納升液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜研究不同分離方法對(duì)唾液外泌體蛋白質(zhì)組的影響

曾瓊蘭 吳 利 李水明 王 勇*

1(深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060)2(深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060)

1 引 言

外泌體是一種直徑為30～100 nm的脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)杯狀[1]，存在于血液、尿液和唾液等多種體液中[2]，包含DNA片段、蛋白質(zhì)、mRNA和microRNA等物質(zhì)[3]。越來越多的證據(jù)表明，宿主細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，可以作為生物指標(biāo)進(jìn)行研究[4～6]。Rabinowits等[7]基于全基因組表達(dá)檢測(cè)，提出外泌體miRNA可以作為肺癌的診斷標(biāo)記之一。另外，有研究者認(rèn)為外泌體功能包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、移除不需要的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞間病原體的轉(zhuǎn)移，利用這一途徑的一種病原體是朊病毒，它是一種傳染性顆粒，負(fù)責(zé)傳染性神經(jīng)退行性疾病[8]。Street等[9]在人腦脊液中鑒定到外泌體，并且認(rèn)為其可能是一些腦神經(jīng)失調(diào)疾病擴(kuò)散發(fā)展的病因，例如阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)。

唾液外泌體的分離方式包括超高速離心法[10]、密度梯度離心法[11]、凝膠過濾法[12,13]、免疫親和捕獲法[14]和基于聚合物的沉淀方法[15]等。其中凝膠過濾、密度梯度離心法耗時(shí)長，過程繁瑣; 免疫親和捕獲法由于有些標(biāo)記還未知，會(huì)導(dǎo)致外泌體產(chǎn)量較低; Zlotogorski-Hurvitz等[15]發(fā)現(xiàn)超高速離心(Ultracentrifugation，UC)和唾液外泌體試劑盒(ExoQuick，EQ)方法均能夠有效分離唾液外泌體。

外泌體分析目前多采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，而采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析的報(bào)道較少[14,16,17]，Gonazale-Begne等較早開展了唾液外泌體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析工作[10,13]，但所使用的唾液體積分別為30、35 mL，樣品需求量大，在臨床上難以實(shí)現(xiàn)。本研究組曾采用納升液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)唾液的多肽組學(xué)開展研究[18]。本研究采用Nano LC-MS探究唾液外泌體試劑盒(EQ)和超高速離心(UC)分離外泌體的效果及尿素緩沖液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌體蛋白質(zhì)的效果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EksigentnanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)、TripleTOF 5600 plus 高分辨質(zhì)譜儀、Protein Pilot 4.5軟件(美國 AB SCIEX公司); 真空冷凍干燥機(jī)、超純水儀(美國Thermo Scientific公司); C18反相色譜捕集柱(100 μm×3 cm, 3 μm, 15 nm, 美國Eksigent公司); C18反相色譜分析柱(75 μm ×15 cm, 3 μm, 12 nm, 美國Eksigent公司)。ekspertTMnanoLC 400納升級(jí)液相色譜(美國 AB SCIEX公司)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-98%乙腈; 所用試劑為質(zhì)譜純或優(yōu)級(jí)純，均購自美國Thermo Fisher公司; 唾液外泌體試劑盒(美國Invent Biotechnologies公司); BCA蛋白定量試劑盒和考馬斯亮藍(lán)法蛋白試劑盒(江蘇海門碧云天公司); RIPA裂解液(北京博凌科為生物科技有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1外泌體的分離將健康人的全唾液樣品在4℃以2600 g離心30 min，取上清液。(1)唾液外泌體試劑盒(EQ)方法 取0.6 mL唾液上清液置于管柱中， 室溫14000 g離心2 min，高粘度唾液樣品通過離心柱即可轉(zhuǎn)化為非粘稠樣品。取0.5 mL的上清液與外泌體沉淀試劑以2∶1的比例混合，4℃孵育過夜。然后在4℃，10000 g離心1 h。除去上清液，可見白色外泌體沉淀。使用高效非PEG配方的外泌體沉淀試劑，可從最少100 μL的唾液樣品中有效沉淀外泌體。(2)超高速離心(UC)方法 取2 mL的唾液上清液，用PBS以1∶1的比例稀釋唾液樣品，加入蛋白酶抑制劑混合物(Roche complete tablet，Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Science，Mannheim，德國)。在4℃下10000 g離心70 min。用PBS重懸沉淀，4℃下100000 g離心70 min，底部沉淀即為外泌體。

2.2.2透射電子顯微鏡表征EQ、UC方法得到的沉淀用PBS重懸，各取10 μL外泌體，置于銅網(wǎng)上，用乙酸雙氧鈾染色，干燥后用透射電子顯微鏡觀察。

2.2.3外泌體的破碎將EQ、UC方法得到的外泌體，分別用100 μL尿素緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl， 8 mol/L UREA，2 mol/L硫脲，1 mmol/L DTT，pH=7.5)、100 μL RIPA裂解液、100 μL SDS裂解液(4% SDS，100 mmol/L Tris，pH=7.6)重懸，分別加上5 μL的蛋白質(zhì)酶抑制劑混合物。RIPA裂解液重懸外泌體沉淀后，置于冰上10 min。尿素緩沖液重懸外泌體后，超聲處理5 min。SDS裂解液重懸外泌體后，95℃加熱10 min，超聲處理5 min，16500 g離心10 min，取上清液。

2.2.4一維SDS-PAGE電泳將外泌體蛋白質(zhì)與上樣緩沖液以一定的比例混勻，沸水浴5 min。加載到配制好的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳，使用預(yù)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品追蹤蛋白質(zhì)遷移，所得凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

2.2.5唾液外泌體蛋白質(zhì)的定量使用BCA試劑盒測(cè)量用SDS裂解液和RIPA裂解液重懸的外泌體蛋白質(zhì)濃度。尿素緩沖液重懸的外泌體使用考馬斯亮藍(lán)染色Brodford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

2.2.6唾液外泌體蛋白質(zhì)酶切步驟分別取10 μg外泌體蛋白質(zhì)，采用Filter-aided proteome preparation (FASP)方法[19]，經(jīng)還原烷基化，按照蛋白質(zhì)-胰酶(40∶1,m/m)的比例加胰酶，在37℃水浴中放置過夜，酶切溶液冷凍干燥。

2.2.7納升液相色譜-TripleTOF質(zhì)譜分析將凍干的多肽樣品用流動(dòng)相A 溶解。在線 Nano-RPLC 液相色譜在EksigentnanoLC-UltraTM2D 系統(tǒng)上進(jìn)行，樣品以2 μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上(100 μm ×3 cm, 3 μm, 15 nm)，以2 μL/min流速?zèng)_洗脫鹽10 min。分析柱為C18反相色譜柱(75 μm×15 cm, 3 μm, 12 nm)，梯度洗脫: 0～42 min, 5%～25% B; 42～56 min, 25%～40% B; 56～64 min, 80% B; 64～70 min, 5% B。質(zhì)譜分析采用TripleTOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX) 結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源(AB SCIEX)，噴霧電壓2. 4 kV，氣簾氣壓30 psi，霧化氣壓5 psi，加熱溫度150℃，一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms，每次IDA循環(huán)下最多采集35個(gè)電荷為2+～8+，且單秒計(jì)數(shù)大于100的二級(jí)圖譜，每張二級(jí)圖譜的累積時(shí)間為80 ms。每次循環(huán)時(shí)間固定為2.5 s。

2.2.8數(shù)據(jù)分析采集到的質(zhì)譜原始wiff圖譜文件，采用Protein Pilot Software v.4.5(AB SCIEX,USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)加工處理和檢索分析，數(shù)據(jù)庫為uniprot庫中的Homo sapiens人種專一數(shù)據(jù)庫(包含20210條蛋白質(zhì)序列，2015年1月2日下載)，檢索參數(shù)設(shè)置為胰蛋白酶酶切、磷酸化強(qiáng)調(diào)和生物學(xué)修飾，檢索方式為徹底分析，假陽性率控制為1% FDR。

2.2.9生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)聚類分析在FunRich(http://www.funrich.org/)軟件進(jìn)行分析，可以分析蛋白質(zhì)參與的通路、細(xì)胞功能和細(xì)胞成分等。

3 結(jié)果與討論

3.1 唾液外泌體的形態(tài)特征

使用透射電子顯微鏡觀察UC和EQ方法所富集到的外泌體的形狀。如圖1所示，A圖和B圖視野中的外泌體直徑為30～100 nm，呈現(xiàn)杯狀的脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，說明UC和EQ這兩種方法分離的外泌體形態(tài)無明顯差異。

圖1 使用UC方法從唾液中分離的外泌體(A)和使用EQ方法從唾液中分離的外泌體 (B) 的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrographs of exosomes isolated from saliva by ultracentrifugation (UC) (A) and ExoQuick (EQ) method (B)

3.2 一維 SDS-PAGE分離唾液和外泌體蛋白質(zhì)的電泳條帶分析

圖2 一維SDS-PAGE分離唾液和外泌體蛋白質(zhì)條帶Fig.2 Saliva and exosome protein bands with one dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)(1)UC+UREA方法; (2)UC+SDS方法; (3)UC+RIPA方法; (4)EQ+UREA方法; (5)EQ+SDS方法; (6)EQ+RIPA方法; (7)全唾液; (8)EQ唾液(1) UC+UREA method; (2) UC+SDS method; (3) UC+RIPA method; (4) EQ+UREA method; (5)EQ+SDS method; (6)EQ+RIPA method; (7) Whole saliva; (8) EQ saliva

比較了UC和EQ方法對(duì)唾液外泌體的分離效果以及尿素緩沖液、RIPA裂解液、SDS裂解液對(duì)外泌體蛋白質(zhì)的提取效果，每種方法重復(fù)3次，尿素緩沖液破碎外泌體的方法用“UREA”表示，“RIPA”表示RIPA裂解液，“SDS”表示SDS裂解液。本研究的6種方法組合分別是：UC+UREA、UC+RIPA、UC+SDS、EQ+UREA、EQ+RIPA、EQ+SDS。

唾液和外泌體蛋白質(zhì)的1D SDS-PAGE如圖2所示，泳道1～6分別為UC+UREA、UC+SDS、UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+SDS和EQ+RIPA方法所富集的外泌體蛋白; 泳道7為唾液分離的蛋白; 泳道8為唾液外泌體試劑盒方法富集外泌體步驟(2)離心所得的不粘稠唾液分離的蛋白，標(biāo)記為EQ唾液。在49～63 kDa范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)，泳道1、2、3和泳道4、5、6、7、8的條帶有顯著的明暗度差異，該范圍主要是唾液淀粉酶[20]，即UC和EQ方法均未能除去唾液淀粉酶; 前者經(jīng)過差速離心，去除唾液淀粉酶的效果優(yōu)于后者，但UC法特異性減少唾液淀粉酶，且所有蛋白質(zhì)的回收率均較低，均需進(jìn)一步分析。

3.3 蛋白質(zhì)含量和數(shù)目的重現(xiàn)性分析

根據(jù)Brodford法和BCA定量分析結(jié)果與質(zhì)譜分析結(jié)果分析UC+UREA、UC+RIPA、UC+SDS、EQ+UREA、EQ+RIPA和EQ+SDS方法提取到的外泌體蛋白質(zhì)含量和數(shù)目，如表1所示，蛋白質(zhì)含量為Brodford法或BCA定量結(jié)果，蛋白質(zhì)數(shù)目是質(zhì)譜鑒定結(jié)果。這6種方法蛋白質(zhì)含量的RSD(n=3)分別為9.7%、1.8%、6.5%、1.7%、3.7%和4.8%，蛋白質(zhì)數(shù)目的RSD(n=3)分別為7.0%、2.1%、71.7%、1.4%、9.0%和15.8%。EQ+UREA的RSD值均最低，分別是1.7%、1.4%，重復(fù)性最佳。

表1 6種方法提取的外泌體蛋白質(zhì)含量和數(shù)目

Table 1 Detection results of protein content and number of exosomes by six methods

方法Method序號(hào)Number蛋白質(zhì)含量Protein content(μg)蛋白質(zhì)含量平均數(shù)Average相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(含量)RSD(%, n=3)蛋白質(zhì)數(shù)目#Protein相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(數(shù)目)RSD(%, n=3)蛋白質(zhì)總數(shù)#Protein111.1122UC+UREA212.512.69.71297.0169314.1144141.5166UC+RIPA241.140.81.81642.1210339.8158123.523UC+SDS221.821.86.51171.725320.12162.4151EQ+UREA263.962.51.71531.4194361.2148143.4176EQ+RIPA240.842.93.71519.0204344.6188139.1124EQ+SDS235.141.14.812015.8187349.1168

由1D SDS-PAGE分離唾液和外泌體蛋白質(zhì)的電泳條帶圖(圖2)可見，6種方法均提取到了蛋白質(zhì)。從表2可知，UC+SDS方法的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)數(shù)目分別是23、12和2，RSD為71.7%，EQ+SDS方法的為124、120和168，RSD為15.8%，說明使用SDS裂解液提取外泌體蛋白質(zhì)對(duì)后續(xù)的質(zhì)譜分析結(jié)果影響很大。Wi?niewski等[19]使用SDS裂解液處理培養(yǎng)的細(xì)胞、小鼠肝臟和腦組織，結(jié)合FASP法，能夠有效使用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，但本研究提示SDS裂解法不適于外泌體蛋白質(zhì)的分析。

表2 6種方法的外泌體蛋白質(zhì)的LC-MS/MS鑒定結(jié)果

Table 2 Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of proteins of exosomes by six methods

方法Method序號(hào)Number蛋白質(zhì)數(shù)目#Protein肽段數(shù)目#Peptides多肽總離子強(qiáng)度Intensity (lgΣI)UC+UREAUC+RIPAUC+SDSEQ+UREAEQ+RIPAEQ+SDS112212617.32212915157.40314415877.47116639847.48216439967.44315839937.381231535.59211985.043243.92115121787.57215322827.63314822057.52117642077.33215139277.18318847737.19112427887.29212025097.28316827887.49

3.4 6種方法的蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)數(shù)目、肽段數(shù)目和多肽總離子強(qiáng)度的顯著性分析

EQ和UC方法處理的唾液樣品體積分別為0.5和2.0 mL。蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果如圖3A所示， EQ方法的蛋白質(zhì)含量均比UC高，UREA和SDS方法均存在顯著差異。從表1和圖3A可知，EQ+UREA方法得到的蛋白質(zhì)含量最高(62.5 μg)，與EQ+RIPA和EQ+SDS相比均存在顯著差異。

分析6種方法的蛋白質(zhì)數(shù)目和肽段數(shù)目，如表2和圖3所示，EQ方法的蛋白質(zhì)數(shù)目和肽段數(shù)目均高于UC方法。EQ+RIPA和UC+RIPA方法在蛋白質(zhì)數(shù)目和肽段數(shù)目上無顯著差異，EQ+UREA和UC+UREA、EQ+SDS和UC+SDS存在顯著差異。表明EQ富集外泌體的效果優(yōu)于UC。

圖3 6種方法分離提取的蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)數(shù)目、肽段數(shù)目和多肽總離子強(qiáng)度的顯著性分析Fig.3 Significant analysis of protein content, number of protein and peptides, total peptide ionic intensity by six methods (***p<0.001，**p<0.01，*p<0.5)

圖4 UC+UREA、UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+RIPA 4種方法的外泌體來源的蛋白質(zhì)的基因比率Fig.4 Genetic ratio of exosome-derived proteins of UC+UREA、UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+RIPA methods

比較EQ+UREA和EQ+RIPA的結(jié)果，EQ+UREA和EQ+RIPA的蛋白質(zhì)數(shù)目不存在顯著差異，但肽段數(shù)目存在顯著差異。EQ+UREA和EQ+RIPA的3次重復(fù)測(cè)定的肽段數(shù)的平均值分別為2222和4302; 在RIPA裂解液提取的外泌體蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)Alpha-amylase 1、Ig alpha-1 chain C、Ig alpha-2 chain C region、Deleted in malignant brain tumors 1 protein、Polymeric immunoglobulin receptor、Mucin-5B所對(duì)應(yīng)的肽段數(shù)目較多，EQ+RIPA和EQ+UREA方法中屬于以上7種蛋白質(zhì)的肽段數(shù)目分別為56.82%和44.33%。即在EQ+RIPA中約1857個(gè)多肽屬于除以上7種蛋白質(zhì)的其它蛋白質(zhì)，在EQ+UREA中約1237個(gè)多肽屬于其它蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，EQ+RIPA方法雖然檢測(cè)的肽段數(shù)目多，但并未增加蛋白質(zhì)數(shù)目。從表2和圖3D可知，EQ+UREA方法的多肽總離子強(qiáng)度最強(qiáng)，與EQ+RIPA存在顯著性差異。

3.5 UC+UREA、UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+RIPA方法檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的GO分析

如圖4所示，UC+UREA、UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+RIPA方法的唾液外泌體來源的蛋白質(zhì)的基因比分別為84.09%、83.89%、82.82%、90.12%。 這4種方法均能夠很好地富集到外泌體蛋白質(zhì)。Ogawa等[12]鑒定到唾液外泌體的蛋白質(zhì)有187種， 用FunRich軟件對(duì)187種蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，起源于外泌體的蛋白質(zhì)有130種，基因比為69.52%。

使用RIPA裂解液提取外泌體蛋白質(zhì)有優(yōu)點(diǎn)，亦存在不足，其操作方便，重懸外泌體后，置于冰上10 min即可。 試劑盒分離唾液外泌體與RIPA裂解液破碎外泌體的方法聯(lián)用，鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目為204，90.12%的蛋白質(zhì)來源于唾液外泌體，優(yōu)于EQ+UREA方法。蛋白質(zhì)定量結(jié)果表明，EQ+RIPA方法的蛋白質(zhì)含量為42.9 μg，EQ+UREA方法為62.5 μg。EQ+RIPA方法的蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)數(shù)目的RSD值分別為3.7%和8.9%，EQ+UREA方法分別為1.7%和1.4%。因此，EQ+UREA方法的實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性優(yōu)于EQ+RIPA方法。目前尚未有報(bào)道使用RIPA裂解液提取外泌體蛋白質(zhì)。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，RIPA裂解液用于樣品蛋白質(zhì)的提取，使某些蛋白質(zhì)丟失，Ngoka等[21]采用質(zhì)譜平行對(duì)比了乳腺癌 RIPA 可溶組分和不可溶組分的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)不溶于RIPA的蛋白質(zhì)可溶于UREA，蛋白質(zhì)平均分子量比RIPA可溶性組分高 60%，即許多高分子量蛋白質(zhì)被丟失在 RIPA 不可溶組分中。

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次，UC+UREA、UC+RIPA、UC+SDS、EQ+UREA、EQ+RIPA、EQ+SDS的3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)目分別是122、129、144; 166、164、158; 23、12、2; 151、153、148; 176、151、188; 124、120、168。UC+RIPA、EQ+UREA、EQ+RIPA得到的外泌體蛋白質(zhì)種類無顯著差異，但顯著高于其它方法。外泌體蛋白質(zhì)含量平均值分別為12.6、40.8、21.8、62.5、42.9和41.1 μg。EQ+UREA方法處理0.5 mL 唾液樣品得到的外泌體蛋白含量最高。綜上可知，EQ+UREA方法是富集外泌體和提取外泌體蛋白質(zhì)的最佳方案。

4 結(jié) 論

采用納升液相色譜-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)唾液外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立了一種快速、樣品用量少、 重復(fù)性好的唾液外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，唾液外泌體試劑盒富集外泌體的效果優(yōu)于超高速離心方法，尿素緩沖溶液使得外泌體破膜后的實(shí)驗(yàn)更加穩(wěn)定， 重復(fù)性更好，是篩選疾病外泌體生物標(biāo)志物有效方法。

致謝： 感謝深圳大學(xué)西麗校區(qū)測(cè)試中心的支持。