芹菜根細胞的超微結構與鉛形態(tài)特征分析

柳 檢 羅立強

(國家地質實驗測試中心， 北京 100037)

1 引 言

細胞是維持植物正常生命活動和功能的基本單元，是植物吸收和運輸元素的必經(jīng)之地，也是植物體內生物化學反應的主要場所。通常，重金屬(HMs)能夠通過細胞膜上的滲透通道、 ZIP等轉運蛋白、 低特異性Ca2+、 Mg2+、 Fe2+和Zn2+等離子通道進入植物細胞，隨后對細胞產(chǎn)生植物毒性[1～3]。在細胞水平上，HMs的植物毒性與細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的破壞以及電子傳遞鏈的斷裂等密切相關[4]。重金屬脅迫會刺激葉綠體、 線粒體和過氧化物酶產(chǎn)生氧化應激反應，并過度生產(chǎn)和積累活性氧(ROS)，ROS通過損害植物細胞的生物聚合物，進而引起細胞的功能障礙，過量的ROS還會激活質膜的Ca2+、 K+離子通道和膜聯(lián)蛋白、 催化Ca2+信號傳導、 K+滲漏，觸發(fā)細胞程序性死亡[5]。但另一方面，植物細胞也會采取一些相關的應激機制來抵消HMs毒性。例如，通過在細胞內形成植物螯合肽(PCs)或金屬硫蛋白(MTs)，使游離的HMs與PCs或MTs形成螯合物，從而將其從敏感位置去除，或將HMs區(qū)隔至液泡[6]。因此，從細胞層級上研究毒性元素對其超微結構的破壞和元素形態(tài)的轉化機制，對于揭示細胞生物過程和解毒與耐受機理具有十分重要的科學價值，這也是當前的研究熱點之一。

近年來，植物細胞與重金屬相互作用的研究主要聚焦于以下4個方向: (1)植物細胞吸收重金屬的共質體吸收途徑和細胞間隙的質外體途徑[7]； (2)細胞膜上轉運重金屬的陽離子通道和轉運蛋白的表征與鑒定[2,3]； (3)植物細胞對重金屬的防御機制，如細胞超微結構改變[8]、 刺激細胞生產(chǎn)活性氧物質[9]等； (4)植物細胞或亞細胞中重金屬的分布和形態(tài)特征[10,11]。其中，在毒性元素Pb的植物細胞分布和形態(tài)研究方面主要有3類報道: 一是Pb與磷酸鹽絡合，形成磷酸鉛或磷氯鉛礦沉積在細胞壁[12,13]，或與植物螯合肽(PC)絡合，以Pb-PC形式區(qū)隔于液泡[14]； 二是Pb與納米羥磷灰石結合沉積于細胞壁和液泡，如水稻根細胞[15]； 三是直接以Pb納米顆粒(PbNPs)的形式沉積于細胞壁，如在水生蕨類植物的細胞壁中觀察到直徑為(17.2 ± 4.2) nm的PbNPs[16]。出現(xiàn)這些差異的原因可能是由于植物種類的不同[17]。目前，對植物中Pb的超微結構和形態(tài)分析的研究大多集中在野生Pb富集植物，而對可食用植物關注得較少[18,19]，尤其是蔬菜[15]。由于Pb以何種形式分布在植物細胞的位置決定了Pb被調動的潛力和產(chǎn)生植物毒性的高低，故開展植物組織和細胞內Pb的分布和形態(tài)轉化機制的探索，是揭示Pb與植物的作用過程和解毒機理的重要途徑。

本研究通過室內水培實驗模擬芹菜根對Pb的吸收過程，結合TEM-EDS和XANES技術，觀測芹菜根細胞超微結構和細胞內Pb分布，分析芹菜根、 莖和葉中Pb形態(tài)特征，從細胞層面上探索毒性元素對其超微結構的破壞和元素形態(tài)的轉化機制，從而揭示Pb脅迫下的細胞生物過程和解毒與耐受機理。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

X射線吸收近邊結構譜儀(XANES， 上海光源15U1)； LRH-GSI智能型人工氣候箱(韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司)； 超薄切片機(LEICA UC 6)； Hitachi H 9000高分辨透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

Na2HPO4·2H2O (分析純)、 無水乙醇和丙酮(北京化學試劑研究所)； 25% 戊二醛、 1% 鋨酸溶液和環(huán)氧樹脂(北京中鏡科儀技術有限公司)。Hoagland培養(yǎng)液所用試劑皆為分析純。XANES標樣: PbO、 PbSO4、 Pb(NO3)2、 Pb3O4、 2PbCO3·Pb(OH)2、 Pb(OH)2、 Pb(Ac)2·3H2O、 PbCO3均為國產(chǎn)分析純； Pb(C17H35COO)2為國產(chǎn)化學純； PbS為方鉛礦標準樣品(GBW07269)； Pb(SC16H33)2(美國Sigma公司)； C3H9ClPb(德國Ehrenstorfer公司)； Pb3(PO4)2和Pb5(PO4)3Cl(實驗室合成，并用XRD驗證[20])； Pb溶液參考物質由Pb(NO3)2分別與檸檬酸 (10 mmol/L Pb(NO3)2+100 mmol/L 檸檬酸鈉，pH 5.4)[21]、 富里酸(FA)(0.05 mol/L Pb(NO3)2+13.35 mg FA)[22]、 腐殖酸(HA)(0.3 mmol/L Pb(NO3)2+1 g/L HA， pH 5)[23]和谷胱甘肽(GSH)(1 mmol/L Pb(NO3)2+5 mmol/L GSH，pH 6)[24]絡合。

2.2 植物培養(yǎng)

芹菜(ApiumgraveolensL.)種子購于中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所,用0.07% NaClO浸泡30 min，再用蒸餾水沖洗3次后浸種5.5 h。挑選顆粒大小一致的種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，保持濾紙濕潤，并于培養(yǎng)箱中避光萌芽(溫度25℃，濕度50%)。萌芽7 d后見光長苗，待長出一對子葉時，置于1/2 Hoagland營養(yǎng)液(HNS，pH=6.0)中培養(yǎng)，條件為: 25℃，16 h/8 h (光照/黑暗)，光照強度4000 Lx。 HNS組成[25]: 1 mmol/L KH2PO4、 5 mmol/L KNO3、 5 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、 2 mmol/L MgSO4·7H2O、 46 μmol/L H3BO3、 6.7 μmol/L MnCl2·4H2O、 0.77 μmol/L ZnSO4·7H2O、 0.32 μmol/L CuSO4·5H2O、 0.11 μmol/L H2MoO4·H2O和20 μmol/L Fe-EDTA。至長出第二片真葉時，移苗至HNS中培養(yǎng)，每株苗用有孔的泡沫固定，使苗保持新芽向上，根浸在HNS中，培養(yǎng)至平均苗長15 cm，期間每3 d更換營養(yǎng)液。挑選長勢一致的芹菜進行Pb脅迫實驗，用兩種方式脅迫培養(yǎng)5 d: 一種用含1000 μg/mL Pb(Pb(NO3)2)的蒸餾水溶液； 另一種用含1000 μg/mL Pb(Pb(NO3)2)的Hoagland營養(yǎng)液。收獲的植株根于20 mmol/L EDTA-Na2浸泡15 min，再用自來水、 蒸餾水分別清洗3遍， 分根、 莖和葉3部分冷凍干燥后，用于XANES分析。

用同樣的培養(yǎng)方法，將芹菜苗置于300 μg/mL Pb(Pb(NO3)2)的Hoagland營養(yǎng)液中脅迫培養(yǎng)7 d，再用同樣的清洗方法洗凈根系，用于TEM-EDS分析。

2.3 TEM-EDS分析根細胞中Pb的分布

用雙面刀片從根尖處切取2 mm長的根段，離體樣品迅速浸入2.5%戊二醛中固定2～4 h，再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次20 min，隨后轉移至1%鋨酸中固定過夜。接著用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次后，用30%、 50%、 70%、 80%和95%乙醇逐級脫水，然后在100%乙醇中脫水3次。 用丙酮置換乙醇3次后，依次用丙酮與樹脂2∶1、 1∶1和1∶3比例滲透處理，每次2～3 h，再用純樹脂包埋過夜。放入60℃烘箱聚合24 h后，使用超薄切片機切成60 nm厚的薄片，在高分辨透射電子顯微鏡下觀察、 照相，并進行能譜分析，能譜測量計數(shù)時間為30 s，每一個細胞的微區(qū)檢測至少3次。

2.4 芹菜根、 莖和葉的XANES分析

芹菜的Pb-L3邊XANES實驗在上海同步輻射BL15U1線站完成。冷凍干燥的芹菜根、 莖和葉研磨至粒徑<74 μm，壓制成直徑為10 mm的樣片在常溫常壓下進行測試。測試前用Pb箔進行Pb-L3邊(13035 eV)能量校準。儲存環(huán)能量為3.5 GeV，環(huán)電流為250～260 mA。應用Si(111)雙晶單色器獲得的能量分辨率為0.05 eV，光路采用K-B鏡聚焦，并使用Si漂移探測器檢測X射線熒光信號。實驗使用的光斑尺寸為300 μm×300 μm，采譜范圍為12.985～13.235 keV，能量步長為0.5 eV。標樣中Pb含量高，在透射模式下測定，樣品中Pb含量較低，在熒光模式下測定。

2.5 XANES譜圖的數(shù)據(jù)處理

采用Athena軟件進行數(shù)據(jù)處理，主要通過未知樣品與標準樣品的線性擬合獲得元素的組分(形態(tài))信息。在線性擬合前，還需進行一些關鍵的步驟，如能量漂移校正、 標樣與未知樣的統(tǒng)一歸一化、 主成分分析(PCA)、 重建數(shù)據(jù)和目標轉換(TT)等，這些步驟也常被忽略，從而導致擬合的結果差異很大， 從而影響相關的機理闡釋。本實驗對6個植物樣品的Pb L3-XANES譜圖進行PCA步驟，發(fā)現(xiàn)樣品中PCA提取的第一個組分對總體變異的貢獻為99.22%， 第二和三組分分別占0.46%和0.24%，而第四組分僅占0.07%，因此植物樣品主要由3種成分組成。隨后，設置主成分個數(shù)，對未知樣進行重建數(shù)據(jù)，并選擇Pb標樣進行目標轉換，通過最大殘渣的絕對值(|RMD|)判斷含有該標樣的可能性。當|RMD|≤5%時， 表明該標樣存在的可能性最大； 當5%<|RMD|≤10%時，表明可能存在該標樣； 當10%<|RMD|≤15%時，表明存在該標樣的可能性不大； 當15%<|RMD|時，表明不可能存在該標樣。最后，讓未知樣與初步判斷的標樣進行線性擬合，獲得每種標樣的所占比例，并通過評估因子R-factor 進行評估，R-factor根據(jù)公式(1)計算， 其值越小，表明擬合誤差越小，結果越準確[26]。

R-factor=∑((y-yfit)2)/∑(y2)

(1)

式中，y為樣品歸一化后的吸收系數(shù)，yfit為標樣擬合后的吸收系數(shù)。

3 結果與討論

3.1 芹菜根細胞的超微結構損傷和Pb的分布

Pb脅迫會損傷植物根細胞的細胞壁和質膜結構。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察對照組的根尖細胞，發(fā)現(xiàn)細胞壁的表面清晰、 光滑和連續(xù)，而且細胞與細胞緊密相連，無細胞間隙(圖1A)。當芹菜根暴露于300 μg/mL Pb2+環(huán)境中，根尖細胞壁出現(xiàn)了明顯的增厚和變形現(xiàn)象，而且質膜也變得粗糙或模糊(圖1B、 1C)。同時，Pb脅迫下根尖細胞之間還出現(xiàn)了細胞間隙(圖1D)，這與Pb暴露下白楊根尖細胞的變化一致[27]。細胞超微結構的變化是由于Pb脅迫使細胞壁中形成了大量的能夠結合金屬離子的低甲酯化果膠，這種果膠的堆積使細胞壁變厚[27]，同時Pb2+與膜蛋白結合使膜蛋白部分變性，從而改變了質膜的結構[28]。

在Pb暴露下，植物會驅使進入細胞內的Pb截留在特殊的細胞結構中。采用TEM觀察芹菜根尖細胞中Pb的分布，與對照組(圖1A)相比，Pb暴露組(圖1B～1D)的根細胞壁有大量晶體狀的黑色顆粒沉積，而根細胞質和細胞間隙基本無沉積。利用X射線能譜對比分析黑色顆粒處和細胞間隙中的特征元素，發(fā)現(xiàn)黑色顆粒處有Pb的特征峰(圖1E)，而細胞間隙和細胞質均無(圖1F)，表明根細胞壁能夠截留進入芹菜根細胞的Pb，從而減少Pb進入原生質體，進而降低Pb對植物細胞的毒害。對比圖1E和1F，黑色顆粒物中還存在磷元素的特征峰，而且氧元素的峰強度明顯高于細胞間隙的元素強度，表明黑色顆粒物中的Pb可能與磷酸鹽結合，但形成的Pb形態(tài)尚需進一步鑒定。TEM觀察到進入植物根部的Pb基本都以沉淀的形式截留在細胞壁，有研究報道Pb污染環(huán)境中生長的植物的地上部也有Pb的積累[29]，故植物根部應該還存在能被運輸至植物地上部的可遷移態(tài)鉛。

圖1 Pb在芹菜根尖細胞壁的沉積: (A)對照組根細胞和 (B-D)Pb暴露組根細胞的透射電鏡圖； (E) 細胞壁沉積物和(F)細胞間隙的能量色散X射線光譜圖Fig.1 Deposition of Pb in the cell wall of celery root tips cells. Transmission electron micrographs of (A) control and (B-D) Pb exposed root cells; (E) and (F)Results of energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) analyses performed at the positions indicated by the red circles

3.2 芹菜根中Pb的形態(tài)特征

圖2 Pb標樣對芹菜根、 莖和葉中Pb-L3 XANES譜圖的擬合Fig.2 Pb L3-edge X-ray absorption near edge spectra (XANES) of organs of celery, Pb(NO3)2 and their linear combination fitting results (dashed lines)

表1 Pb(NO3)2的營養(yǎng)液培養(yǎng)的芹菜根、 莖和葉中Pb形態(tài)的線性擬合結果

Table 1 Linear combination fitting results of root, stem and leaf of celery planting in Hogland nutrient solution with Pb(NO3)2

樣品Sample化合物1 Compound 1(%, w/w)化合物2 Compound 2(%, w/w)化合物3 Compound 3(%, w/w)評估因子R-factor根 RootPb5(PO4)3Cl62.7Pb(Ac)2·3H2O37.3-0.000084莖 StemPb5(PO4)3Cl65.6Pb(Ac)2·3H2O34.4-0.000129葉 LeafPb(C17H35COO)247.8Pb5 (PO4) 3Cl36.7Pb(Ac)2·3H2O15.50.000212

3.3 芹菜莖和葉中Pb的形態(tài)特征

芹菜莖中Pb的形態(tài)與根部基本相似。XANES擬合結果顯示，莖中Pb形態(tài)也主要為Pb5(PO4)3Cl，其次是Pb(Ac)2·3H2O(表1)，表明Pb從根部遷移至莖部未發(fā)生形態(tài)的轉化。莖中鑒定出的兩種Pb形態(tài)，其中磷氯鉛礦的溶解度比其它鉛礦物至少低44個數(shù)量級[32]，而只有Pb(Ac)2·3H2O能夠被植物調動。這是由于醋酸是含有一個羧基的低分子有機酸，其與Pb結合形成的絡合物易于在植物體內遷移[33]。在大多數(shù)植物中也發(fā)現(xiàn)了Pb-Ac絡合物，如田菁[34]、 小麥[35]和擬南芥[36]，表明可遷移的Pb-Ac是植物向地上部運輸Pb的主要形式。

芹菜葉對Pb形態(tài)的轉化功能與其它器官(莖、 根)不同。Pb-Ac絡合物經(jīng)莖部運輸至葉片后，其形態(tài)發(fā)生了轉化。芹菜葉片中Pb主要以Pb(C17H35COO)2的形式存在，其比例為47.8%，其次是36.7% Pb5(PO4)3Cl和15.5% Pb(Ac)2·3H2O(表1)。XANES形態(tài)的準確識別強烈依賴標樣，雖然本研究選用了18種Pb標樣，但植物樣品比較復雜，使植物中大分子有機鉛的準確鑒定仍存在困難。本結果初步表明，Pb-Ac絡合物轉運至葉片后，在葉片中轉化為分子量較大的有機鉛積累。據(jù)報道，植物體內帶負電的羧基官能團通過螯合作用與游離的Pb結合后，形成的大分子有機鉛是植物對Pb的一種積累和耐受機制[37]。有研究發(fā)現(xiàn)，在玉米根中也存在Pb(C17H35COO)2[38]。除了大分子有機酸鉛外，Pb5(PO4)3Cl也是生物學上重要的化合物，它是一種極穩(wěn)定的磷酸鹽化合物(Ksp=10——84.4)[39]，植物體內這種穩(wěn)定的難溶物能夠去除可遷移性的Pb，從而提高植物對Pb的耐受性[24]。因此，大分子有機鉛和Pb-磷酸鹽應是植物葉片貯存和耐受Pb的機制。

3.4 植物中Pb-磷酸鹽的來源及形成機制

Pb是植物非必需元素，植物體內無專一運輸Pb的膜轉運蛋白質[40]。毒性元素可通過磷酸鹽轉運蛋白(Pi)吸收進入植物，如As(Ⅴ)[41]。由上可知，芹菜根、 莖和葉中均形成了Pb-磷酸鹽(Pb5(PO4)3Cl)，而且Pb-磷酸鹽也是土壤中Pb的主要存在形態(tài)之一[39]。為探究芹菜中的Pb-磷酸鹽是根際環(huán)境中Pb-P結合后依靠Pi進入植物的，還是根際Pb2+被根吸收后在植物體內轉化成Pb5(PO4)3Cl，將芹菜暴露于Pb(NO3)2的水溶液中培養(yǎng)，鑒定植物體內是否有形成Pb-磷酸鹽。如表2所示，在無P的根際環(huán)境中，Pb2+被芹菜吸收后，在根、 莖和葉中均有形成Pb5(PO4)3Cl，表明芹菜體內的Pb5(PO4)3Cl來源于植物自身的生物合成，而不是來源于外界根際環(huán)境。植物中Pb3(PO4)2的形成是一種植物響應外界Pb脅迫的解毒機制，其來源為Pb與細胞中多磷酸酯酶釋放的磷酸鹽形成的共沉淀[42]，但是植物中Pb5(PO4)3Cl的形成是受解毒機制驅動或者是Pb、 P和Cl局部過飽和的結果[24]，目前尚不清楚。

表2 Pb(NO3)2的蒸餾水溶液培養(yǎng)的芹菜根、 莖和葉中Pb形態(tài)的線性擬合結果

Table 2 Linear combination fitting results of root, stem and leaf of celery planting in distilled water solution with Pb(NO3)2

樣品Sample化合物1Compound 1 (%, w/w)化合物2Compound 2 (%, w/w)化合物3Compound 3 (%, w/w)評估因子R-factor根 RootPb(C17H35COO)273.5Pb5(PO4)3Cl19.1Pb(Ac)2·3H2O7.40.000079莖 StemPb5(PO4)3Cl69.3Pb(Ac)2·3H2O30.7-0.000120葉 LeafPb5(PO4)3Cl50.7Pb(Ac)2·3H2O25.0Pb(C17H35COO)224.30.000157

4 結 論

本研究采用TEM-EDS和XANES分析技術，考察了芹菜根細胞內Pb的分布特征和植物體內Pb形態(tài)轉化過程，揭示了可食用蔬菜與Pb作用的細胞機制及Pb的吸收和轉運過程。研究發(fā)現(xiàn)，Pb脅迫會使芹菜根細胞壁明顯增厚和變形，而且質膜也會變得粗糙或模糊，同時進入細胞的Pb能夠以晶體狀的Pb-磷酸鹽沉積在細胞壁，以實現(xiàn)Pb的解毒和耐受。芹菜從根際微域吸收Pb的過程中，Pb形態(tài)發(fā)生了顯著地的改變，植物能夠將培養(yǎng)液中的無機鉛轉化為有機鉛形態(tài)，進入根部的Pb主要以Pb5(PO4)3Cl的形式沉積于細胞壁，僅少部分Pb以Pb-Ac形式向地上部運輸，至莖中以Pb5(PO4)3Cl的形式沉積，葉片以Pb(C17H35COO)2和Pb5(PO4)3Cl的形式儲存，這揭示了芹菜對Pb的吸收、 轉運和貯存機制，為準確評估食用蔬菜的健康風險提供了理論支撐。由于生物體的環(huán)境復雜，準確鑒定Pb形態(tài)還依賴合適的標樣，故還需尋找更多的標樣。關于植物對Pb的作用機理，未來還需借助其它分析手段在細胞層面探索植物細胞壁沉積Pb5(PO4)3Cl的形成機制。

致謝感謝上海光源14W1和BL15U1線站的黃宇營和李愛國老師在元素形態(tài)分析方面給予的指導與幫助； 感謝國家地質實驗測試中心的沈亞婷老師、 曾遠和孫曉艷在實驗中給予的幫助。