運動與骨骼肌自噬研究進展

徐瑞曹友祥嚴翊謝敏豪

1北京體育大學運動人體科學學院（北京100084）

2國家體育總局運動醫(yī)學研究所（北京100061）

運動在有效提高心肺耐力水平和肌肉質(zhì)量、促進線粒體合成、提高胰島素敏感性等的同時，也會導致機體氧化應激增加和能量代謝失衡。自噬作為一種保守的細胞內(nèi)動態(tài)維穩(wěn)機制，在運動過程中促進分解代謝的同時也能夠清除受損細胞器和錯誤折疊蛋白質(zhì)。運動能夠通過多條信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控自噬活性，不同運動方式和條件下自噬活性變化不同。目前，有關運動調(diào)節(jié)自噬的研究多集中于運動后自噬活性的變化，并未結合能量代謝途徑/因子探討運動后自噬變化的具體機制。因此，本文在總結運動對自噬活性影響的基礎上進一步探討運動調(diào)控自噬的代謝途徑，以期為探究運動調(diào)控自噬的有效機制提供理論依據(jù)。

1 自噬

自噬是細胞通過形成自噬體降解破損細胞器及有害蛋白碎片的過程[1]，是細胞應對外界刺激時維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種機制[2]。在哺乳動物體內(nèi)，自噬啟動后，首先會形成自噬體膜，包裹待降解物后形成自噬體，繼而自噬體與溶酶體融合后降解[3]。自噬包含以下幾個步驟：自噬啟動、自噬體成核、自噬體膜擴張、選擇包裹底物、自噬體和溶酶體融合以及降解6個步驟。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有31種自噬相關基因（ATG）和蛋白（Atg）參與自噬的調(diào)控過程[4,5]。

ULK1/ATG1（哺乳動物稱ULK1，酵母中稱ATG1）激酶復合體由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ULK1、Atg13以及ATG17組成[6]，是調(diào)控自噬啟動的關鍵因子[7]，參與介導自噬前體（phagophore）的形成，誘導自噬的啟動[8]。ULK1激酶復合體能夠促進PI3K和ATG14形成復合物，并促進Beclin1從Bcl2-Beclin1復合體中解離出來，形成Beclin1復合體（Beclin1-PI3K-ATG14復合物），Beclin1復合體是參與自噬體核形成的關鍵因子[9]。游離于細胞質(zhì)中的無活性的微管相關輕鏈蛋白3（microtubule-associated protein 1-light chain 3，簡稱LC3）被ATG4切割后形成LC3Ⅰ，繼而在自噬體膜上通過ATG7被脂化形成LC3Ⅱ[10]。ATG12首先通過ATG7與ATG5共價結合形成ATG5-ATG12復合物，ATG5-ATG12復合物進一步與ATG16相結合，形成ATG5-ATG12-ATG16復合物，與LC3Ⅱ相結合最終形成ATG12-ATG5-ATG16-LC3Ⅱ復合物，與自噬體膜相結合后促進自噬體膜彎曲融合[11]，LC3Ⅱ和ATG5-ATG12-ATG16復合物表達量也決定自噬體的大小[12]。自噬體形成后，在LAMP2的作用下，自噬體與溶酶體相結合，形成“自噬-溶酶體”降解包裹物，降解產(chǎn)生的氨基酸等物質(zhì)參與機體再循環(huán)[13]。

在自噬發(fā)生過程中，LC3Ⅰ需要不斷脂化形成LC3Ⅱ，促進自噬體膜的形成，因此一般以LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化的比例作為判斷自噬活性的標志[14]。但有研究認為，LC3Ⅱ表達量升高并不完全代表自噬降解過程的發(fā)生[15]，自噬體與溶酶體結合的過程被抑制后，導致溶酶體降解自噬體的速率降低，也會出現(xiàn)LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例表達量上升[16,17]，而此時自噬體并沒有被完全降解，自噬通量沒有增加[18]。p62作為LC3包裹泛素化底物的紐帶，在自噬過程中不斷降解，建議在檢測自噬的時候?qū)62，LC3轉(zhuǎn)換率以及其他自噬相關蛋白結合判斷。

2 運動對骨骼肌自噬的影響

目前關于運動對骨骼肌自噬活性影響的研究較多，但結論尚不一致。分析其可能原因，包括：運動干預方式差異；運動后取材時間的差異；組織間差異；運動干預前實驗對象的營養(yǎng)水平差異；運動干預周期差異等。

2.1 一次性運動對骨骼肌自噬的影響

Kim等[19]發(fā)現(xiàn)小鼠進行一次性50 min的跑臺訓練（v=12.3 m/min）后，LC3Ⅱ、Beclin1、Atg7、AMP2表達量下降，自噬活性降低；而一次性90 min訓練（55%VO2max）后，LC3Ⅱ表達量顯著升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有升高趨勢[16]。造成以上研究結果差異的原因可能是由于運動強度和時間不同導致的能量消耗不同。Schwalm等[20]發(fā)現(xiàn)，一次性運動后，55%VO2max組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，p62不變；而70%VO2max組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高，p62表達顯著下降。分析其原因可能是由于低強度運動對細胞器損傷小，能量消耗較少，不能促進自噬過程的啟動，而在Kim等[19]的研究中，一次性中低強度運動后，雖然LC3Ⅱ表達水平下降，但促進蛋白質(zhì)降解的MuRF1蛋白的表達水平升高，可能是由于在能量消耗較小的條件下，機體為維持能量平衡對自噬活性降低的代償機制。

另外，運動后的不同采樣時間也會對自噬活性產(chǎn)生影響。He等人[21]發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺運動后，小鼠骨骼?。ü赏鈧?cè)肌、比目魚肌、脛骨前肌、趾長伸肌）、心肌LC3Ⅱ蛋白表達量在運動后15 min有下降趨勢，隨后在30min、50min、80min逐漸遞增，并在80 min達到穩(wěn)定；而p62表達在運動后即刻升高，30 min、1h逐漸降低，3h后又升高。另外，隨著運動后時間的推移，Bcl2-Beclin1復合物在運動后15 min表達量下降，30 min后幾乎檢測不到[22]。因此，運動后自噬活性變化具有時效性，在探討一次性運動后骨骼肌自噬的變化時應注意采樣時間。

運動前肌糖原水平也可能是影響自噬變化的因素之一[23,24]。運動前肌肉糖原濃度與自噬活化程度呈負相關。禁食24 h后小鼠比目魚肌、跖肌和腓腸肌中自噬體數(shù)量增多，而在此基礎上對小鼠進行一次性中等強度運動干預（12 m/min、2 h、坡度10°）后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低[25]，提示在禁食條件下運動會抑制小鼠的自噬活性。Moller等[26]在人體實驗中也發(fā)現(xiàn)，禁食36 h后以50%VO2max強度進行60 min的自行車運動干預后即刻股外側(cè)肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均出現(xiàn)顯著下降，運動后90 min有所上升，但仍顯著性低于運動前。自噬在清除受損蛋白的同時，還能夠促進分解代謝，在肌糖原缺失的條件下運動會抑制自噬活性可能是由于機體對于骨骼肌的保護，防止骨骼肌被過度降解。一次性運動對自噬相關因子的影響見表1。

表1 一次性運動影響骨骼肌自噬相關性因子的研究

KruseR等（2017）[30]成年男性股外側(cè)肌60 min跑臺訓練（70%VO2max）LC3Ⅱ、Beclin1、Atg7mRNA保持不變Atg7、p62、FOXO3蛋白表達量不變↓LC3Ⅱ蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P＜0.05）↑p-ULK1ser555（P＜0.05）↓p-ULK1ser757（P＞0.05）

2.2 長時間運動對骨骼肌自噬的影響

目前關于長時間運動對骨骼肌自噬影響的研究主要是觀察運動干預后基礎自噬和自噬通量的適應性變化，因此多在最后一次訓練24～48小時后取材[31,32]來觀察運動后自噬活性的變化。運動干預周期以及取材骨骼肌類型是決定長期運動對骨骼肌自噬影響的主要因素[33-36]。

Smuder等[33]對小鼠進行連續(xù)5天（30 m/min，60 min/天）的跑步運動干預后發(fā)現(xiàn)，大鼠比目魚肌中Beclin1、Atg12、Atg4、Atg7、LC3、Atg12-Atg5復合物、cathepsin L蛋白水平未發(fā)生變化。而Lira等人[34]在對小鼠進行4周的轉(zhuǎn)輪運動干預后發(fā)現(xiàn)，小鼠比目魚肌LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著升高，p62蛋白水平顯著降低，Beclin1、Bnip3和Atg7等蛋白表達水平也有上升趨勢，基礎自噬通量和自噬蛋白表達水平均顯著上升。Lira等[34]人還發(fā)現(xiàn)不同的肌纖維類型/組織對于自噬的刺激也會產(chǎn)生不同應答。4周運動干預后，比目魚肌和跖肌中自噬相關蛋白Atg6、Atg7，線粒體自噬蛋白Bnip3以及線粒體合成蛋白PGC1-α、Cox-4等均顯著升高，且比目魚肌中各項自噬相關蛋白均顯著高于跖肌。提示運動干預對慢肌纖維主導的肌肉的自噬活性有明顯促進作用。除了骨骼肌以外，運動對脂肪組織自噬活性的影響也存在組織間差異[34]。另外，長期耐力運動與抗阻運動均能夠提高大鼠和小鼠骨骼肌中自噬相關蛋白表達水平以及自噬通量[34,35]。8周的抗阻運動[36]和有氧運動[37]均能夠提高大鼠骨骼肌LC3Ⅱ、Beclin1和Atg7表達水平，但其中抗阻運動后大鼠骨骼肌自噬活性變化主要集中于趾深屈肌，而有氧運動后大鼠趾長伸肌自噬活性變化明顯。

雖然抗阻運動和有氧運動均能夠提高大鼠骨骼肌自噬活性，但是運動干預時間過長可能會導致骨骼肌出現(xiàn)適應性變化。Bayod等對大鼠進行36周中等強度運動干預后，大鼠骨骼肌、海馬體、心肌、肝臟組織中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例均未出現(xiàn)變化[39]。大鼠進行終身（10周齡購置至24月齡取材）轉(zhuǎn)輪運動后其骨骼肌中Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Atg7和Atg9的蛋白質(zhì)表達水平均未顯著變化。說明運動干預周期過長可能會導致心肌、骨骼肌、肝臟、海馬體等組織對運動刺激產(chǎn)生適應，自噬活性不再變化[38]。

表2 長期運動影響骨骼肌自噬相關因子的研究

除了正常的實驗對象以外，許多學者也圍繞特異性敲除相關基因的大鼠和小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)當能量代謝出現(xiàn)障礙時，機體自噬活性通常不會發(fā)生改變。長時間運動訓練不能改善存在自噬缺陷小鼠的運動能力[34]。He等[42]人也發(fā)現(xiàn)運動干預不能刺激Bcl2AAA小鼠的Bcl2磷酸化，進而抑制了Beclin1從Bcl2-Beclin1復合物中解離，因此經(jīng)過運動干預的Bcl2AAA小鼠的能量代謝水平和自噬活性均未發(fā)生改變。Grumati等[29]通過對比發(fā)現(xiàn)，運動能夠提高野生型小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，但會使Colo6a-/-小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，自噬活性下降。Vainshtein等[27]敲除小鼠PGC-1α基因后發(fā)現(xiàn)，運動干預不能對骨骼肌LC3Ⅱ與p62 mRNA表達水平產(chǎn)生影響。

雖然目前關于運動對自噬的影響主要集中于骨骼肌的研究，但也有研究發(fā)現(xiàn)，運動也能夠?qū)χ窘M織等其他組織的自噬活性產(chǎn)生影響。Tanaka等[41]對大鼠進行9周的跑臺運動干預后，大鼠皮下白色脂肪LC3Ⅱ、ATG7表達量顯著升高，說明運動干預能夠刺激大鼠白色脂肪組織自噬活性提高。其他研究也發(fā)現(xiàn)，運動能夠?qū)σ认?、肝臟、腦等非運動器官中的自噬活性產(chǎn)生影響[21,42-45]。但有關運動后非運動器官自噬活性的變化是由于運動直接刺激對應組織引起自噬活性變化？還是通過改變骨骼肌等運動器官自噬活性后，間接對其周圍組織產(chǎn)生影響？有待進一步研究。

3 運動影響骨骼肌自噬的可能機制

在運動過程中，機體對能量需求激增，能量需求大于供應，AMP/ATP比值升高，從而激活能量感應激酶——腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）[46]。因此，運動后機體首先出現(xiàn)AMPK大量增加。AMPK除了能夠激活細胞生物體中的分解代謝過程，抑制脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物生物合成以外[47]，也是自噬啟動過程的關鍵因子。

AMPK能夠通過促進ULK1在Ser555位點磷酸化激活自噬的啟動，也能通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)提高自噬的活性。mTOR是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能與其他配體相結合形成mTORC1和mTORC2，其中主要是mTORC1參與抑制自噬。AMPK能夠通過抑制mTORC1上Raptor亞基磷酸化來抑制mTORC1[48]，mTOR能夠促進ULK1Ser757位點磷酸化來抑制ULK1的表達，進而抑制自噬的啟動[26]。

mTORC1除了受到AMPK的抑制外，還受到胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）、細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphoninositide 3-kinase，PI3K）以及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等因子的調(diào)控。運動能夠通過抑制IGF/Akt/mTOR信號通路來調(diào)控自噬，IGF通過受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）激活Akt/mTOR信號通路，Akt在與生長因子結合后被募集到質(zhì)膜上，隨后被PDK1磷酸化激活[49]?；罨疉kt能促進TSC2磷酸化，抑制TSC1/TSC2異二聚體形成。TSC2作為GTP酶的激活蛋白，能夠通過抑制GTP酶的Rheb進而激活mTORC1[50-53]。除了IGF因子以外，PI3K也能夠通過作用于mTOR，形成PI3K/Akt/mTORC2信號通路控制FoxO轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化來調(diào)控自噬的變化[54]。進化上保守的FoxO家族轉(zhuǎn)錄因子是最早發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬的基因[54]，能夠刺激LC3、p62、BNIP3、cathepsin L、BNIP3等自噬相關因子轉(zhuǎn)錄[55-58]，運動刺激能夠激活FoxO的轉(zhuǎn)錄程序，進而增加自噬通量。另外，F(xiàn)oxO1乙酰化后能夠與ATG7特異性結合來促進自噬[59]。

運動除了能夠刺激能量代謝因子表達升高以外，也能夠增加線粒體呼吸及氧化還原反應的發(fā)生，促進NADH氧化成NAD+，使NAD+/NADH比例升高[60]，進而激活各種下游信號激酶以及應激反應物如SIRT1、FoxO家族轉(zhuǎn)錄因子等[61]。SIRT1的活化依賴NAD+[61]，通過NAD+與細胞能量狀態(tài)直接相連，SIRT1脫乙酰酶活性主要是由NAD+的水平所決定的[62]。另外，在運動過程中，AMP/ATP比值上升的同時NADH氧化成NAD+，AMPK也是通過改變細胞內(nèi)NAD+/NADH比例間接激活SIRT1脫乙酰酶的活性[61,62]，使SIRT1表達水平大量增加[63]。SIRT1活化后能夠刺激自噬相關因子Atg5、Atg7和LC3去乙酰化來激活自噬[64]。另外，SIRT1也能夠使FoXO3轉(zhuǎn)錄因子去乙?；源龠MBnip3、ATG4、Beclin1、ATG12等自噬因子的轉(zhuǎn)錄[65]。因此，在運動過程中細胞能量代謝主要通過NAD+/NADH比例的變化對自噬過程產(chǎn)生影響。

由運動導致的細胞內(nèi)外離子變化也能夠通過其下游的激酶影響自噬的發(fā)生。運動過程中Ca2+濃度大幅升高，促進下游的鈣調(diào)蛋白磷酸酶和鈣調(diào)蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，CaMK）活性增加[66]。CaMK能夠促進細胞轉(zhuǎn)錄因子TFEB表達量上升[67]。TFEB在自噬體形成過程中能夠促進Beclin1表達以及通過提高自噬體-溶酶體降解速率來促進細胞內(nèi)物質(zhì)回收利用[68]。CaMK還能夠促進PGC-1α磷酸化[69]，PGC-1α磷酸化后能夠刺激FoxO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)自噬相關基因的表達。而AMPK和p38MAPK也能夠促進PGC-1α的表達[70]。AMPK在激活PGC-1α的同時能夠促進PGC-1α轉(zhuǎn)錄[71]。p38MAPK能夠促進PGC-1α磷酸化[22]。

綜上，運動刺激自噬是復雜且多元的。自噬能夠被AMPK信號調(diào)節(jié)通路、IGF/Akt/mTOR信號調(diào)節(jié)通路、PI3K/Akt/mTORC2信號調(diào)節(jié)通路等運動誘導的多條能量代謝相關途徑調(diào)節(jié)，這些信號通路大部分最終匯集于AMPK和mTOR，主要通過調(diào)控ULK1磷酸化來調(diào)節(jié)自噬的啟動。同時，運動也能夠促進FoxO家族轉(zhuǎn)錄因子表達來增加自噬相關蛋白轉(zhuǎn)錄，進而促進自噬體的形成；運動后相關離子的變化也能夠促進自噬相關蛋白表達增加，NAD+和Ca2+在刺激自噬相關蛋白的同時，能夠促進FoxO轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)控自噬相關蛋白的變化。除此之外，肌肉通過自噬釋放的因子是另一條重要的探索途徑[72]。運動還有可能從其他能量代謝途徑/因子調(diào)控自噬，但還有待進一步研究。運動刺激誘導自噬的可能機制見圖1。

圖1 運動誘導自噬的可能機制

4 小結

4.1 目前研究中存在的問題

（1）總結以往的研究可以看出，耐力運動對骨骼肌自噬活性的作用更加明顯，且運動干預后以慢肌纖維為主導的骨骼肌中自噬活性變化更加明顯。但目前尚未深入探討運動干預后組織間自噬變化特異性差異的原因。

（2）運動干預后自噬過程中相關因子變化并未完全同步，目前研究一般以LC3Ⅱ表達量作為判斷自噬活性的標志物，但自噬體的過度累積也會導致LC3Ⅱ表達量上升，運動促進自噬啟動增加并不意味著基礎自噬和自噬通量增加，運動刺激自噬活性改變的具體機制還需進一步探究。

（3）運動能夠通過多條信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控自噬，但是通過促進自噬啟動因子表達增加，還是通過在自噬體形成過程中促進相關因子的表達來對自噬產(chǎn)生影響？目前尚未明確，有待進一步研究。

（4）當前研究結果顯示長期運動后基礎自噬水平能夠升高，其原因是由于運動促進信號轉(zhuǎn)導通路中的能量因子適應性增加，進而不斷激活自噬？還是由于運動后自噬相關因子表達水平適應性升高？結論尚未明確，還需進一步探討。

4.2 未來研究展望

綜上所述，關于運動和自噬的研究尚在起步階段，還需要進一步研究運動對自噬的激活機制以及長期運動下自噬適應性變化的原因。因此，未來的實驗研究中可從運動能量代謝途徑/因子變化的源頭來探究運動對自噬的影響，進一步為探討運動有益于健康提供重要依據(jù)。