廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)HPLC指紋圖譜研究

王躍峰 馮旭 蘇健 傅鵬 邱驥鵬 朱華

摘 要：為了對(duì)廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，采用HPLC指紋圖譜法對(duì)8批藥材進(jìn)行了研究，色譜條件為安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（D），梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果表明：建立了參考指紋圖譜，共有峰6個(gè)，8批廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)藥材HLPC指紋圖譜相似度均大于0.75，其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)均符合指紋圖譜技術(shù)要求。HPLC指紋圖譜分析，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，方法簡(jiǎn)便高效，可為廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞：廣西，拳卷地錢(qián)，HPLC，指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）05-0577-06

Abstract：In order to control the quality of Marchantia convoluta，we adopted HPLC fingerprint method to study eight batches of medicinal materials. The separation was developed on ZORBAX SB-C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm） by gradient elution with acetonitrile-water （both containing 0.1% phosphoric acid） as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1，at the column temperature of 25 ℃ and with the detection wavelength of 230 nm. The reference fingerprints were established，and six common peaks were found. The similarity of HLPC fingerprints of eight batches of M. convoluta was greater than 0.75. The precision，repeatability and stability of the experiments were in line with the requirements. The data of HPLC fingerprint analysis are stable and reliable. The method is simple and efficient，which can provide reference for the quality control of M. convoluta.

Key words：Guangxi，Marchantia convoluta，HPLC，fingerprint

廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)（Marchantia convoluta）是地錢(qián)科地錢(qián)屬植物，是苔蘚植物中常見(jiàn)的中草藥之一，始載于《西藏苔蘚植物志》，廣泛分布在西藏、廣西、貴州等省（區(qū)）的高寒山區(qū)。廣西境內(nèi)廣泛分布多種地錢(qián)屬植物，其中拳卷地錢(qián)的資源尤為豐富，作為常用草藥在廣西壯族民間得到廣泛應(yīng)用。民間用于燙傷骨折、瘡病不斂、體癬等外科疾病其療效不錯(cuò)，特別是治療黃疸性肝炎顯示出了很好的效果。國(guó)內(nèi)外關(guān)于拳卷地錢(qián)研究主要是生藥學(xué)鑒別研究（朱華等，2013；鄒登峰等，2005）、揮發(fā)性成分（曹慧等，2005a，b；肖建波等，2005）、黃酮類(lèi)化合物研究（朱華等，2005a；肖建波等，2005；童星等，2008）、芹菜素含量測(cè)定（朱華等，2005b）及脂溶性成分（朱華等，2003；肖建波，2005）分析、抗急性肝損傷及抗乙肝病毒藥理研究（王躍峰等，2017）及ISSR-PCR擴(kuò)增體系研究（周雨晴等，2014），但未見(jiàn)拳卷地錢(qián)HPLC指紋圖譜的研究。

近年來(lái)，中藥指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制方面得到了廣泛應(yīng)用，如羅漢果祛痰作用的譜效關(guān)系（王勤等，2017），裸花紫珠的HPLC指紋圖譜研究（劉幼嫻等，2014）等例子屢見(jiàn)不鮮，使之成為一種能為國(guó)內(nèi)外廣泛接受的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，符合中藥多數(shù)以復(fù)方和多成分給藥的特點(diǎn)，能較好地評(píng)價(jià)中藥及其制藥過(guò)程的真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性，而HPLC指紋圖譜在各種指紋圖譜中應(yīng)用最廣，具有分離效能高、分析速度快、儀器自動(dòng)化強(qiáng)等特點(diǎn)，使HPLC指紋圖譜技術(shù)在中藥制藥過(guò)程的質(zhì)量控制中得到不斷推廣（徐益清等，2016；陳菊，2008）。目前關(guān)于廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)質(zhì)量評(píng)價(jià)僅見(jiàn)于紫外分光光度法測(cè)定總黃酮及HPLC法測(cè)定芹菜素含量的研究，為合理地開(kāi)發(fā)利用拳卷地錢(qián)藥用資源，保證藥材的質(zhì)量，完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，該研究采用HPLC法對(duì)廣西產(chǎn)8批拳卷地錢(qián)進(jìn)行指紋圖譜分析，為藥材鑒定及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為后期資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藥材采自廣西各地，經(jīng)生藥學(xué)專(zhuān)家韋松基教授鑒定為地錢(qián)科地錢(qián)屬植物拳卷地錢(qián)（Marchantia convoluta），詳見(jiàn)表1。樣品低溫干燥后，粉碎并統(tǒng)一過(guò)40目篩，備用。

甲醇（色譜純，賽默飛世爾，批號(hào)為1205510）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾，批號(hào)為6116455）；其余試劑為分析純；水為超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀含可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（G-1315D）、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器（G-1329B）、高壓四元泵（G-1311C）、智能化柱溫箱（G-1316A）、在線真空脫氣機(jī)（G-1311C）、Agilent 1260 series色譜工作站（美國(guó)Agilent）；高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)為T(mén)GL-16B）；超聲儀（上海必能信超聲有限公司，型號(hào)為B2200S-T）；電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，型號(hào)為BP211D）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（D），梯度洗脫，5%→5%B（0～5 min），5%→100%B（5～60 min），100%→100%B（60～80 min）；流速為1.0 mL·min -1；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)定地錢(qián)藥材1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密移取甲醇溶液25 mL加入，稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，冷卻至室溫，再精密稱(chēng)定重量，用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，13 000 r·min-1離心10 min，然后取濾液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度考察 精密稱(chēng)定地錢(qián)藥材1.0 g，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.15%。相對(duì)峰面積RSD<2.33%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該儀器的精密度良好。

1.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取地錢(qián)藥材1.0 g，精密稱(chēng)定，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別在溶液制備的0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示圖譜無(wú)明顯變化，重疊性良好。6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.36%，6個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積RSD均<3.33%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取地錢(qián)藥材6份，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行洗脫分析。結(jié)果顯示8批樣品圖譜無(wú)明顯變化，6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.18%。相對(duì)峰面積RSD均<3.34%，表明該方法的重復(fù)性良好、適合作為該樣品指紋圖譜實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

1.2.4.1 指紋圖譜的建立 取8批樣品，精密稱(chēng)取1.0 g，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行洗脫分析，記錄HPLC圖?！吨兴幧V指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012.1版軟件分析，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法對(duì)8批拳卷地錢(qián)指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行了多點(diǎn)校正及自動(dòng)匹配，以（S2）的指紋圖譜為參照指紋圖譜，生成對(duì)照指紋圖譜R，并建立8批拳卷地錢(qián)藥材的指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

1.2.4.2 共有峰的標(biāo)定 根據(jù)8批地錢(qián)藥材指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.1）數(shù)據(jù)匹配功能，在標(biāo)定的共有色譜峰中選擇了6個(gè)吸收峰強(qiáng)，特征明顯，穩(wěn)定性好的色譜峰作為地錢(qián)指紋圖譜的共有峰，如圖2所示。在樣品圖譜中選擇出峰時(shí)間適中、峰面積相對(duì)較大、峰型較穩(wěn)定的1號(hào)色譜峰作為參照峰。

1.2.4.3 相似度評(píng)價(jià) 8批地錢(qián)藥材的指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012.1版軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，與生成的共有模式對(duì)照指紋圖譜R（圖1）進(jìn)行比較，其相似度為0.943～0.774，其相似度結(jié)果見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件考察結(jié)果分析

采用單因素變量法，優(yōu)選不同提取條件制備供試品溶液，考察了不同提取因素對(duì)地錢(qián)藥材中有效成分提取率的影響。提取方法考察了超聲提取、冷浸提取、加熱回流提取3種，結(jié)果顯示超聲提取得到峰信息多，共有峰峰面積大，相比冷浸和回流更簡(jiǎn)便省時(shí)；提取溶劑考察了甲醇、乙醇、水3種溶劑，結(jié)果顯示水提取只在前30 min出現(xiàn)部分小峰，數(shù)量極少，峰面積極低，乙醇提取的峰在28 min后出現(xiàn)，峰數(shù)量較多，峰面積較高，分離度適中，而甲醇提取的峰分布均勻，峰面積均比水、乙醇提取的高，峰數(shù)量最多，各峰分離好；提取時(shí)間考察了30、60、90 min 3個(gè)時(shí)間，結(jié)果顯示3種時(shí)間提取的峰數(shù)量相當(dāng)，峰面積相差不大，共有峰基本相似，但從實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性、操作的簡(jiǎn)易性、時(shí)間成本節(jié)約及提高效率等綜合分析考慮，60 min為提取時(shí)間的最佳選擇。最后得到的供試品提取方法：稱(chēng)取藥材1.0 g，加入25 mL甲醇，超聲提取60 min，過(guò)濾，離心，即得。

2.2 色譜條件考察結(jié)果分析

在色譜條件的考察中，分別考察了安捷倫ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、安捷倫ZORBAX SB-Aq（4.6 mm × 250 mm，5 μm）和DIKMA Diamonsil C18（2）（4.6 mm × 250 mm，5 μm）柱，結(jié)果顯示三種色譜柱的峰數(shù)量相當(dāng)，峰面積也相差不大，但安捷倫ZORBAX SB-Aq的色譜圖中，基線不平穩(wěn)，出現(xiàn)漂移，峰分離效果較差，DIKMA Diamonsil C18（2）的色譜圖中，峰分離度一般，峰面積是三種色譜中最低，而安捷倫ZORBAX SB-C18的基線相對(duì)較平穩(wěn)，指紋信息相對(duì)較豐富，色譜峰分離度較高且峰面積較大。流動(dòng)相分別考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液（圖3）、乙腈-水（圖4）2個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示二者峰數(shù)量區(qū)別較小，但乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相基線較平穩(wěn)，整體色譜峰分離度較高且峰面積較大；采用全波長(zhǎng)掃描，考察了210、230、250、270、290 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示230 nm下的色譜峰基線最平穩(wěn)、主要峰的數(shù)目多、色譜峰分離度最好且峰面積最大。最終確定的色譜條件：安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（D），梯度洗脫，5%→5%B（0～5 min），5%→100%B（5～60 min），100%→100%B（60～80 min）；流速1.0 mL·min -1；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.3 指紋圖譜建立結(jié)果分析

8批廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)HPLC指紋圖譜，對(duì)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行考察，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間RSD值及相對(duì)峰面積RSD值，穩(wěn)定性及重復(fù)性相對(duì)峰面積RSD值>3%，其他RSD值均<3%；8產(chǎn)地指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.1）分析匹配，相似度為0.943～0.774，標(biāo)定了6個(gè)共有峰，并建立拳卷地錢(qián)的參照指紋圖譜。

3 討論與結(jié)論

中藥是一個(gè)成分復(fù)雜的體系，其功效往往是多種成分作用的體現(xiàn)，而指紋圖譜技術(shù)能基本反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體變化情況，符合中藥質(zhì)量控制中的整體、宏觀分析特點(diǎn)，能較全面地控制中藥質(zhì)量的穩(wěn)定性和有效性，是全面控制中藥質(zhì)量的可行模式，是反映中藥整體質(zhì)量的控制方法和手段（石上梅等，2015）。本研究摸索得出的實(shí)驗(yàn)條件，大多色譜峰的分離度良好，能較好地與其他峰分離，結(jié)果能較全面體現(xiàn)該藥材整體的化學(xué)特征，反映其內(nèi)在的質(zhì)量，對(duì)地錢(qián)指紋圖譜的研究具有一定參考。

本研究中，不同批次藥材共有峰的保留時(shí)間差別較小，而共有峰的峰面積則存在較大的差異，表明各產(chǎn)地中各成分的含量是不同的，其中產(chǎn)地為欽州浦北的含量均較高，產(chǎn)地為南寧武鳴的含量均較低；8批藥材相似度范圍為0.943～0.774，相似度差異較大，表明不同產(chǎn)地的地錢(qián)其所含成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然相對(duì)穩(wěn)定，但還是存在一定差異。欽州浦北的相似度為0.774，而整體含量較高，其含量的高低是否影響相似度或不同的地理位置，如日照、水質(zhì)、土質(zhì)等導(dǎo)致的成分差異，這些影響因素仍需進(jìn)一步考究。

該研究方法快捷、簡(jiǎn)便、高效，建立的 HPLC指紋圖譜可用于廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)藥材的定性鑒別，通過(guò)指紋圖譜對(duì)地錢(qián)藥材進(jìn)行綜合宏觀分析，有利于藥材資源的開(kāi)發(fā)利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)，可為廣西產(chǎn)拳卷地錢(qián)藥材質(zhì)量的全面控制與進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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