運動對尼古丁戒斷大鼠學習與記憶能力的影響及機制

周躍輝周成林

1曲阜師范大學體育科學學院（山東曲阜273165）

2上海體育學院運動科學學院（上海200438）

尼古丁依賴即煙草依賴。它通過其特異性受體——煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs），像毒品一樣作用于多巴胺獎賞系統(tǒng)，產生強烈的成癮性，且具有明顯的戒斷癥狀[1]。戒斷癥狀的存在，是誘發(fā)尼古丁戒斷后居高不下的復吸率的重要原因，也是治療尼古丁依賴的最大障礙[2]。

尼古丁戒斷癥狀是指尼古丁依賴后戒斷所誘發(fā)的軀體、情感和認知障礙。其中，認知障礙是尼古丁戒斷的核心癥狀[2]。藥物成癮理論認為，反復性藥物濫用會導致大腦學習與記憶能力的病理性損傷，加重藥物濫用[3]。尼古丁成癮神經網絡學說也認為，從最初自主性使用尼古丁到強迫性濫用尼古丁，意味著前額葉皮層（Prefrontal Cortex，PFC）和海馬（Hippocampus，HIP）相關認知功能的受損[4]。研究也指出，緩解尼古丁戒斷個體的學習與記憶能力，可能是治療尼古丁依賴[2]、預防尼古丁戒斷癥狀[5]的有效途徑。由此可見，改善尼古丁戒斷個體的學習與記憶能力，則可能有效降低尼古丁依賴。然而，目前還沒有相關的治療措施或實驗研究，以改善尼古丁戒斷期學習記憶為作用靶點，有效降低尼古丁戒斷癥狀，預防復吸。

越來越多的證據也表明，運動能夠有效預防和治療多種認知功能衰退患者（如阿爾茨海默癥、腦中風和抑郁癥等）的學習與記憶能力損傷[6]。運動也能夠減輕酒精和毒品戒斷大鼠的學習與記憶損傷，降低藥物依賴[7-9]。Ussher等[10]研究人員在2000年至2014年期間不斷更新的系統(tǒng)評價數(shù)據庫顯示，運動干預（包括急性運動和長期運動）可以有效降低尼古丁依賴性，緩解學習與記憶障礙等戒斷癥狀。目前，很少有研究關注運動干預與尼古丁戒斷個體學習與記憶之間的關系。

神經影像學研究指出，運動強度是影響大腦認知和行為反應的重要因素[11]。不同強度的運動與大腦的喚醒水平之間存在著倒“U”型的效應關系[12]。因此，本研究建立大鼠尼古丁條件位置偏好模型，觀察不同強度運動干預對尼古丁戒斷大鼠學習與記憶能力的影響，并探討其可能分子機制，旨在為今后尼古丁依賴和戒斷的治療提供新的研究靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品

4周齡雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=40），購買于中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學動物實驗中心[SCXK（滬）2008-0016]。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，飼養(yǎng)籠內溫度為22.0±2℃，相對濕度為50%～60%，12 h明暗交替光照，遵循大鼠日夜生物節(jié)律。所有動物的行為學測試均安排在晚上20∶00之后。對實驗動物的處理，按照上海體育學院道德倫理委員會的要求和實驗動物使用許可制度進行。尼古丁酒石酸鹽購買于美國Sigma公司，用0.9%生理鹽水（pH 7.4～7.5）將其濃度稀釋為0.5 mg/ml，采用頸背部皮下注射，每千克體重注射1 ml體積液體的藥物。根據文獻[13]，尼古丁注射劑量為0.5 mg/kg。

1.2 實驗設計

雙因素混合實驗設計中，組間變量為組別（安靜組，大、中、小強度運動組），組內變量為不同時間點尼古丁條件位置偏好得分（前測、中測、后測），以及水迷宮訓練天數(shù)（1、2、3、4天）。自變量為不同運動強度運動干預，因變量為尼古丁條件位置偏好得分、逃避潛伏期。

單因素實驗設計中，自變量為不同運動強度運動干預，因變量為大鼠記憶能力、尼古丁受體α7 nAChRs蛋白表達水平。

1.3 實驗方法

1.3.1 利用條件位置偏好范式（conditioned place preference，CPP）建立大鼠關聯(lián)尼古丁獎賞記憶模型

CPP實驗裝置及軟件（TWWP-2）購自于中國醫(yī)學科學院藥物研究所。該裝置由3個箱體構成，其中兩側的箱體為條件化訓練箱（A箱和B箱），大小相同但底面紋理和側面燈光圖案不同，作為動物注射尼古丁或鹽水后區(qū)分箱體的依據；中間的小箱體為過渡箱，抽去其兩側擋板，大鼠可以在3個箱子內自由穿梭活動（圖1）。CPP程序分為前測期、條件化訓練期和測試期。其中，大鼠在注射尼古丁訓練箱（伴藥側）的停留時間減去注射生理鹽水訓練箱（非伴藥側）的停留時間，即為CPP得分值（秒），作為判斷大鼠是否形成條件化偏好的統(tǒng)計依據[13,14]。

圖1 條件位置偏好箱

前測期：抽去箱體中間擋板，記錄大鼠15 min內在各箱體內的停留時間，作為CPP得分的基礎值。剔除明顯偏好任何一箱大于540秒的大鼠。

條件化訓練期：大鼠進行連續(xù)8個周期的生理鹽水和尼古丁給藥交替訓練[15]。為了排除給藥順序和箱體環(huán)境差異的影響，尼古丁和生理鹽水注射采用平衡對抗設計，即一半大鼠放置A箱注射尼古丁（B箱注射生理鹽水），一半大鼠放置B箱給藥（A箱注射生理鹽水）。

測試期：抽去箱體擋板，大鼠自由穿梭箱體，觀察并記錄大鼠15 min內在兩個條件化箱的停留時間。大鼠條件化訓練后CPP得分減去前測CPP得分，作為CPP模型是否建立成功的判斷依據。大鼠運動后CPP得分（后測）減去運動前（測試期）CPP得分，作為運動影響CPP的判斷依據。

1.3.2 利用Morris水迷宮實驗評價尼古丁戒斷大鼠的學習與記憶能力

Morris水迷宮（morris water maze，MWM）實驗主要測評實驗動物在水迷宮中位置感和方向感相關的學習與記憶能力。MWM主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分。定位航行實驗包括連續(xù)4天尋找平臺的游泳學習，每天4次游泳學習。在每次尋找平臺的學習過程中，隨機把大鼠溫和地從任意一個象限放入水池，間隔30 min，再從第2個象限放入，依次放入4個象限。大鼠每次游泳學習尋找隱藏平臺的時間為60 s。一旦大鼠找到平臺，則讓其在平臺上停留30 s。如果大鼠在60 s內找不到平臺，則由實驗人員引導其到平臺，同樣讓大鼠在平臺上停留30 s。記錄大鼠的游泳距離、平均速度和尋找平臺所用時間（逃避潛伏期，escape latency）；空間探索實驗在定位航行實驗結束24小時后進行，測試期間撤去水中隱藏的平臺，讓大鼠在水池中自由游泳60 s，記錄大鼠的平均游泳速度、目標象限的游泳時間和距離，以及目標象限（平臺所在象限）的穿梭次數(shù)。

1.3.3 實驗動物分組和跑臺運動干預方案

建立大鼠尼古丁CPP模型后，所有大鼠隨機分為安靜組（sedentary group，SED）、小強度運動組（low-intensity exercise group，LE）、中等強度運動組（moderate-intensity exercise group，ME）和大強度運動組（high-intensity exercise group，HE）。

對中等運動強度的界定采用乳酸閾測評法[16,17]。在遞增運動負荷中，血乳酸濃度急劇上升的起始點，其所對應的跑臺速度約為40%～60%最大攝氧量[18]，即為中等運動強度。由于前期研究指出，尼古丁戒斷癥狀在第1周可達到峰值，能夠持續(xù)2～4周[19-21]。其中認知功能在尼古丁戒斷后第9天出現(xiàn)顯著變化[22]。同時，研究指出，連續(xù)10天的轉輪運動能夠顯著降低尼古丁的渴求度[23]。因此，為了更好地觀察尼古丁戒斷對認知功能的影響，以及與前人研究作比較，選擇運動干預持續(xù)總時間為10天，每天單次運動時間為30 min（不包括熱身和整理活動）。如圖2所示，CPP訓練和測試結束后，4組大鼠停止給藥，在接下來10天的戒斷期內，給予不同強度的運動干預。隨后，進行CPP和水迷宮測試，以及蛋白表達分析。

圖2 實驗流程

1.3.4 動物取材及樣本處理

所有動物在行為學測試結束24 h后麻醉處死，0.9%生理鹽水心尖灌注（去除腦組織血液），剝離大腦，冰上操作，迅速取出前額葉皮層和海馬組織，－80℃保存。

1.3.5 蛋白質免疫印跡法（Western Blotting，WB）檢測腦組織α 7 nAChRs蛋白表達水平

BCA試劑盒（碧云天）檢測腦組織總蛋白濃度，調整濃度為4 μg/μl。經SDS-PAGE凝膠電泳（5%濃縮膠，10%分離膠）、PVDF轉膜（恒流300 Am，100 min）、5%BD脫脂牛奶封閉（室溫，1 h）、α7 nAChRs一抗（兔多克隆抗體，1∶400，Abcam）4℃過夜、二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，1∶3000，Cell Signaling）室溫孵育1 h后，加ECL發(fā)光液（Millipore），天能Tanon 5200 Multi全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測目的蛋白和內參GAPDH的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析。重復測量方差分析評估不同實驗條件下CPP偏好值的差異、大鼠連續(xù)4天尋找平臺游泳時間（逃避潛伏期）和游泳速度的差異性；單因素方差分析評估不同實驗條件下大鼠的平均游泳速度、在目標象限的游泳時間、穿越目標象限的次數(shù)和在目標象限的游泳距離，以及安靜組和不同強度運動組之間大鼠腦組織α7 nAChRs受體的蛋白表達差異性。事后兩兩比較采用Bonferroni′s或Dunnett′s法檢驗。統(tǒng)計分析中將a水平設定為0.05作為顯著性水平。

2 結果

2.1 不同強度運動對大鼠尼古丁CPP的影響

4（組別：SED、LE、ME、HE）×3（CPP前測、中測和運動干預后測）的重復測量方差分析結果發(fā)現(xiàn)，測試時間主效應顯著，F(xiàn)（2，46）=411.351，P＜0.001，Partial η2=0.947。測試時間與組別的交互效應顯著，F(xiàn)（6，46）=8.620，P＜0.001，Partial η2=0.529。進一步簡單主效應分析結果顯示，4組的前測CPP得分之間不具有統(tǒng)計學差異性（P＞0.05），而4組的中測CPP得分均顯著高于其前測CPP得分（P＜0.001），表明建立了尼古丁誘導的CPP模型；運動干預后，雖然4組的后測CPP得分均顯著高于其前測CPP得分（P＜0.001），但僅有中等強度和高強度運動組的后測CPP得分顯著低于其中測CPP得分（中等強度組：P＜0.001；大強度運動組：P＜0.05），而安靜組和小強度運動組的后測CPP得分與其中測CPP得分之間不具有統(tǒng)計學差異性（P＞0.05）；4組的中測CPP得分之間不存在統(tǒng)計學差異性（P＞0.05），但中等強度和大強度運動組后測的CPP得分顯著低于安靜組后測CPP得分（中等強度組：P=0.005＜0.01；大強度運動組：P=0.046＜0.05）。此外，中等強度運動組的后測CPP得分也顯著低于小強度運動組的后測CPP得分（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同強度運動對尼古丁CPP的影響

以上結果表明，小強度運動干預后，大鼠尼古丁CPP得分沒有明顯變化。大強度和中等強度運動干預后，CPP得分均顯著降低，具體表現(xiàn)在：與安靜組后測CPP得分相比，大強度運動組后測CPP得分下降了約34.96%，中等強度運動組后測CPP得分下降了約46.50%；與小強度運動組后測CPP得分相比，大強度運動組后測CPP得分沒有明顯變化，中等強度運動組后測CPP得分下降了約40.87%；與其本身中測CPP得分相比，大強度運動組后測CPP得分下降了約25.85%，中等強度運動組后測CPP得分下降了約49.07%。這些結果提示，中等強度和大強度跑臺運動都可以顯著降低大鼠尼古丁CPP得分，而中等強度運動降低CPP得分的幅度更大。

2.2 不同強度運動對尼古丁戒斷大鼠學習與記憶能力的影響

在定位航行實驗中（圖4 A,B,C），4（組別：SED、LE、ME、HE）×4（訓練天數(shù)：第1天、第2天、第3天、第4天）的重復測量方差分析結果表明，測試時間主效應顯著，F(xiàn)（3，60）=14.887，P＜0.001，Partial η2=0.427。組別主效應顯著，F(xiàn)（3，20）=5.796，P=0.005＜0.01，Partial η2=0.465。事后兩兩比較發(fā)現(xiàn)，4組尼古丁戒斷大鼠在第2天、第3天和第4天的逃避潛伏期均顯著短于第1天（P＜0.05），第4天逃避潛伏期顯著短于第2天（P＜0.05）（圖4 B）。而且，在連續(xù)4天的定位航行實驗訓練過程中，僅有中等強度運動組大鼠的逃避潛伏期顯著短于安靜組大鼠（P＜0.01）；4組大鼠在連續(xù)4天的尋找平臺訓練中，平均游泳速度不具有統(tǒng)計學差異性（P＞0.05）（圖4 C）。

在空間探索實驗中（圖4 A、D、E、F），單因素方差分析結果顯示，4組大鼠在目標象限的游泳時間[F（3，20）=9.495，P＜0.001]、穿梭目標象限的次數(shù)[F（3，20）=3.875，P=0.025＜0.05]、在目標象限的游泳距離[F（3，20）=6.165，P=0.004＜0.01]存在統(tǒng)計學差異性，4組大鼠在目標象限的游泳速度不具有顯著差異性[F（3，20）=1.397，P=0.273＞0.05]。采用Bonferroni法進行事后兩兩比較結果顯示，ME和HE組大鼠在目標象限的游泳時間顯著長于SED組大鼠（P＜0.01），ME和HE組大鼠在目標象限的游泳時間之間不存在統(tǒng)計學差異性（P＞0.05）（圖4 D）；ME和HE組大鼠在目標象限的游泳距離顯著長于安靜組（分別P=0.005＜0.01和P=0.019＜0.05），ME和HE組大鼠在目標象限的游泳距離不存在統(tǒng)計學差異性（P＞0.05）（圖4 E）；僅有ME組大鼠穿梭目標象限的次數(shù)顯著多于SED組大鼠（P=0.041＜0.05）（圖4 F）。

圖4 不同強度運動對尼古丁戒斷大鼠水迷宮成績的影響

以上結果說明，隨著大鼠定位航行實驗訓練時間的延長，其尋找平臺的游泳時間逐漸縮短，而游泳速度保持不變。其中，中等強度運動組大鼠尋找平臺的游泳時間顯著短于安靜組。在撤去平臺后，中等強度和大強度運動組大鼠在目標象限中的游泳時間和距離，均顯著大于安靜組，但僅有中等強度運動組大鼠穿梭目標象限的次數(shù)顯著多于安靜組。

2.3 不同強度運動對尼古丁戒斷大鼠腦組織α 7 nAChRs蛋白表達的影響

單因素方差分析結果顯示，對尼古丁戒斷大鼠運動干預后，其海馬組織α7 nAChRs相對于內參GAPDH的蛋白表達量不存在組間差異性[F（3，23）=0.410，P=0.747＞0.05]，但前額葉皮層α7 nAChRs相對于內參GAPDH的蛋白表達量存在組間差異性[F（3，23）=8.903，P＜0.001]。Bonferroni法進行事后兩兩比較，結果發(fā)現(xiàn)，僅ME組大鼠前額葉皮層α7 nAChRs蛋白相對表達量與SED、LE組大鼠之間存在顯著差異性（P＜0.01）（圖5）。

以上結果表明，中等強度跑臺運動能夠特異性增加尼古丁戒斷大鼠前額葉皮層α7 nAChRs蛋白表達水平，而對海馬組織α7 nAChRs蛋白表達水平無顯著影響。

圖5 不同強度運動對尼古丁戒斷大鼠腦組織α7 nAChRs蛋白表達水平的影響

3 討論

3.1 中等強度和大強度運動降低尼古丁CPP

本研究采用被動跑臺運動方式，通過乳酸閾間接測量了中等運動強度區(qū)間，并以此作為大鼠在戒斷期運動大、中、小強度劃分的依據。結果發(fā)現(xiàn)，10天的中等和大強度運動干預雖然沒能抑制大鼠尼古丁CPP的形成，但降低了CPP得分，說明這兩種強度的運動都可以有效消退大鼠尼古丁CPP的形成。然而，與大強度運動相比，中等強度運動降低尼古丁CPP得分的幅度更大（34.96%vs 46.50%），提示中等強度運動能更有效消除尼古丁的獎賞記憶。

關于不同運動強度與尼古丁獎賞之間的關系研究主要集中在人體實驗中，例如，除了低強度運動（＜20%心率儲備）之外，較低強度運動（20%～40%心率儲備）、中等強度運動（40%～59%心率儲備）和大強度運動（60%～84%心率儲備）均降低了尼古丁獎賞性，但僅有中等強度運動減少了戒斷癥狀，改善了焦慮情緒，促進積極情緒的產生，以及延長了兩次吸煙之間的間隔時間[24-27]。Bailey等[28]發(fā)現(xiàn)，20 min的中等強度運動（65%最大心率）和劇烈運動（80%最大心率）在運動即刻和運動后10 min，均有助于降低美沙酮維持治療者的尼古丁依賴，但僅有劇烈運動減少了阿片渴求。這說明運動降低尼古丁和毒品渴求的效果存在著強度特異性。一項關于不同強度跑臺運動與可卡因依賴性關系的動物研究指出，戒斷期的大強度（10 m/min，2 h/天）和中等強度（10 m/min，1 h/天）跑臺運動均可有效減弱線索誘導的大鼠可卡因SA（self-administration）復吸行為（分別降低21%和26%），但大強度運動卻增加了可卡因誘導的SA復吸行為[29]。從另一角度來說，美國運動醫(yī)學會（ACSM）推薦中等強度運動產生的綜合效益更大，更容易堅持，給機體帶來的運動損傷風險也是最小的[18]。因此，中等強度跑臺運動可能能夠更有效降低戒斷期大鼠對尼古丁的獎賞性。

3.2 中等強度運動提高尼古丁戒斷大鼠的學習與記憶能力

本研究發(fā)現(xiàn)，大強度運動可以顯著提高尼古丁戒斷大鼠的記憶能力。但是，中等強度運動不僅能夠改善尼古丁戒斷大鼠學習能力，也能顯著提高大鼠的記憶能力。這提示大強度和中等強度運動可能通過改善尼古丁戒斷大鼠與藥物濫用相關的學習與記憶能力，降低尼古丁依賴性。

在運動與藥物依賴個體的認知關系研究中，運動能夠改善產前和產后酒精暴露大鼠海馬依賴的學習與記憶損傷[7,30]，緩解神經興奮劑哌甲酯誘導的大鼠空間學習與記憶能力損傷[31]。運動對嗎啡等毒品誘導的認知損傷也具有一定的改善作用[8]。然而，運動能否緩解尼古丁戒斷大鼠學習與記憶能力的損傷，尤其何種強度的運動效果最佳，都不明確。僅有個別臨床研究指出，運動能夠降低尼古丁誘導的前額葉、海馬、杏仁核、眶額葉和伏隔核等腦區(qū)的激活程度[32,33]，提示運動可能參與尼古丁戒斷個體的學習與記憶能力的調控以及尼古丁獎賞過程。Motaghinejad等[34]的動物研究指出，大鼠經過15天的尼古丁注射后（6 mg/kg/day，s.c.），戒斷期15天的被動跑臺運動或運動聯(lián)合抗焦慮抗、抑郁藥物Bupropion均能顯著緩解尼古丁戒斷所致的學習與記憶能力損傷（MWM實驗）。與Motaghinejad研究不同的是，本研究通過尼古丁CPP模型發(fā)現(xiàn)，運動可以有效緩解尼古丁戒斷大鼠的學習與記憶損傷，并且中等強度運動的效果更好。關于不同強度運動與認知功能之間的關系，有研究指出，與大強度和小強度運動相比，中等強度跑臺運動能更有效地提高嚙齒類動物在水迷宮測試中的學習與記憶能力[35-37]?？赡茉蚴牵翰煌瑥姸扰芘_運動對學習與記憶能力的影響，與海馬神經發(fā)生及其相關信號分子之間存在倒“U”型曲線關系，其中大多數(shù)研究指出，中等強度運動更能促進這些信號分子通路的傳遞，進而提高認知水；相反，大強度運動或力竭運動往往誘發(fā)應激反應，導致中樞神經系統(tǒng)氧化應激加重，損害認知功能[38-41]。Inoue等[36]的研究認為，大強度跑臺運動對大鼠學習與記憶能力無影響。然而，與以上研究結果不一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)，大強度運動對尼古丁戒斷大鼠學習能力無影響，但能夠改善其記憶能力。中等強度運動可以顯著改善尼古丁戒斷大鼠的學習與記憶能力。產生這種差別可能是由于本研究采用的運動強度依據是乳酸閾（LT，18 m/min），中等強度定義為乳酸閾強度（100%LT），大強度定義為133%LT，小強度定義為67%LT。而Inoue等人采用的大鼠中等運動強度是75%LT（乳酸閾強度為20 m/min[42]），大強度定義為200%LT[36]。并且，本實驗對象為尼古丁依賴青年SD大鼠，Inoue等人的實驗動物為老年Wistar大鼠。

3.3 中等強度運動特異性上調尼古丁戒斷大鼠前額葉皮層α 7 nAChRs蛋白表達

尼古丁戒斷個體的認知障礙受尼古丁受體的分子調控[43]。本研究以青年雄性大鼠為研究對象（青年、雄性大鼠更易建立尼古丁CPP）[15]，選擇在大鼠尼古丁CPP戒斷期進行10天的小、中、大3種強度的跑臺運動干預，結果發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，運動組大鼠海馬組織α 7受體表達水平沒有發(fā)生改變，而中等強度運動組前額葉皮層α7受體水平明顯上調，這說明尼古丁戒斷期的中等強度運動干預在一定程度上選擇性地提高了大鼠前額葉皮層α7 nAChRs的表達。這些結果提示前額葉皮層α7 nAChRs可能參與了尼古丁戒斷大鼠認知能力受損過程，同時也表明戒斷期的運動干預可能通過增加前額葉α7 nAChRs表達，促進大鼠學習記憶能力和情感障礙的恢復或改善過程。

關于運動與尼古丁受體表達之間的關系，目前研究報道較少。最近研究指出，10天被動跑臺運動能夠通過特異性上調前額葉皮層α7 nAChRs蛋白表達，增強尼古丁戒斷大鼠的反應抑制能力，促進大鼠尼古丁CPP的消退[17]。因此，α7 nAChRs可能在運動減少尼古丁戒斷癥狀中具有重要作用。關于該受體是否真正參與運動促進尼古丁依賴的戒斷，仍需要進一步研究。

4 結論

10天中等強度跑臺運動能夠顯著改善尼古丁戒斷大鼠的學習與記憶能力，促進尼古丁獎賞記憶的消退。中等強度運動的干預效果可能與其特異性上調前額葉皮層α7 nAChRs信號轉導有關。