褪黑素減輕心肌缺血再灌注損傷的新機制

張 彬，翟蒙恩，李凱峰，李步瀠，劉振華，陳正希，江麗青，梁宏亮，段維勛，金振曉，俞世強

隨著發(fā)病率逐年攀升，缺血性心臟病嚴重威脅著人類健康［1］，主因冠脈血流供應減少，導致心肌細胞營養(yǎng)物質供應不足，影響心臟正常的能量代謝。目前，隨著急診溶栓、急診冠脈介入治療和冠狀動脈旁路移植手術等缺血再灌注技術的廣泛應用，部分急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者能得到及時的再灌注治療。然而，在恢復血流供應后，缺血心肌組織損傷在某些情況下反而進一步加重，導致大量心肌細胞死亡，嚴重影響心臟功能及其預后，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷（my?ocardial ischemia reperfusion injury， MI／RI）［2－3］。 深入研究MI／RI發(fā)病機理，探索保護心肌的新靶點及藥物是目前心血管保護領域亟待解決的問題。

褪黑素（Melatonin，Mel）是一種由松果體分泌的吲哚類激素，具有改善睡眠、抗免疫、抗衰老和抗腫瘤等廣泛的生物學效應［4］。許多研究證實，褪黑素在高血壓、動脈粥樣硬化、MI／RI、心肌肥厚等多種心血管疾病中發(fā)揮重要的保護作用［5］。同時，有研究報道衰老標記蛋白30（senescence marker pro?tein－30，SMP30）作為一種新型鈣結合蛋白，參與調節(jié)體內細胞增殖及多種生理代謝過程，近年來也發(fā)現(xiàn)其在抗氧化應激、抗炎、抗凋亡等細胞保護作用中扮演重要角色［6－7］，但其是否介導 Mel抗 MI／RI 尚不清楚。為此，本研究采用H9c2細胞模擬缺血再灌注（simulated ischemia reperfusion，SIR）損傷模型，深入探究Mel減輕MI／RI新機制，為今后Mel用于缺血性心肌病及其并發(fā)癥的治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎。

1 主要材料和實驗方法

1．1 細胞株及主要試劑 H9c2細胞（ScienCell公司，美國）；Mel，超氧化物陰離子熒光探針（二氫乙錠，dihydroethidium，DHE）（Sigma－Aldrich公司，美國）；鈣離子熒光探針（Fluo－4 AM）（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所）；CCK－8細胞毒性檢測試劑盒（上海七海復泰生物科技有限公司）；anti－SMP30 和 anti－gp91phox抗體（Santa Cruz公司，美國）；anti－Bcl2、anti－Bax、anti－cleaved caspase 3 抗體（Cell Signaling公司，美國）；anti－β－actin 抗體（CMCTAG公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠和驢抗羊IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1．2 主要實驗儀器 滅菌型CO2細胞培養(yǎng)箱（Ther?mo）；激光掃描共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡（Olym?pus）；高速低溫離心機（Eppendorf）；Western blot電泳、轉膜及凝膠成像設備（Bio－Rad）；酶標儀（Spec?traMax）。

1．3 H9c2細胞培養(yǎng)及SIR模型的建立 H9c2培養(yǎng)用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。SIR通過使用缺血液培養(yǎng)實現(xiàn)：待各組細胞貼壁并生長到一定密度后，棄掉培養(yǎng)液，加入缺血液（含 CaCl2·2H2O 0．9 mmol／L、MgCl20．49 mmol／L、NaCl 137 mmol／L、KCl 12 mmol／L、4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 4 mmol／L、脫氧葡萄糖 10 mmol／L、連二亞硫酸鈉 0．75 mmol／L、乳酸鈉 20 mmol／L，pH 值調至 6．5）避光置于 37℃，5%CO2的孵箱內培養(yǎng)45 min，模擬缺血過程結束后更換正常培養(yǎng)液在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h完成再灌注。

1．4 SMP30 siRNA 的轉染 將 H9c2 細胞按 1．0×106／孔接種于6孔板上，貼壁生長24 h，待細胞密度達50%融合時進行轉染。轉染操作按lipofectamine 3000試劑說明書進行。轉染前4 h吸凈含血清的普通培養(yǎng)液，換成2 ml不含血清的細胞培養(yǎng)基（dulbec?co＇s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液。 轉染結束后繼續(xù)進行相應給藥及SIR處理。實驗分組如下：①Con：對照組；②SIR組；③Mel＋SIR組：藥物預處理加SIR損傷組；④siSMP30＋Mel＋SIR組：抑制SMP30表達后，再進行藥物處理及SIR組；⑤ siSMP30＋SIR組：單純抑制SMP30表達后，進行SIR損傷組。

1．5 DHE熒光探針檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 待各組細胞處理結束后，吸凈培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3 次，加入含有 DHE 染液（5 μmol／L）的無血清培養(yǎng)液避光在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，進行熒光探針裝載，隨后用無血清的培養(yǎng)液洗滌細胞3次，立即用酶標儀檢測各孔外直徑（outside diameter，OD）值（535 nm波長下吸光度值）指示細胞內ROS含量。

1．6 Fluo－4 AM 熒光探針檢測胞內 Ca2＋濃度 Ca2＋熒光探針Fluo－4 AM負載細胞時需用無Ca2＋培養(yǎng)液（NaCl 135 mmol／L、KCl 2 mmol／L、MgCl22 mmol／L、HEPES 10 mmol／L、葡萄糖 4 g／L）稀釋成工作濃度5 μmol／L。 待各組細胞處理結束后，吸凈培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，向細胞中加入Fluo－4 AM工作液，避光37℃孵育30 min。棄去熒光探針，更換新的無Ca2＋培養(yǎng)液，避光37℃繼續(xù)孵育30 min。以酶標儀檢測各孔 OD值（Ex／Em：494／506 nm 波長下吸光度值）指示細胞內Ca2＋濃度。

1．7 細胞活力檢測 將H9c2細胞接種在96孔板上，待各組細胞處理結束后，向每孔內加入10 μl的CCK－8反應液，避光在培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測各孔OD值（450 nm波長下吸光度值）指示細胞活力。

1．8 Western blot檢測細胞相關蛋白表達水平 收集處理結束后的各組細胞，加入裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物，置于冰上充分裂解，并對細胞裂解上清進行蛋白定量。各組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylam?ide gel electrophoresis， SDS－PAGE）分離，并用濕轉法轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別孵育在 SMP30（1 ∶500）、gp91phox（1 ∶500）、β 細胞淋巴瘤／白血病基因 2（B－cell lymphoma， Bcl2）（1 ∶1 000）、Bcl2相關 X 蛋白（Bcl2－Associated X，Bax）（1 ∶1 000）、裂解半胱天冬酶 3（cleaved caspase 3）（1 ∶1 000）、β－肌動蛋白（β－actin）（1 ∶4 000）抗體中4℃過夜。洗膜緩沖液（tris Buffered saline with tween，TBST）洗脫3次，加入對應辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠和驢抗羊IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗脫3次，通過Bio－Rad照相系統(tǒng)采集照片，用ImageLab軟件對其進行分析，以β－actin作為內參，分別檢測各蛋白表達情況。

1．9 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13．0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），若總體差異顯著，再以t檢驗分析相應兩組間的顯著性差異。以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 Mel呈劑量依賴性的減輕H9c2細胞SIR損傷

與Con組相比，SIR處理后H9c2細胞的存活率顯著降低（P＜0．05）；Mel預處理可提高 SIR損傷后H9c2細胞的存活率，其中 Mel濃度為 100 μmol／L作用效果最明顯（P＜0．05）。同時，與Con組相比，SIR損傷顯著上調了凋亡蛋白cleaved caspase 3和氧化應激標志蛋白 gp91phox的表達（P＜0．05）；Mel預處理可抑制SIR損傷后H9c2細胞凋亡蛋白cleaved caspase 3和氧化應激標志蛋白gp91phox的表達，其中Mel濃度為100 μmol／L時作用效果最明顯（P＜0．05），后續(xù)實驗均采取此濃度進行藥物預處理。見圖1A～D。

2．2 Mel可顯著增強SIR損傷后SMP30蛋白的表達，減輕細胞鈣超載 首先筆者檢驗了siRNA的干擾效率，發(fā)現(xiàn) SMP30 siRNA可以顯著降低細胞SMP30蛋白的表達，但對細胞凋亡通路無明顯影響，除外了siRNA本身對細胞的影響（圖2A～C）。與Con組相比，SIR損傷后H9c2細胞SMP30蛋白表達量顯著降低，細胞內Ca2＋濃度顯著升高，經(jīng)Mel預處理可呈劑量依賴性的提高SMP30的表達量，降低 Ca2＋濃度，且 Mel濃度為 100 μmol／L 時作用效果最明顯（P＜0．05）；免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn) Mel預處理可顯著提高SMP30的表達，用SMP30 siRNA抑制SMP30分子的表達后，可逆轉Mel的上述作用（P＜0．05）。 見圖 1E～F；圖 2D～G。

圖1 不同濃度Mel（μmol／L）對SIR損傷后細胞的保護作用及胞內Ca2＋濃度及SMP30表達量的影響

圖2 SMP30 siRNA抑制SMP30表達后對細胞內Ca2＋濃度及SMP30表達量的影響

2．3 SMP30介導Mel抗凋亡作用減輕H9c2細胞SIR損傷 抑制SMP30蛋白表達后發(fā)現(xiàn)，與Mel＋SIR組相比，siSMP30＋Mel＋SIR組細胞皺縮明顯增多，脫落增加，細胞活力明顯下降；同時細胞抗凋亡蛋白Bcl2表達顯著下降，凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3表達顯著增加（P＜0．05）。與SIR組相比，siSMP30＋SIR 組細胞形態(tài)和 Bcl2、Bax、cleaved caspase 3蛋白表達無明顯變化（P＞0．05）。見圖3。

2．4 SMP30介導Mel抗氧化應激作用減輕H9c2細胞SIR損傷 抑制SMP30蛋白表達后發(fā)現(xiàn)，與Mel＋SIR組比，siSMP30＋Mel＋SIR組細胞中SOD活性顯著降低，MDA含量、ROS生成量及gp91phox表達量均顯著增加（P＜0．05）。 與 SIR 組比，siSMP30＋SIR 組對H9c2細胞中MDA含量、SOD活性、ROS生成量、gp91phox表達量均沒有顯著影響（P＞0．05）。 見圖4。

3 討 論

本研究通過離體細胞實驗首次發(fā)現(xiàn)，Mel預處理可激活SMP30信號，增強細胞的抗氧化應激能力，減輕細胞內鈣超載，進而減少細胞凋亡和壞死，最終改善心肌細胞缺血再灌注損傷。本實驗結果為完善Mel在MI／RI中的保護作用提供了新的實驗依據(jù)，為其進一步的臨床應用奠定了理論基礎。

近年來，缺血性心臟病嚴重地威脅著人群健康，其治療核心是重新恢復缺血心肌的血液供應。然而通過對先前缺血心肌實行血流恢復后，在某種情況下又會加重再灌注損傷癥狀，包括心肌細胞功能異常和細胞死亡。MI／RI形成是一個多因素、多步驟的復雜過程，其發(fā)生機制尚不完全清楚。有大量文獻顯示MI／RI的發(fā)生可能與細胞內鈣超載、氧自由基的產生、中性粒細胞浸潤、能量代謝障礙、血管內皮細胞功能障礙及心肌細胞凋亡等因素密切相關［8－10］。而氧化應激和鈣超載是其中兩個重要的損傷因素，尋找減輕氧化應激和鈣超載的有效措施來改善MI／RI顯得尤為重要。

心肌細胞內Ca2＋主要儲存于肌漿網(wǎng)和線粒體內，并且靜息狀態(tài)下胞漿內游離Ca2＋濃度很低。心肌細胞缺血后，無氧代謝使組織間液和細胞內pH下降，激活 Na＋通道、Na＋／H＋交換體和 Na＋／HCO3－同向轉運體，胞內Na＋濃度增加；同時，缺血期細胞線粒體受損，導致能量供應障礙，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，也造成胞內Na＋濃度增加。再灌注時，膜上反向鈉鈣交換體（Na＋／Ca2＋exchanger，NCX） 被廣泛激活，導致胞外Ca2＋大量、快速進入心肌細胞，加之細胞膜通透性增加，再灌注時Ca2＋順著濃度梯度大量內流，最終形成胞內鈣超載［11－12］。 以往研究發(fā)現(xiàn)，SMP30在細胞調控中扮演多種角色，能夠維持機體多種細胞內的鈣穩(wěn)態(tài)。并且有報道稱，在SMP30高表達的肝細胞內，SMP30可能通過調控胞膜Ca2＋泵，增強胞內 Ca2＋外流進而減輕細胞損傷［13］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在 SIR損傷后，細胞內Ca2＋濃度顯著升高，Mel預處理可顯著促進SMP30的表達，繼而降低胞內Ca2＋濃度，減輕細胞損傷；然而，用SMP30 siRNA抑制SMP30表達可逆轉Mel的保護作用，表明Mel可能通過激活SMP30信號，減輕胞內鈣超載，進而改善細胞缺血再灌注損傷。

圖3 SMP30 siRNA抑制SMP30表達后對相關蛋白凋亡指標的影響

圖4 SMP30 siRNA抑制SMP30表達后對氧化應激相關指標的影響

氧化應激與MI／RI的關系近年來也被大量的研究證實。當心肌細胞缺血、缺氧時，ROS清除系統(tǒng)功能降低，生成系統(tǒng)活性增強，一旦恢復組織血液供應和氧供，ROS反而會進一步產生并急劇堆積，以不同方式造成細胞急性或慢性損傷［14－15］。 Mel作為內源性的吲哚類激素，具有強效抗氧化應激作用，在腸、肝臟、心臟、腦等多種器官的缺血再灌注損傷實驗中發(fā)揮保護性作用［16－19］，其作用機制包括清除自由基、降低一氧化氮合酶和一氧化氮生成、保護線粒體功能、抑制細胞凋亡等。此外，作為一種衰老相關蛋白，SMP30會隨著機體的衰老在多種組織器官中表達量逐漸下降。除了在調節(jié)細胞內鈣穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，SMP30的抗氧化作用也在多種動物模型和細胞系中得到驗證［7，20］，并且能夠通過抑制一氧化氮合酶、蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性以及促進Bcl2、Akt的表達來減輕細胞凋亡［21］。 然而，SMP30能否介導Mel的抗氧化應激與凋亡的作用未見報道，在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后，細胞活力下降，SMP30蛋白表達量下調，凋亡通路相關蛋白表達上調，氧化應激水平上升。Mel預處理可以逆轉上述效應的發(fā)生，發(fā)揮減輕缺血再灌注損傷的作用，而Mel的抗氧化應激與抗凋亡作用均可被SMP30 siRNA抵消，進一步驗證了SMP30可介導Mel對H9c2細胞的保護作用。

綜上所述，SMP30分子可作為Mel新的作用靶點，來介導其發(fā)揮減輕MI／RI的作用。