黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌促生長(zhǎng)作用初探

郭 羽，王 曉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

腸道菌群約占人體總微生物量的78%，他們參與了人體的營(yíng)養(yǎng)、免疫、代謝調(diào)節(jié)等諸多生理活動(dòng)，被稱為“人體的第二基因庫(kù)”。近年來(lái)隨著廣譜和強(qiáng)力抗生素的廣泛使用，雖然感染性疾病在某種程度上得到了控制，但抗生素在殺死病原菌的同時(shí)也殺死了有益菌群，嚴(yán)重破壞了人體腸道的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)，進(jìn)而引起糖尿病、肥胖、心腦血管疾病、結(jié)直腸癌等許多相關(guān)疾病［1］。因此，腸道菌群與人體健康息息相關(guān)，而如何維持腸道菌群的良好狀態(tài)成為醫(yī)學(xué)界許多學(xué)者關(guān)注的課題。

益生菌在腸道內(nèi)大量繁殖可調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)并提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而幫助恢復(fù)健康水平。所以，有意增加人體腸道內(nèi)益生菌數(shù)量就顯得非常重要［1］。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是人體腸道中重要的有益菌，腸道黏著率高，定植能力強(qiáng)，具有平衡腸道菌群、排除毒素、抑制有害菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力等生理保健功能［2］。正因?yàn)長(zhǎng)GG有如此重要之健康促進(jìn)功能，很多益生菌制劑都以其作為重要活菌成分。但鼠李糖乳桿菌真正在人體發(fā)揮功效，需保證一定數(shù)量的菌體經(jīng)過(guò)人體消化道，安全到達(dá)腸道。盡管鼠李糖乳桿菌相對(duì)于其他益生菌更能耐受消化道的酸性環(huán)境，但在經(jīng)過(guò)低pH的胃酸以及受到小腸高濃度膽鹽毒害時(shí)依然會(huì)遭到嚴(yán)重破壞或其活性受到抑制，從而大大降低了到達(dá)腸道中的活菌數(shù)量。因此尋找促進(jìn)鼠李糖乳桿菌增殖的物質(zhì)，用以提高其在人體內(nèi)的水平或促進(jìn)體外培養(yǎng)液中的增殖，提高其對(duì)胃腸道不良環(huán)境的耐受性成為關(guān)鍵問(wèn)題。

越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖類成分尤其是補(bǔ)益類中藥對(duì)益生菌生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用［3］。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖，是黃芪最重要的活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等功效［4］，但能否促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的增殖并提高其抗逆性尚未見(jiàn)報(bào)道。本文探討了黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖及其對(duì)酸、膽鹽等胃腸道不良環(huán)境的耐受性的影響，為黃芪現(xiàn)代化研究及鼠李糖乳桿菌功能性食品的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，NBRC3425）（上海瑞楚生物科技有限公司）。1.1.2 試劑 MRS培養(yǎng)基（上海瑞楚生物科技有限公司）；黃芪多糖（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）：膽鹽（北京索萊寶生物科技）；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶250）美國(guó) Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（上海巴艾貝斯公司）；恒溫培養(yǎng)箱（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超低溫冰箱（中科美菱超低溫科技股份有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；酸度計(jì)（上海雷磁）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將-80℃凍存的鼠李糖乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)傳代3次備用。

1.2.2 黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)基的配制 在MRS液體培養(yǎng)基中加入黃芪多糖，微熱溶解，配制成黃芪多糖濃度分別為 0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%的APS/MRS復(fù)配增殖培養(yǎng)基，調(diào)整pH為7.0，121℃滅菌20 min備用。

1.2.3 不同濃度APS對(duì)LGG的增殖作用 將活化3代的菌種按1%（V/V）接種量（約1×106CFU/mL）接種于含有不同濃度黃芪多糖的MRS培養(yǎng)基中，平行3組，同時(shí)以不加黃芪多糖的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照組，37℃培養(yǎng)16 h后，測(cè)定培養(yǎng)基中的活菌數(shù)。

活菌計(jì)數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法：分別取1 μL上述各組發(fā)酵液，對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列梯度稀釋至合適濃度，加入MRS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，測(cè)定鼠李糖乳桿菌活菌含量，換算成菌落形成單位（CFU/mL）。

1.2.4 黃芪多糖對(duì)LGG產(chǎn)酸性能的影響 在復(fù)配質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%黃芪多糖的條件下對(duì)活化后的LGG進(jìn)行培養(yǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中每隔2 h測(cè)定1次pH值，空白對(duì)照組不添加APS。

1.2.5 耐酸性實(shí)驗(yàn) 將于復(fù)配培養(yǎng)基中發(fā)酵至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液4 000 r/min離心25 min，棄去上清，沉淀菌體用滅菌MRS液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液濃度為5.0×108CFU/mL，按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于1 mL pH分別為1.5、2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)2 h、4 h后取出，稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)（n=3），換算成菌落形成單位（CFU/mL）并計(jì)算其存活率。存活率（%）=lgCFUN1/lgCFUN0×100%，N1=酸處理后的活菌數(shù)，N0=未處理前活菌數(shù)。

1.2.6 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 在滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，無(wú)菌條件下添加0.3%的膽鹽，將APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌接種于含膽鹽液體MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)3 h，檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.7 人工模擬胃腸液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 人工模擬胃腸液需新鮮配制［5］：在pH2.0的滅菌PBS中濾過(guò)除菌加入10 g/L的胃蛋白酶，制成人工胃液；在pH6.8的PBS中按0.3%加入膽鹽，滅菌，濾過(guò)除菌加入10 g/L胰蛋白酶，制成人工腸液。

將APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的鼠李糖乳桿菌按7%（約1×109CFU/mL）接種到人工胃液，同時(shí)添加2.5%黃芪多糖，充分混勻，在37℃孵育1 h、2 h、3 h 后，取樣，檢測(cè)活菌數(shù)，并計(jì)算存活率。將1 mL消化3 h的含菌人工胃液離心沉淀，收集菌體，用1 mL生理鹽水重懸，加入9 mL模擬腸液中，充分混勻，繼續(xù)于37℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2和 4 h取樣，檢測(cè)活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖的影響

相對(duì)于空白對(duì)照組，在添加黃芪多糖的發(fā)酵液中，活菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明黃芪多糖可以被鼠李糖乳桿菌利用。隨著APS濃度的增加，鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì)，在APS添加量為2.5%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大，生物量約為1×109CFU/mL。當(dāng)APS高于3%時(shí)，促增殖效果反而減弱。結(jié)果見(jiàn)表1。

不同種類的中藥多糖及同一種中藥多糖的不同濃度對(duì)益生菌的增殖效果均存在一定差異［6］。黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌的增殖作用并非濃度越高越好，高濃度APS反而會(huì)產(chǎn)生抑制作用?？赡苡捎邳S芪多糖作為一種功能性多糖，在合適的添加范圍內(nèi)對(duì)于LGG的代謝調(diào)節(jié)有著積極的促進(jìn)作用；而多糖濃度的增加使發(fā)酵液滲透壓增大，從而抑制了LGG的生長(zhǎng)。

因此，一定濃度黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖具有促進(jìn)作用。決定以加入濃度為2.5%的黃芪多糖來(lái)對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2.2 黃芪多糖對(duì)LGG發(fā)酵液pH的影響

在培養(yǎng)過(guò)程中復(fù)配黃芪多糖培養(yǎng)基處理的實(shí)驗(yàn)組和未添加黃芪多糖的對(duì)照組pH值均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。因鼠李糖乳桿菌本身是一種乳酸菌，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生少量醋酸和大量乳酸，因此發(fā)酵液呈酸性，發(fā)酵液pH值呈下降趨勢(shì)。此外，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液pH值均低于對(duì)照組，表明黃芪多糖能被鼠李糖乳桿菌利用，并促進(jìn)其增殖，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，降低pH值。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌耐酸性影響

圖1 黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵液pH的影響

環(huán)境中的pH值通過(guò)影響細(xì)菌細(xì)胞膜電荷變化、改變其通透性或影響細(xì)菌酶活性而降低其代謝速率，不同微生物對(duì)酸的耐受能力不同。益生菌必須進(jìn)入人體腸道才能發(fā)揮其益生功能，而從口腔經(jīng)消化道進(jìn)入腸道，中間必須經(jīng)過(guò)胃。人體胃液呈酸性，空腹或者食用酸性食品后，pH值可低至1.5 左右［7］，因此，耐酸性是保證菌株穿過(guò)胃液安全進(jìn)入腸道的一個(gè)必要條件。

在 pH 1.5 和 2.0 條件下維持2 h，以 2.5%黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)基培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)分別能夠達(dá)到 0.83×107CFU/mL 和 0.99×107CFU/mL，存活率分別是 55.32%和 66.17%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在4 h時(shí)活菌數(shù)都有不同程度的減少。而在pH值為2.5和3.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，在 pH 3.0條件下存活率達(dá)到 94.71%，活菌數(shù)能夠接近1.42×107CFU/mL。因此，鼠李糖乳桿菌對(duì)酸的耐受性隨著pH升高而增加。與未添加黃芪多糖的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)照組菌株相比，在相同的酸性條件下，其存活率和活菌數(shù)均高于對(duì)照組，表明LGG經(jīng)黃芪多糖處理后能增強(qiáng)對(duì)酸的耐受性。可能是黃芪多糖促使菌株通過(guò)酶促反應(yīng)釋放堿性物質(zhì)以中和酸性環(huán)境，并降低其對(duì)菌株造成的損傷和代謝的抑制。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌膽鹽耐受的影響

膽鹽（Bile salt）是由肝細(xì)胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而形成的鈉鹽或鉀鹽，可在細(xì)胞外產(chǎn)生高滲透壓，對(duì)菌體細(xì)胞造成影響。人體小腸內(nèi)膽鹽濃度在 0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)［8］，因此本研究采用0.3%的膽鹽環(huán)境，觀察經(jīng)黃芪多糖處理的鼠李糖乳桿菌的膽鹽耐受能力，對(duì)照組菌株存活率為73.77%，APS/MRS復(fù)配培養(yǎng)的LGG菌株存活率為87.45%，較對(duì)照組提高了約1.2倍。表明APS能提高LGG的耐膽鹽能力。結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 不同濃度黃芪多糖對(duì)LGG活菌數(shù)的影響 （lgCFU/mL，n=3，±s）

表1 不同濃度黃芪多糖對(duì)LGG活菌數(shù)的影響 （lgCFU/mL，n=3，±s）

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表2 黃芪多糖對(duì)鼠李糖乳桿菌耐酸性影響

表3 黃芪多糖對(duì)膽鹽脅迫下鼠李糖乳桿菌存活率的影響

當(dāng)環(huán)境中的膽鹽濃度高于微生物細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的濃度時(shí)，會(huì)使微生物胞內(nèi)基質(zhì)外滲，繼而引起微生物死亡。實(shí)驗(yàn)中添加黃芪多糖后，在膽鹽脅迫條件下，菌體的存活率高于空白對(duì)照。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是，黃芪多糖誘導(dǎo)鼠李糖乳桿菌體內(nèi)生成相應(yīng)的物質(zhì)，增加基質(zhì)濃度，使菌體內(nèi)與外部環(huán)境不會(huì)存在較高濃度差；還有可能是黃芪多糖會(huì)被特異性地吸附在菌體表面，使LGG對(duì)不利于自身生長(zhǎng)的環(huán)境產(chǎn)生相應(yīng)的“應(yīng)急機(jī)制”，繼而能夠避免基質(zhì)外滲，增加存活率。

2.5 人工胃液耐受性實(shí)驗(yàn)

益生菌作為一種生物制劑，在口服后進(jìn)入消化道，除了胃酸和膽汁酸鹽外，還要遭受胃液中蛋白酶以及腸液中的胰蛋白酶等物質(zhì)的傷害，這些因素都會(huì)明顯影響其活菌數(shù)，進(jìn)而影響其益生功效。為進(jìn)一步考察復(fù)配黃芪多糖培養(yǎng)的LGG在人體胃腸道中的穩(wěn)定性，本研究通過(guò)模擬人體胃腸道環(huán)境，研究了菌種在人工胃液和人工腸液中的生長(zhǎng)和存活情況。結(jié)果見(jiàn)圖2。

正常人胃液pH約為1～3，通常在2左右，食物通過(guò)胃的時(shí)間一般為1～3 h，實(shí)驗(yàn)組菌株在人工胃液中處理1 h后存活率約為73.38%，2 h后存活率仍在69.22%，各時(shí)間點(diǎn)均高于未經(jīng)黃芪多糖處理的對(duì)照組菌株存活率。推測(cè)在胃酸和胃酶作用下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃芪多糖出現(xiàn)一定程度降解，產(chǎn)生單糖被LGG利用。此外，在人工胃液中的存活率均高于同一pH值下MRS中的存活率，這可能是胃蛋白酶對(duì)菌體具有保護(hù)作用的緣故［9］。

2.6 人工腸液中的存活數(shù)

圖2 APS對(duì)LGG在人工胃液中存活率的影響

腸液中的膽鹽、胰蛋白酶均不利于LGG菌株的生長(zhǎng)。食物通過(guò)小腸的平均時(shí)間約為1.5 h，模擬腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組鼠李糖乳桿菌在模擬腸液中維持2 h活菌數(shù)達(dá)到1.78×108CFU/mL，4 h后活菌數(shù)仍保持在108CFU/mL以上，符合益生菌產(chǎn)品規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而對(duì)照組在孵育4 h后活菌數(shù)下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)，且同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中的活菌數(shù)均高于未經(jīng)APS處理的對(duì)照組。因此，經(jīng)黃芪多糖復(fù)配培養(yǎng)能提高LGG菌株在胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 人工腸液中鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)

3 討論

近年來(lái)，由于環(huán)境污染、濫用藥物和膳食結(jié)構(gòu)不合理等因素，我國(guó)國(guó)民微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)狀況正受到嚴(yán)重威脅。尤其濫用抗菌藥物，使人體腸道微生態(tài)平衡受到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而引發(fā)諸多腸源性和非腸源性疾病［10］。鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生L-乳酸，不會(huì)使人體產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此被國(guó)際公認(rèn)為最安全的菌種［11］，但其制劑在制備過(guò)程中容易失活，且經(jīng)口腔進(jìn)入機(jī)體在胃腸道環(huán)境中會(huì)遭到破壞。國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為活菌制劑在臨床使用時(shí)至少需要達(dá)到1×106～1×107CFU/（g·mL）的活菌數(shù)［12］。因此LGG的高存活性和高穩(wěn)定性始終是制劑的巨大挑戰(zhàn)。

已有研究表明，黃芪水煎液能促進(jìn)益生菌增殖［3］。作為黃芪最重要的活性成分，黃芪多糖具有改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡、抑制有害菌、扶植有益菌等作用。為促進(jìn)鼠李糖乳桿菌（LGG）增殖，提高LGG制劑的穩(wěn)定性和對(duì)不良環(huán)境的耐受能力，本文以黃芪多糖為促生因子，探究其對(duì)鼠李糖乳桿菌增殖的影響，初步證明了黃芪多糖能夠促進(jìn)鼠李糖乳桿菌增殖，提高其在胃腸道中轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)的耐受性，為開(kāi)發(fā)黃芪多糖/鼠李糖乳桿菌中藥微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。而APS對(duì)LGG促生長(zhǎng)作用的構(gòu)效關(guān)系，有待在今后的研究中進(jìn)一步解析并闡明。