大鼠矽肺模型腸道菌群初級(jí)分離培養(yǎng)及鑒定

林高杰 陳賀佳 何松 王瑾

【摘要】矽肺是塵肺中最為常見(jiàn)的一種類型，是由于長(zhǎng)期吸入大量游離二氧化硅粉塵所引起，以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的疾病。矽肺病發(fā)病隱匿，潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與多種疾病存在關(guān)系，其中哮喘、肺炎和肺結(jié)核等呼吸道疾病的發(fā)生過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)腸道菌群存在著重要的作用[2]。矽肺病作為肺部疾病的一種，伴有咳嗽和呼吸不暢等呼吸道疾病的癥狀。因此，研究腸道菌群中的關(guān)鍵菌和矽肺的關(guān)系，可以為了解砂肺病的致病機(jī)制以及治療肺部疾病提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】矽肺；腸道菌群；沙門(mén)菌；金黃色葡萄球菌

1 材料與方法

1.1實(shí) 驗(yàn)材料與儀器

SS瓊脂平板蓋、血瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、五糖發(fā)酵管、載玻片、酒精燈、試管、接種環(huán)、鑷子；HPOE-MED8050動(dòng)式染塵機(jī)、恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 矽肺模型的建立

采用HPOE-MED8050動(dòng)式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建Wistar大鼠矽肺模型。在溫度20℃～25℃、濕度70%～75%、柜內(nèi)壓力-50Pa～+50Pa、氧含量20%、SiO2流動(dòng)速3.0～3.5ml/min，SiO2濃度2000mg/m3條件下染塵，每天染塵2h，共8w。

1.2.2 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

用無(wú)菌接種環(huán)截取矽肺組和對(duì)照組小鼠糞便樣品中段里部在SS瓊脂和血瓊脂平板上分區(qū)劃線分離細(xì)菌，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h培養(yǎng)觀察。

1.2.3 細(xì)菌生化實(shí)驗(yàn)

將平板上的細(xì)菌接種到液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中于37℃，180rmp恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18-24h培養(yǎng)，取菌液做相關(guān)的生化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

抗菌藥物藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法[3]。分別取菌均勻密布圖在兩只瓊脂平板表面。在每一種細(xì)菌的瓊脂平板上，分別放置頭抱霉素、用抗菌藥物為青霉素、慶大霉素、氯霉素、羅紅霉素和左氧氟沙星的干燥藥物濾紙圓片，各片間距要相當(dāng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

SS瓊脂中有的膽酸鹽可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，構(gòu)櫞酸鹽和煌綠能抑制大腸埃希菌，因此觀察SS瓊脂平板上形成有可能是沙門(mén)菌或志賀菌。有些細(xì)菌可以產(chǎn)生溶血素，溶解血瓊脂平板上的紅細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)溶血環(huán)，觀察血瓊脂平板上出現(xiàn)β完全溶血環(huán)可能是葡萄球菌或鏈球菌。

2.2 生化實(shí)驗(yàn)

分別取SS瓊脂平板無(wú)色透明的菌落的和血瓊脂平板和有溶血環(huán)的菌落隨機(jī)挑選上10個(gè)菌落接種到、半固體和固體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，取OD值0.6-0.8之間菌液做生化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步鑒定細(xì)菌，如表1。生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果可以得出SS瓊脂平板上的是沙門(mén)菌，而血8瓊脂平板上的是金黃色葡萄球菌。

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取的金黃色葡萄球菌對(duì)5種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌對(duì)于青霉素、氯霉素等耐藥；對(duì)慶大霉素的耐藥是中介；對(duì)左氧氟沙星和羅紅霉素敏感度。而沙門(mén)菌對(duì)于羅紅霉素以及青霉素的耐藥；而氯霉素的耐藥中介；對(duì)慶大霉素和左氧氟沙星敏感。

3 討論

腸道菌群是寄居在人體腸道內(nèi)微生物群落的總稱，對(duì)于人類機(jī)體是有益的。但在病理因下，紊亂的腸道菌和毒素可直接損傷腸黏膜，而且全身炎性反應(yīng)綜合癥也與細(xì)菌或毒素移位是有關(guān)系的[4]。我們所分離鑒定出來(lái)的沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌都與腸炎有著密切。而且金黃色葡萄球菌引起的肺炎，占成人肺炎的2～3%，沙門(mén)菌也能夠引起局部的肺部感染。因此，矽肺的發(fā)生過(guò)程中可能也與這兩種細(xì)菌存在著關(guān)系。多因原發(fā)疾病是由長(zhǎng)期用抗生素引起腸道菌群失調(diào)所致，抗生素敏感菌株受到抑制，耐藥的菌株趁機(jī)繁殖[5]。因此藥敏實(shí)驗(yàn)為臨床指導(dǎo)用藥提供一定的指導(dǎo)性作用。想要具體探究腸道菌群以及其代謝物與矽肺的關(guān)系，我們下一步將進(jìn)行16SrDNA測(cè)序梳理清兩者之間的聯(lián)系。

（通訊作者：王瑾）

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).關(guān)于2016年職業(yè)病防治工作情況的通報(bào)[EB/OL].http：//www.nhfpc.gov.cn/jkj/s5899t/201712/c46227a95f054f5fa75a40c4db05bb37.shtml.

[2]于洪志，吳琦.腸道菌群與肺部疾病關(guān)系的研究緊張[J].天津醫(yī)藥，2017，25（18）：1380-1382.

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