結(jié)果結(jié)合口嘗微有麻舌感為佳，總分10分。麻舌感強(qiáng)烈或無麻舌感者分?jǐn)?shù)逐減。

單酯型生物堿含量（M4）：為3種單酯型生物堿含量之和。

水溶性生物堿含量（M5）：為7種水溶性生物堿含量之和。

操作（M6）：以操作簡單，節(jié)省人力物力為佳，總分10分。操作繁瑣，生產(chǎn)成本高者分?jǐn)?shù)逐減。

根據(jù)各指標(biāo)對于飲片質(zhì)量的重要性，以權(quán)重系數(shù)顏色：質(zhì)地：3種雙酯型生物堿含量：3種單酯型生物堿含量：7種水溶性生物堿含量：操作簡便性=0.18∶0.18∶0.18∶0.18∶0.18∶0.1，分別計(jì)算綜合評分，總分計(jì)為 100分。評分結(jié)果見表4。

綜合評分=（M1/M1max）*18+（M2/M2max）*18+（M3/M3max）*18+（M4/M4max）*18+（M5/M5max）*18+（M6/M6max）*10

3 討論

顏色、質(zhì)地主觀判斷結(jié)果與色差儀、質(zhì)構(gòu)儀檢測結(jié)果一致，砂燙法和現(xiàn)代烘烤法可達(dá)到內(nèi)外皆黃、質(zhì)地酥脆的炮制要求。古代干熱法和清炒法炮制程度較難掌控，容易外焦內(nèi)生，且質(zhì)地部分堅(jiān)硬，部分酥脆，質(zhì)量不均一。

藥典炮附片雙酯型生物堿未檢出，單酯型生物堿含量較生品降低。而基于張仲景學(xué)術(shù)思想，模擬古代干熱法、現(xiàn)代烘烤法、清炒法和砂燙法所制備的炮附子飲片雙酯型生物堿含量較生品分別降低91.8%、88.9%、93.5%、90.5%，單酯型生物堿含量較生品分別增加297.2%、255.2%、368.0%、385.6%。說明4種模擬炮制品較炮附片均能達(dá)到減毒增效的目的。現(xiàn)代烘烤法、砂燙法炮制的炮附子飲片口嘗微有麻舌感，但古代干熱法和清炒法炮制的飲片口嘗無麻舌感，說明這兩種方法炮制程度較難掌控，容易炮制過度。7種水溶性生物堿的總量現(xiàn)代烘烤法較生附片增加41.8%，其它3種炮制品較生附片分別降低39.6%、52.7%、41.5%。推測可能與炮制過程中加熱溫度高低不同有關(guān)，其含量增加原因及與藥效有何關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

利用綜合評分法對4種方法所制得的飲片進(jìn)行評分，結(jié)果表明現(xiàn)代烘烤法與砂燙法明顯高于藥典法、清炒法和古代干熱法。現(xiàn)代烘烤法與砂燙法均能夠達(dá)到炮附子外觀性狀要求，其3種單酯型生物堿含量和7種水溶性生物堿含量均明顯高于藥典法炮附片，且炮制方法簡便易行，節(jié)省人力物力，無膽巴浸泡程序，飲片質(zhì)量較高?？蔀楸袕堉倬八枷肭冶阌诂F(xiàn)代操作的新型附子飲片的炮制方法的傳承提供依據(jù)。