無血預(yù)充大鼠體外循環(huán)模型的建立

李 健，郭 震，路麗明，李 欣

由于臨床上接受心臟外科體外循環(huán)手術(shù)患者體質(zhì)差異，基礎(chǔ)病變及外科、麻醉的多重因素影響，使得去除臨床其他干擾因素，單獨(dú)研究體外循環(huán)的損傷作用及探索機(jī)體保護(hù)措施相關(guān)研究受到很大局限。同時(shí)受到倫理學(xué)限制，研究者們無法輕易就可能的臨床干預(yù)措施對(duì)臨床患者進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究。因此，建立穩(wěn)定可靠、可以模擬臨床體外循環(huán)過程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@得尤為重要。

大鼠價(jià)格低廉、具有與人的心血管解剖相似、針對(duì)大鼠成熟研究手段豐富等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到研究者的青睞，成為建立體外循環(huán)動(dòng)物模型的首選。經(jīng)回顧近十幾年來國(guó)內(nèi)外體外循環(huán)大鼠模型建立經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)既往模型存在外科操作較復(fù)雜、預(yù)充量較大等問題，因此本研究擬對(duì)大鼠體外循環(huán)模型建立的相關(guān)外科技術(shù)進(jìn)行改良，并減少預(yù)充量，實(shí)現(xiàn)安全無血預(yù)充，探索大鼠體外循環(huán)模型安全有效的建立方法。

1 研究對(duì)象及方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體重在350～450 g的成年雄性SD大鼠15只，大鼠由上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并由上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

1．2 材料物品 整個(gè)大鼠體外循環(huán)系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵（中國(guó)kamoer公司）、泵管道（20 cm 長(zhǎng)內(nèi)徑2．4 mm的硅膠管道）、小動(dòng)物膜式氧合器（中國(guó)科威公司）、儲(chǔ)血罐、連接管道組成，其中儲(chǔ)血罐和連接管道分別選用臨床上常用的10 ml注射器針筒與輸液器管道制作。其他試驗(yàn)材料包括恒溫水浴箱（中國(guó)奧爾科特公司），多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀（荷蘭Philip公司），1 ml、2 ml、50 ml一次性注射器（中國(guó)康德萊公司），手術(shù)縫線（美國(guó)強(qiáng)生公司）；14 G、16 G、20 G、24 G 套管穿刺針（美國(guó)Becton Dickinson公司）；乳酸林格注射液（中國(guó)濟(jì)民公司），琥珀酰明膠注射液（佳樂施?，美國(guó)貝朗公司），碳酸氫鈉注射液（中國(guó)回音必公司）。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 準(zhǔn)備與麻醉 術(shù)前 12 h禁食，術(shù)前 2 h禁水。稱重，按體重5 ml／kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉誘導(dǎo)。

用乳酸林格液6 ml、琥珀酰明膠注射液6 ml、碳酸氫鈉注射液1 ml比例共13 ml進(jìn)行管道預(yù)充，預(yù)充完畢后儲(chǔ)血罐內(nèi)約2 ml液體。將管道沒入37℃恒溫水浴箱中。

使用一次性2 ml注射器針筒自制開口器，尾端部加工成為楔形。楔形前端角度約為25°，前端處理光滑，以防刮傷大鼠口腔內(nèi)黏膜組織。導(dǎo)管頂端和底端長(zhǎng)度根據(jù)大鼠體重可相應(yīng)修改。手術(shù)區(qū)域備皮、碘伏消毒、鋪無菌單，將大鼠妥善固定與手術(shù)板上。大鼠頭朝向術(shù)者，用橡皮筋將大鼠上門齒固定于手術(shù)板頭端的釘子上，傾斜手術(shù)板約20°。大鼠頭側(cè)稍微墊高，左手用眼科鑷子夾持紗布包裹鼠舌并輕微向外牽拉出口腔。插入開口器使口腔張開，將光源引入口腔，右手持插管，向上輕壓大鼠舌根部，即能看到大鼠的聲門隨呼吸開啟與閉合，趁聲門打開瞬間迅速將氣管導(dǎo)管插入氣道，退出管芯，確定插管位置。如不在氣道內(nèi)，應(yīng)立即拔管，稍后重插。插管位置無誤后，用膠帶固定氣管插管并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣。潮氣量設(shè)置為10 ml／kg，呼吸頻率60次／min，吸入純氧，氧氣流量1 L／min。根據(jù)動(dòng)脈血?dú)庹{(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，使PaCO2保持在35～45 mm Hg。根據(jù)大鼠麻醉深度實(shí)際情況進(jìn)行麻醉維持，10%水合氯醛0．5 ml或1 ml間斷腹腔注射。

1．3．2 外科操作 左股部沿股血管走形做 1．5 cm皮膚切口，游離左股動(dòng)脈與左股靜脈。在股動(dòng)脈與股靜脈下預(yù)置4－0絲線，可在穿刺血管時(shí)用來牽拉保持張力，置管完成后也可直接打結(jié)進(jìn)行插管的固定。股動(dòng)靜脈均以24 G套管針穿刺置管，動(dòng)脈血管由于壓力較高，穿刺前先用血管夾夾閉近端，穿刺成功后松開血管夾完成置管，絲線打結(jié)牢固固定。股動(dòng)脈連接換能器監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）及采血，MAP 維持在70～90 mm Hg；股靜脈連接輸液器進(jìn)行補(bǔ)液及推注肝素。從左股動(dòng)脈采血0．5 ml行血?dú)夥治?，根?jù)體重以500 IU／kg從左股靜脈套管緩慢推注肝素。

于右頸部旁開正中0．5 cm做一1．5 cm斜行切口，鈍行游離右頸外靜脈與右頸總動(dòng)脈。在右頸外靜脈與右頸總動(dòng)脈下預(yù)置4－0絲線，以自制頭端帶多個(gè)側(cè)孔的16 G套管針穿刺右頸外靜脈，使頭端進(jìn)入右心房，固定，排氣后連接靜脈回流管。以20 G套管穿刺針穿刺右頸總動(dòng)脈，使頭端進(jìn)入主動(dòng)脈，固定，排氣后連接灌注管道。見圖1、2。

1．3．3 體外循環(huán)過程 使儲(chǔ)血罐與大鼠保持30 cm高度以便于重力引流。管道及監(jiān)護(hù)儀連接完畢后打開靜脈引流端開關(guān)，使大鼠靜脈血經(jīng)右頸外靜脈緩慢引流至儲(chǔ)血罐。當(dāng)監(jiān)護(hù)儀上動(dòng)脈血壓波形消失時(shí)，開始體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)。

灌流流量逐漸增加至 100～150 ml／（kg·min），保持MAP穩(wěn)定于70～90 mm Hg，達(dá)到最大流量后停止機(jī)械通氣，小動(dòng)物膜式氧合器中通入純氧，氧流量 1～2 ml／min，保持肛溫在 36．5～38．3℃。 體外循環(huán)轉(zhuǎn)流30 min時(shí)從左股動(dòng)脈采血0．5 ml行血?dú)夥治觯鶕?jù)血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)。保證儲(chǔ)血罐液體量在2 ml以上。

1．3．4 停機(jī)與拔管 轉(zhuǎn)流60 min逐漸減小灌注流量，當(dāng)監(jiān)護(hù)儀上動(dòng)脈血壓出現(xiàn)波形時(shí)恢復(fù)機(jī)械通氣，參數(shù)同前，流量減小至1～2 ml／min時(shí)停機(jī)。

從左股動(dòng)脈采血0．5 ml行血?dú)夥治觥⑺羞M(jìn)行插管的血管結(jié)扎，用4－0絲線進(jìn)行皮膚切口的縫合。自主呼吸恢復(fù)后拔出氣管插管，改用自制面罩（50 ml注射器針筒）給予大鼠面罩吸氧，氧流量0．5 ml／min，直至大鼠自主意識(shí)恢復(fù)。 放回鼠箱，供食水，通風(fēng)，保暖。

圖1 大鼠體外循環(huán)組成示意圖

圖2 右頸總動(dòng)脈插管與右頸外靜脈插管

2 結(jié) 果

2．1 基本資料比較 早期3只大鼠在外科準(zhǔn)備階段死亡而失敗。分析失敗的主要原因在于：游離右頸總動(dòng)脈由于刺激到了伴行的右側(cè)迷走神經(jīng)引起迷走反射，影響了血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定；右頸靜脈插管時(shí)穿破血管壁，導(dǎo)致無法補(bǔ)救的失血死亡；右頸靜脈插管頭端沒有放在右心房處，引流不暢，體外循環(huán)無法維持。隨后12只大鼠順利完成體外循環(huán)建立及轉(zhuǎn)流，停機(jī)后拔除氣管插管，恢復(fù)自主呼吸、自主運(yùn)動(dòng)、反射，在水食充足及通風(fēng)環(huán)境下存活超過1天。

2．2 存活情況 12只大鼠順利停體外循環(huán)。血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后拔股動(dòng)、靜脈插管，自主呼吸恢復(fù)后拔氣管插管，并用自制面罩給予吸氧。大鼠恢復(fù)意識(shí)及運(yùn)動(dòng)后放回鼠籠，保暖通風(fēng)，供食、水。術(shù)后24 h再次觀察大鼠存活情況，12只大鼠均可正?；顒?dòng)，精神狀態(tài)如常，反應(yīng)靈敏，手術(shù)切口無活動(dòng)性出血，四肢末端顏色無紫紺。

2．3 血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)?存活大鼠整個(gè)體外循環(huán)時(shí)間60 min，大鼠MAP在體外循環(huán)過程中有所降低，在體外循環(huán)結(jié)束后逐漸恢復(fù)，大鼠血?dú)饣揪S持在正常水平，見表1。

3 討 論

大鼠由于體格小，進(jìn)行外科操作需要熟悉解剖并進(jìn)行一定程度的練習(xí)。本研究在總結(jié)國(guó)內(nèi)外大鼠體外循環(huán)模型后，結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)條件及相關(guān)設(shè)備進(jìn)行了改良。

3．1 麻醉與氣管插管 合適的麻醉深度是順利進(jìn)行氣管插管的前提。麻醉過淺，過度牽拉舌體會(huì)引起大鼠掙扎抵抗，插管過程會(huì)引起大鼠強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，嘔吐反射明顯，呼吸節(jié)律紊亂，聲門關(guān)閉，增加插管難度；麻醉過深則容易引起大鼠發(fā)生呼吸抑制，如不能盡快完成氣管插管開始機(jī)械通氣，容易導(dǎo)致大鼠死亡。吸入麻醉是近年來的麻醉方式，易于控制麻醉深度。本研究采用10%水合氯醛麻醉，得到了良好的麻醉效果，但需注意避免將藥物注入大鼠實(shí)質(zhì)性臟器引起動(dòng)物死亡。

合適的體位有助于氣管插管順利操作，既往研究［1］認(rèn)為將大鼠固定于15～20°傾斜的手術(shù)板較為合適。若傾斜角度超過30°，由于大鼠受自身重力下墜牽拉膈部引起疼痛造成大鼠掙扎，容易導(dǎo)致拉伸扭曲，增加插管難度。本研究中插管時(shí)大鼠手術(shù)板與桌面角度保持在20°，插管時(shí)不影響插管操作。

既往報(bào)道氣管插管方式有盲插法、經(jīng)口直視插管法、頸部切口插管法、鋼絲引導(dǎo)插管法等等，盲插法成功率較低，容易損傷氣道，切開插管會(huì)對(duì)氣管及喉部組織造成損傷，因而無創(chuàng)插管的方法較為推崇，但是大鼠呼吸頻率快、口腔狹小、聲門位置較高較難暴露，因而筆者根據(jù)報(bào)道［2］制作了大鼠口腔撐開器，能夠較好的暴露大鼠聲門。本研究采用的大鼠平均體重在400 g左右，采用14 G套管針作為氣管插管，可以獲得滿意通氣效果。

3．2 外科操作 大多數(shù)已報(bào)道的大鼠體外循環(huán)模型不需要正中開胸中心插管，而是采用外周血管插管。動(dòng)靜脈插管被認(rèn)為是大鼠體外循流量得以保證的最重要一環(huán)，而右頸外靜脈插管又是大鼠體外循環(huán)模型決定成敗的一個(gè)關(guān)鍵步驟。右頸外靜脈、右上腔靜脈、右心房壁均菲薄，且右頸外靜脈匯入右上腔靜脈過程中有兩次迂曲，故對(duì)插管技術(shù)要求很高。插管一旦失敗出現(xiàn)靜脈破裂，將會(huì)不可避免的大鼠失血死亡，無法補(bǔ)救。本研究通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)可以提高插管成功率：①通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)精確估計(jì)從右頸外靜脈到右心房的插管深度并在插管上提前做好距離標(biāo)記；②熟練掌握使用穿刺套管針的方法，包括穿刺角度、穿刺后旋轉(zhuǎn)斜面、套管進(jìn)入血管后盡快退出穿刺針芯；③熟悉大鼠血管解剖，穿刺過程中順血管走形置管。由于大鼠有兩條上腔靜脈，因而體外循環(huán)結(jié)束后結(jié)扎右頸外靜脈不會(huì)造成大腦一側(cè)靜脈回流不暢［3］。本研究靜脈插管采用頭端帶多個(gè)側(cè)孔的16 G套管作為靜脈插管，可以較輕松完成插管，套管頭端插入右心房可以獲得滿意流量。

灌注血管選擇右頸總動(dòng)脈有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至主動(dòng)脈弓可以很好的模擬臨床手術(shù)情況；大鼠具有完整的Willis腦基底動(dòng)脈環(huán)［4］，體外循環(huán)結(jié)束后結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈不會(huì)影響大鼠存活；大鼠右頸總動(dòng)脈與右頸外靜脈解剖位置適宜，可以在頸部做單一切口完成兩條血管的游離，避免了使用尾動(dòng)脈或股動(dòng)脈增加切口，不利于大鼠術(shù)后存活于恢復(fù)。但頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)伴行，游離過程中需注意動(dòng)作輕柔，避免暴力操作刺激迷走神經(jīng)，引起迷走反射，影響大鼠血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，增加大鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用20 G套管作為動(dòng)脈插管，可以較輕松完成插管，并且可以達(dá)到滿意的灌注流量。

表1 大鼠體外循環(huán)模型血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庾兓╪＝12，±s）

表1 大鼠體外循環(huán)模型血流動(dòng)力學(xué)及血?dú)庾兓╪＝12，±s）

體外循環(huán)前 90．42±3．75 7．39±0．01 0．420±0．009 131．33±7．70 38．59±0．59體外循環(huán) 30 min 67．17±3．69 7．33±0．01 0．311±0．007 176．92±9．65 36．84±0．65體外循環(huán) 60 min 59．58±1．51 7．33±1．01 0．2962±0．006 177．25±5．50 37．48±0．40體外循環(huán)結(jié)束后 79．25±3．08 7．32±0．01 0．293±0．007 176．33±9．23 37．49±0．57

大鼠動(dòng)脈血壓檢測(cè)血管通路及靜脈輸液血管通路選擇左股動(dòng)脈及左股靜脈，股靜脈血管壁菲薄且分支較多，游離過程需小心操作。

3．3 體外循環(huán)管理 靜脈引流不足經(jīng)常是限制流量的原因。本研究采用靜脈重力引流，儲(chǔ)血罐與大鼠保持30 cm高度差，虹吸作用滿意。當(dāng)引流不足時(shí)，可以輕柔調(diào)整插管位置，以獲得最佳引流。

本研究中最大灌注流量在100～120 ml／min，雖然沒有能夠?qū)崿F(xiàn)全流量，但是可以模擬基本的臨床體外循環(huán)，且大鼠MAP穩(wěn)定保持在60～90 mm Hg，術(shù)后可以存活至1天以上。

預(yù)充量較小，總共在13 ml左右，最大限度的避免了血液稀釋，并做到無血預(yù)充，在完成體外循環(huán)過程的同時(shí)能夠保證大鼠術(shù)后存活。

3．4 改良與問題 插管技術(shù)對(duì)于大鼠體外循環(huán)模型建立成功與否是最重要的。本研究中靜脈血引流、動(dòng)脈灌注、動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)、靜脈補(bǔ)液的完成均需應(yīng)用到插管技術(shù)。通常需要三到四根血管建立血管通路，在體外循環(huán)中完成動(dòng)脈灌注、靜脈引流、動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)等。常用的動(dòng)脈血管有頸總動(dòng)脈、股動(dòng)脈、尾正中動(dòng)脈，常用的靜脈血管有頸外靜脈、股靜脈。既往大鼠手術(shù)體外循環(huán)模型通常起碼要做三個(gè)部位的切口進(jìn)行血管游離穿刺置管。切口數(shù)量多會(huì)延長(zhǎng)操作時(shí)間并影響大鼠術(shù)后恢復(fù)。本研究中大鼠模型建立為了縮短操作時(shí)間，減少大鼠手術(shù)創(chuàng)傷，僅在右頸部與左股部?jī)商幾銎つw小切口。游離右頸總動(dòng)脈、右頸外靜脈、左股動(dòng)脈、左股靜脈分別用作動(dòng)脈灌注、靜脈引流、動(dòng)脈壓檢測(cè)、靜脈補(bǔ)液。術(shù)中輕柔、謹(jǐn)慎操作，妥善插管固定，手術(shù)效果滿意。此外也精簡(jiǎn)了體外循環(huán)管道，減少了預(yù)充量，減輕血液稀釋。

本研究利用腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉深度不易控制，會(huì)出現(xiàn)體外循環(huán)過程中需要追加麻醉藥物或體外循環(huán)結(jié)束后大鼠不能及時(shí)蘇醒的問題；縮短體外循環(huán)管道雖然減少了預(yù)充量，但是沒入恒溫水箱中的管道較短，不能很快的達(dá)到目標(biāo)溫度；大鼠右頸部與左股部均需進(jìn)行兩支血管的穿刺置管固定，空間較小，操作過程中需要十分小心，一定程度上減慢了操作速度。

綜上，本研究成功建立了易于操作、穩(wěn)定可重復(fù)的無血預(yù)充微創(chuàng)大鼠體外循環(huán)模型，并且可以很好地模擬臨床體外循環(huán)相關(guān)病理生理過程，可用于進(jìn)一步研究體外循環(huán)手術(shù)圍術(shù)期的全身炎癥反應(yīng)及多臟器損傷的病理生理機(jī)制；大鼠與人的同源性高，分子生物學(xué)檢測(cè)手段豐富，可以更為全面深入的探究體外循環(huán)炎癥反應(yīng)過程發(fā)生的機(jī)制機(jī)理，為臨床上進(jìn)一步尋求預(yù)測(cè)及治療策略提供幫助。