富G寡聚核苷酸修飾的金納米粒子與細(xì)胞相互作用的研究

孫艷紅 魏 佳 王振新 孟憲瑛*

1(吉林大學(xué)白求恩第一臨床醫(yī)院甲狀腺外科， 長春 130021)2(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所 電分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長春 130022)

1 引 言

金納米粒子(GNPs)具有合成簡單、形貌易于控制、易修飾并具有較強(qiáng)的表面等離子體共振(SPR)光吸收等特點(diǎn)，自1996年，Mirkin等將單鏈寡聚核苷酸(ssDNAs)修飾的GNPs應(yīng)用于比色分析以來，ssDNAs與GNPs復(fù)合物(ssDNA-GNPs)作為納米探針或納米藥物載體在生物分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1～14]。以ssDNA-GNPs為探針的分析方法通常具有靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)。例如，與有機(jī)染料標(biāo)記的熒光法相比，GNPs為探針的比色法對目標(biāo)ssDNA的檢測限能夠降低2個數(shù)量級以上，并具有較寬的線性范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品中低豐度目標(biāo)ssDNA的檢測[4,6]。另外，由于GNPs被認(rèn)為是最穩(wěn)定的生物相容性材料之一，從而使基于GNPs的診斷與治療相結(jié)合的納米復(fù)合物逐漸成為一類有良好臨床應(yīng)用前景的納米藥物。已有研究表明，ssDNA-GNPs能夠逃避細(xì)胞的免疫反應(yīng)進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)高靈敏檢測以及基因調(diào)控[12,14]。

ssDNA-GNPs的生物化學(xué)性質(zhì)(DNA雜交、分子識別等)與所修飾的ssDNA的二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，ssDNA的表面密度、二級結(jié)構(gòu)等均能夠影響其反應(yīng)活性[13,15]。G四鏈體(G-quadruplex，G4)是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的核酸二級結(jié)構(gòu)，因其具有調(diào)控基因表達(dá)的生物學(xué)功能，被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤治療藥物或靶點(diǎn)。相對于線性ssDNA，具有G四鏈體二級結(jié)構(gòu)的ssDNA能夠被細(xì)胞表面的A類清道夫受體(SR-A)識別，并由脂筏/小窩介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，極大地增加ssDNA-GNPs復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞量[15]。另外，研究表明，細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬量與ssDNA的序列有關(guān)，即細(xì)胞對富含堿基G的ssDNA-GNPs的吞噬量高于富含堿基A、T、C的ssDNA-GNPs[16]。據(jù)此，研究不同序列富含G堿基的 ssDNA修飾的GNPs與細(xì)胞相互作用的差異，對構(gòu)建高效的基于ssDNA-GNPs的納米探針或基因載體有積極意義。目前，富G堿基ssDNA修飾的GNPs與細(xì)胞相互作用行為尚不清楚。本研究合成了兩種富G 的ssDNA-GNPs(PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs)，系統(tǒng)地考察了ssDNA的二級結(jié)構(gòu)對ssDNA-GNPs的細(xì)胞毒性、細(xì)胞吞噬行為及其細(xì)胞內(nèi)分布等的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UVmini-1240紫外可見吸收光譜(日本島津公司); ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，美國Thermo Fisher Scientific公司); HITACHI H-600型透射電子顯微鏡(TEM，日本Hitachi公司)，5415R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司); Nano-ZS粒度儀(英國Malvern公司); HPC-250CL 恒溫恒濕箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠); ZLS-1真空離心濃縮儀(湘儀離心機(jī)有限公司); Power Wave XS2型微孔板分光光度計(jì)(美國BioTek儀器有限公司)，Thermo Forma 371型恒溫恒濕二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

氯金酸(HAuCl3·3H2O，阿拉丁公司); 二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O，北京華騰化工有限公司); 青霉素和鏈霉素混合液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、達(dá)爾伯改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、二甲基亞砜(DMSO)以及3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)均購于北京鼎國生物技術(shù)公司; 根據(jù)文獻(xiàn)[16]報道設(shè)計(jì)的二硫鍵修飾ssDNAs(PolyT: 5′TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-C6H12S-SC6H133; PolyG1: 5′GGT GGT GGT GGT CCT CCT CCC GGT GGT GGG AGG AGG TTT TTT-C6H12S-SC6H133; PolyG2: 5′GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT TTT TTT-C6H12S-SC6H133)由上海生工生物工程股份有限公司合成; HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; 其它化合物均為分析純，購于北京化工廠。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ cm)。

2.2 ssDNA-GNPs的合成

2.3 ssDNA-GNPs的細(xì)胞毒性和吞噬實(shí)驗(yàn)

向DMEM中添加10% (V/V)FBS、1%(m/V)青霉素和1 %(m/V)鏈霉素配制完全培養(yǎng)基(CM)。將100 μL CM和8000個HeLa細(xì)胞加入96孔板的孔中，在二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)24 h。 用100 μL PBS清洗后，分別加入含不同濃度(5、25和50 μg/mL)ssDNA-GNPs的100 μL CM， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 用100 μL PBS清洗后，加入90 μL DMEM和10 μL 5 mg/mL MTT。孵育4 h后，加入100 μL DMSO，輕輕振蕩，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下進(jìn)行吸光度檢測。以相同條件下正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組，計(jì)算與ssDNA-GNPs作用后細(xì)胞的相對活率。

將1.3×105個HeLa細(xì)胞于12孔板內(nèi)孵育24 h 后， 將細(xì)胞和25 μg/mL ssDNA-GNPs在不同條件下(CM中37℃、CM中4℃、DMEM中37℃或DMEM中4℃)孵育12 h。用100 μL PBS清洗3次后，使用胰蛋白酶將細(xì)胞消化并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。加入1 mL 王水孵育24 h, 使用ICP-MS檢測細(xì)胞中Au的含量。同樣條件下，HeLa細(xì)胞與ssDNA-GNPs作用后，使用1 mL 多聚甲醛固定胰蛋白酶消化的細(xì)胞制備細(xì)胞切片，用于TEM觀察。同樣條件下，HeLa細(xì)胞與ssDNA-GNPs作用后，使用超聲波細(xì)胞粉碎儀(4 min，超聲30 s，間隔40 s)將胰蛋白酶消化的細(xì)胞打碎，加入100 μL PBS，混勻，轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，使用酶標(biāo)儀記錄其紫外-可見吸收光譜。

圖1 PolyG1和PolyG2在PBS中的圓二色譜，PolyG1和PolyG2的濃度為17 μmol/LFig.1 Circular dichroism (CD) spectra of PolyG1 and PolyG2 in PBS. The concentrations of PolyG1 and PolyG2 are 17 μmol/L respectively

3 結(jié)果與討論

3.1 ssDNA-GNPs的合成與表征

PolyG1和PolyG2在PBS中的圓二色譜(CD)如圖1所示，PolyG1在238 nm處有一個負(fù)的CD吸收峰，PolyG2在260 和240 nm 處有一對對稱的CD吸收峰。在此反應(yīng)條件下，PolyG1為線性結(jié)構(gòu)，而PolyG2能夠形成G四鏈體二級結(jié)構(gòu)[19,20]。如圖2所示，所制備的檸檬酸鈉保護(hù)的GNPs具有較好的分散性，平均粒徑為(13±1) nm，水合粒徑為(13.4±2.4) nm， 最大SPR吸收峰位于519 nm處，與文獻(xiàn)[4,6]報道的結(jié)果一致。PolyT因與GNPs具有較高的反應(yīng)活性，通常在制備ssDNA-GNPs過程中被用作穩(wěn)定劑。分別使用不同摩爾比的PolyT∶PolyG1或PolyT∶PolyG2與GNPs反應(yīng)制備ssDNA-GNPs。結(jié)果表明，ssDNA-GNPs在PBS中的膠體穩(wěn)定性隨ssDNA混合物中PolyT的比例增加而增強(qiáng)。當(dāng)ssDNA混合物中PolyT摩爾比低于20%時，所合成的ssDNA-GNPs在PBS中易發(fā)生聚集。此現(xiàn)象可能是由于PolyG1或PolyG2與GNPs的反應(yīng)效率低，使其表面存在一定量的活性位點(diǎn)，并與PBS中Na+產(chǎn)生靜電作用導(dǎo)致的。綜合考慮ssDNA-GNPs的膠體穩(wěn)定性以及與細(xì)胞的反應(yīng)活性，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用摩爾比為1∶4的PolyT∶PolyG1或PolyT∶PolyG2與GNPs反應(yīng)制備ssDNA-GNPs。如圖2和表1所示，TEM、紫外可見吸收光譜、水合粒徑分析表明，制備的ssDNA-GNPs在不同的分散介質(zhì)中均能夠保持良好的分散性。ssDNA修飾后，GNPs的最大SPR吸收峰發(fā)生紅移，水合粒徑增大，與文獻(xiàn)[1～3,21]報道的結(jié)果一致。另外，由于ssDNA-GNPs與完全培養(yǎng)基(CM)中的蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)吸附在ssDNA-GNPs表面， 使其水合粒徑和表面荷電量進(jìn)一步增大。

圖2 (A)檸檬酸根保護(hù)的GNPs、 (B)PolyG1-GNPs和(C)PolyG2-GNPs的TEM圖; (D) 0.32 nmol/L GNPs的紫外-可見吸收光譜Fig.2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (A) citrate-capped gold nanoparticles (GNPs), (B) PolyG1-GNPs and (C) PolyG2-GNPs; (D) Corresponding UV-vis absorption spectra, the concentrations of three GNPs are all 0.32 nmol/L

表1 ssDNA-GNPs在不同介質(zhì)中的最大SPR吸收峰、水合粒徑和Zeta電勢

Table 1 Maximum SPR absorption bands, hydrodynamic sizes and Zeta potentials of as-prepared ssDNA-GNPs

3.2 細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬機(jī)制

ssDNA-GNPs具有與所修飾ssDNA類似的生理功能，無需陽離子或親脂性轉(zhuǎn)染試劑即可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此被認(rèn)為是一類具有良好應(yīng)用前景的納米藥物[22]。早期已有研究報道ssDNA的堿基種類能夠影響ssDNA-GNPs與細(xì)胞的作用方式[16]，但未具體研究ssDNA的構(gòu)型對ssDNA-GNPs與細(xì)胞相互作用的影響。使用ICP-MS測定了不同條件下與ssDNA-GNPs共培養(yǎng)后，HeLa細(xì)胞中GNPs的含量。如圖3A所示，在正常培養(yǎng)條件(37℃下CM中)下，單個HeLa細(xì)胞中的PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs含量分別為4.7105和6.4105個，表明二者均與HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的相互作用。HeLa細(xì)胞對PolyG2-GNPs的吞噬量大于文獻(xiàn)[16]報道的SR-A高表達(dá)的C166細(xì)胞對富G堿基ssDNA修飾的GNPs的吞噬量(5105個/細(xì)胞)。另外，在所有實(shí)驗(yàn)條件下，HeLa細(xì)胞對PolyG2-GNPs的吞噬量均大于其對PolyG1-GNPs吞噬量，這表明具有G四鏈體二級結(jié)構(gòu)的PolyG2能夠通過與細(xì)胞表面受體(如A-SR等)的相互作用增加細(xì)胞對PolyG2-GNPs的內(nèi)吞。相同培養(yǎng)溫度下，在DMEM中培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬量約為正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞對ssDNA-GNPs吞噬量的16倍。相同的培養(yǎng)基中，在4℃下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬量小于在37℃下的HeLa細(xì)胞; 其中正常培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬量下降了約50%，在DMEM中培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞對ssDNA-GNPs的吞噬量下降了約75%。這表明細(xì)胞對ssDNA-GNPs的內(nèi)吞與能量有關(guān)，即處于正常生理溫度(37℃)和饑餓狀態(tài)下(無FBS)的HeLa對ssDNA-GNPs有較大的吞噬量。采用常規(guī)MTT法對PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs的細(xì)胞毒性進(jìn)行了考察。如圖3B所示，分別與5、25和50 μg/mL的ssDNA-GNPs孵育24 h后，HeLa細(xì)胞的活率均能夠達(dá)到90%以上，表明所合成的ssDNA-GNPs具有較低的細(xì)胞毒性， 對HeLa細(xì)胞的生長狀態(tài)影響較小。

圖3 (A)不同條件下HeLa細(xì)胞對PolyG1-GNPs及PolyG2-GNPs的吞噬量; (B)PolyG1-GNPs及PolyG2-GNPs的細(xì)胞毒性。Fig.3 (A) Cellular internalization amounts of PolyG1-GNPs and PolyG2-GNPs by HeLa cells under different experimental conditions; (B) cytotoxicity test of G1-GNPs and PolyG2-GNPs

3.3 ssDNA-GNPs在細(xì)胞中的分布

GNPs的紫外-可見吸收光譜與其聚集狀態(tài)密切相關(guān)。為了考察HeLa細(xì)胞作用后ssDNA-GNPs膠體穩(wěn)定性，收集了細(xì)胞內(nèi)吞的ssDNA-GNPs并進(jìn)行紫外-可見吸收光譜測定。如圖4A所示， PolyG1-GNPs的顏色由紅色變?yōu)樽仙?，SPR峰由523 nm紅移至537 nm，并在635 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰，表明PolyG1-GNPs發(fā)生了聚集。同樣條件下，PolyG2-GNPs的顏色和特征光譜均未發(fā)生顯著變化。這表明PolyG2-GNPs在細(xì)胞中的穩(wěn)定性優(yōu)于PolyG1-GNPs。這一現(xiàn)象可能是由于具有G四鏈體二級結(jié)構(gòu)的PolyG2對DNA酶的穩(wěn)定性優(yōu)于線性的PolyG1導(dǎo)致的。如圖4B所示，ssDNA-GNPs主要分布于溶酶體中， 并且PolyG1-GNPs在溶酶體中量大于PolyG2-GNPs。另外，PolyG2-GNPs在細(xì)胞內(nèi)的分散性優(yōu)于PolyG1-GNPs。TEM結(jié)果與PolyG1-GNPs 和 PolyG2-GNPs的紫外-可見吸收光譜分析一致。

圖4 (A)細(xì)胞吞噬的PolyG1-GNPs 和 PolyG2-GNPs的紫外-可見吸收光譜圖，插圖為PolyG1-GNPs (上) 和 PolyG2-GNPs(下)照片; (B)PolyG1-GNPs 和(C) PolyG2-GNPs細(xì)胞TEM分析。ssDNA-GNPs在細(xì)胞內(nèi)的分布如箭頭所示Fig.4 (A) UV-vis absorption spectra of PolyG1-GNPs and PolyG2-GNPs after interaction with HeLa cells, the inset of (A) is the digital photographs of PolyG1-GNPs (up) and PolyG2-GNPs (bottom); TEM images of (B) PolyG1-GNPs and (C) PolyG2-GNPs in HeLa cell. The cellular dispersed ssDNA-GNPs are indicated by arrows

4 結(jié) 論

兩種不同構(gòu)型且含富含G堿基ssDNA修飾的GNPs與HeLa相互作用的比較結(jié)果表明，DNA的二級結(jié)構(gòu)能夠影響ssDNA-GNPs與細(xì)胞的相互作用。盡管細(xì)胞對ssDNA-GNPs的內(nèi)吞均與能量相關(guān)，但含有G四鏈體二級結(jié)構(gòu)的ssDNA能夠促進(jìn)細(xì)胞對ssDNA-GNPs的內(nèi)吞，并且其所修飾的GNPs在細(xì)胞內(nèi)具有較好的分散性與穩(wěn)定性。本研究為設(shè)計(jì)高效ssDNA-GNPs納米探針/藥物載體提供了新思路。