羚羊角塞特異性PCR鑒別方法研究

蔣超 金艷 袁媛 黃璐琦 趙玉洋

摘要 目的：為解決中藥羚羊角塞與羚羊角相比因失去“通天眼”等傳統(tǒng)鑒別特征而鑒別困難的問題，建立準確鑒別鑒定羚羊角塞的方法。方法：通過比對羚羊角塞基原動物賽加羚羊與其7種常見混偽品的細胞色素C氧化酶亞基I（Cytochrome coxidase I，COI）序列，根據(jù)差異位點設(shè)計出僅擴增賽加羚羊DNA的特異性鑒別引物。結(jié)果：進行PCR時，當退火溫度為64 ℃，循環(huán)數(shù)為33個時，僅羚羊角塞正品擴增獲得約300 bp大小的條帶，混偽品無條帶。結(jié)論：該方法可作為準確有效檢測待檢樣品是否來源于賽加羚羊的方法，用于羚羊角類樣品的DNA鑒別。

關(guān)鍵詞 特異性PCR；分子鑒定；羚羊角塞；中藥鑒定

Abstract Objective：To solve the problem of authentication difficulty of saigae tataricae cornu tampon due to loss of traditional identify features such as “Tongtianyan”，and to establish an accurate authentication method for saigae tataricae cornu tampon.Methods：Specific PCR primers for S.tatarica were designed based on cytochrome coxidase I （COI） sequences and the annealing temperature of PCR reaction conditions was optimized，which was performed to authenticate saigae tataricae cornu tampon and its 7 adulterants.Results：Only saigae tataricae cornu tampon could obtain a ～300 bp specific band in electrophoresis while the adulterants did not when the temperature was 64 ℃ and 33 cycle number.Conclusion：Specific PCR could accurately and effectively authenticate the biological origin of sample is S.tatarica or not.

Key Words Specific PCR； Molecular authentication； Saigae tataricae cornu tampon； TCM authentication

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.003

中藥羚羊角為牛科動物賽加羚羊（Saiga tatarica Linnaeus）的角，角根所具骨質(zhì)結(jié)構(gòu)稱羚羊角塞。羚羊角及羚羊角塞均為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有平肝息風(fēng)、清肝明目、散血解毒的功效，臨床效果顯著。

近年來，由于羚羊角類藥材（包括羚羊角、羚羊角塞、羚羊角鎊片等）資源儲量下降，導(dǎo)致常出現(xiàn)偽品混入及跨國走私等現(xiàn)象。羚羊角塞基原物種賽加羚羊主要分布于我國及一些中亞國家，但分布于我國新疆地區(qū)的賽加羚羊已因過度捕獵而滅絕，而分布于國外的種群也因盜獵等原因在短短幾年內(nèi)數(shù)量下降了90%，致使藥用資源嚴重不足[1-2]。山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、普氏原羚（Procapra przewalskii）、藏原羚（Procapra picticaudata）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、蒙原羚（Procapra gutturosa，黃羊）、鵝喉羚（Gazella subgutturosa，長尾黃羊）等動物的角常作為賽加羚羊角類的民間代用品[3]，但其療效尤其是退熱效果與正品羚羊角具有明顯差異[4]，不可混用。然而，羚羊角類藥材主要為蛋白質(zhì)和骨質(zhì)成分，缺乏用于作為標記區(qū)分的小分子次生代謝物，使用顯微鑒別、薄層色譜、蛋白電泳等方法鑒定均有一定困難，大多數(shù)只能區(qū)分羚羊角和山羊角等少數(shù)幾種角類，而羚羊角塞因僅剩骨質(zhì)部分，已丟失羚羊角類傳統(tǒng)鑒別特征“合把”和“通天眼”，性狀鑒別更為困難。需要建立更加快速、準確的方法來鑒定羚羊角塞與其混偽品。

特異性PCR鑒別是一種根據(jù)物種品間差異序列設(shè)計特異性引物從而專一性鑒別是否為所要求生物基原的DNA分子檢測方法。該技術(shù)因其客觀、準確，可為中藥材的鑒定提供準確的結(jié)果。2010年版《中華人民共和國藥典》收載了使用特異性PCR技術(shù)鑒別動物類藥材蘄蛇、烏梢蛇飲片的方法，成為世界上首個中藥、天然藥分子鑒定國家標準，其準確性得到了充分驗證[5-6]。目前已有多種動、植物藥材成功應(yīng)用特異性PCR技術(shù)進行基原鑒定，其對保障藥材市場藥品安全、準確具有重要的作用[7-11]。雖然目前也有使用特異性PCR方法鑒別羚羊角類藥材的報道，但多只針對山羊角、黃羊角等2～3個物種，并未囊括鵝喉羚、水牛角等最為常見的偽品[12-13]。本研究通過比對羚羊角塞基原動物賽加羚羊及其7種常見混偽品線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（Cytochrome Coxidase I，COI）基因片段序列，設(shè)計了一對僅擴增賽加羚羊DNA的特異性鑒別引物，通過使用試劑盒快速提取DNA，經(jīng)優(yōu)化特異性PCR反應(yīng)程序進行快速擴增，能準確鑒別羚羊角塞及其混偽品，為實現(xiàn)羚羊角類藥材的特異性DNA分子鑒別提供技術(shù)保障。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 PCR儀：ABI 9700（Life公司）、VeritiTM（Life公司）、TC-96（杭州博日公司）以及S1000型（Bio-Rad公司）；5810 R型高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries公司）；PowerPacTM型電泳儀（Bio-Rad公司）；HE99X-15-1.5型電泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司）。

1.2 試劑 不同特性Taq DNA聚合酶：r Taq（Takara公司生產(chǎn)）、Trans Taq（TransGen公司生產(chǎn)）、Vazyme Taq plus（Vazyme公司生產(chǎn)），中度保真的Ex Taq（Takara公司生產(chǎn)）、HS Taq（Takara公司生產(chǎn)），高度保真的SpeedSTAR HS Taq聚合酶（Takara公司生產(chǎn)）進行試驗；瓊脂糖（Promega公司生產(chǎn)）；溴化乙啶（Fluka公司生產(chǎn)）；DL2000 DNA Marker（Takara公司生產(chǎn)）；10000×SYBR（Invitrogen公司生產(chǎn)）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分析樣品 采集來自于不同產(chǎn)地的羚羊角塞正品及常見混偽品共52份材料進行特異性PCR鑒別研究。樣品采自安徽亳州、廣西玉林、河北安國等藥材市場，憑證標本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 引物設(shè)計

2.1.1 序列比對 從NCBI數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information）中下載羚羊角塞的基原物種賽加羚羊（KF73209.1、KC679014.1、KC679010.1）及其可能的混偽品基原物種綿羊（KT750038.1）、山羊（JN245994.1）、普氏原羚（KC679051.1）、藏原羚（KC679009.1）、藏羚羊（HQ269460.1）、蒙原羚（KC679036.1）、鵝喉羚（KC679026.1）的COI序列經(jīng)Clustal W程序進行多重序列比對，選擇羚羊角塞基原動物與其混偽品序列差異大的區(qū)域進行引物設(shè)計。

2.1.2 引物設(shè)計 使用Premier Primer 5.0（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）設(shè)計特異性PCR鑒別引物，調(diào)整參數(shù)使引物為3′末端位于賽加羚羊與其混偽品序列差異區(qū)域，PCR產(chǎn)物長度為100～400 bp，Tm值為55～65 ℃。引物命名為LYJ.F和LYJ.R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.2 基因組總DNA的提取 取2 g樣品，用70%乙醇擦拭表明，使用Retsch MM 400球磨儀粉碎至能過80目篩，取50 mg粉末，使用Wizard SV Genomic DNA Purification System（Promega公司）試劑盒按說明書進行DNA提取。

2.3 PCR擴增條件的確定 通過調(diào)整PCR體系和反應(yīng)程序確定蛤蚧特異性鑒別的最優(yōu)條件。25 μL初始PCR反應(yīng)體系在200 μL離心管中進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L each）1.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL和模板1 μL，加入羚羊角塞正反向鑒別引物（10 μmol/L）各0.2 μL，用無菌雙蒸水補足反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)在VeritiTM型PCR擴增儀上進行。初始反應(yīng)程序。見表2。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入5 μL 6×Loading buffer（Takara公司）混勻后于GelRed染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

使用羚羊角塞鑒別引物對羚羊角正品及其常見偽品總DNA模板進行擴增，并分別考察：1）退火溫度；2）PCR循環(huán)數(shù)；3）模板DNA濃度；4）變性和退火時間；5）Taq種類；6）不同PCR儀對PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

2.4 羚羊角塞特異性鑒別引物的設(shè)計 使用ClustalW軟件對賽加羚羊、山羊、綿羊、普氏原羚、藏原羚、藏羚羊、蒙原羚、鵝喉羚的COI序列進行多重序列比對，以賽加羚羊與混偽品具有差異的SNP位點為基礎(chǔ)設(shè)計引物，賽加羚羊預(yù)期擴增長度為266 bp，如圖1。

2.5 羚羊角塞特異性PCR鑒別條件考察 由于影響特異性鑒別準確性的關(guān)鍵因素包括退火溫度、循環(huán)數(shù)和模板DNA濃度，而決定PCR反應(yīng)速度的核心因素為循環(huán)數(shù)和退火/延伸時長，本研究以正品擴增強度和偽品條帶有無為指標，依次對退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA濃度、變性/退火時間進行了系統(tǒng)考察，同時考察篩選的條件對不同Taq DNA聚合酶及不同PCR擴增儀的耐受性，結(jié)果表明，退火溫度位于60～66 ℃，循環(huán)數(shù)27～33，DNA模板濃度1～25 ng/μL羚羊角及其常見混偽品。見表3。在此條件下對不同保真度的Taq酶和不同型號PCR儀均具有耐受性。見表3。而退火溫度過低（<60 ℃）、循環(huán)數(shù)過大（>33）則會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，模板濃度過低（<1 ng/μL）則會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。最終確定羚羊角特異性PCR鑒別反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)33次（95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s）72 ℃延伸5 min。

2.6 適用性考察 使用羚羊角塞特異性鑒別引物，采用篩選出的擴增體系和PCR反應(yīng)條件，對不同藥材市場的31批羚羊角類樣品（其中羚羊角塞20批，羚羊角11批）及混偽品21批進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，僅羚羊角和羚羊角塞正品在200～300 bp間產(chǎn)生明亮單一條帶，偽品無條帶。見圖2、圖3。不同來源的正品羚羊角塞均產(chǎn)生一致結(jié)果，表明該體系能穩(wěn)定準確地鑒別羚羊角塞。

3 討論

遺傳間斷是進行物種劃分的基礎(chǔ)，DNA分子鑒定的前提條件是正品與混偽品間存在序列差異，本研究對正品羚羊角塞的基原物種賽加羚羊及外觀形態(tài)相似的7種混偽品物種COI序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)正偽品序列存在顯著差異，系統(tǒng)發(fā)育樹分析亦呈單系[14-15]，故而可從根據(jù)COI序列差異位點設(shè)計特異性引物進行鑒別。

進行PCR分子鑒別的第一步是DNA提取，不同的方法其DNA提取效果可能會有區(qū)別，同時因羚羊角塞為骨制品，DNA提取較為困難。為保證鑒別結(jié)果的準確性，本研究試驗了不同的DNA提取方法（Promega DNA提取試劑盒，柱式骨骼DNA提取試劑盒，SDS法和CTAB法），發(fā)現(xiàn)各方法均能獲得良好的提取效果，光吸收比值A(chǔ)260/A280>1.5，濃度均>20 ng/μL，且均可滿足PCR擴增的基本要求。本研究選擇最為簡便的Promega DNA提取試劑盒進行DNA提取。方法學(xué)考察是獲得穩(wěn)定、準確DNA分子鑒別方法的必要步驟[16]。我們對影響PCR擴增的核心因素，如退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、DNA濃度、DNA聚合酶用量及不同品牌的PCR儀和DNA聚合酶進行了考察，發(fā)現(xiàn)所建立的特異性PCR鑒別方法具有很強的穩(wěn)定性。見表3。為考察羚羊角塞特異性PCR鑒別方法的特異性和適用性，本研究收集了不同藥材市場的31批羚羊角塞類正品和市場常見的21批羚羊角塞混偽品進行驗證，結(jié)果僅正品能擴增獲得約300 bp大小的條帶，混偽品無條帶，表明所建立的特異性PCR鑒別方法能專屬性鑒別待檢樣品是否為正品基原，對羚羊角塞藥材的使用和流通的安全性與規(guī)范性起到保障作用。

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