毛咀地星的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性和化學成分研究

劉坤　劉名飛　王俊麗　于子簫

摘要： 毛咀地星是一種藥用蘑菇，為了進一步開發(fā)利用毛咀地星，該研究探討了毛咀地星乙醇提取物的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性，并采用硅膠柱色譜、制備薄層色譜和重結晶等方法，對毛咀地星乙醇提取物進行分離純化，研究了其化學成分。結果表明：毛咀地星乙醇提取物多酚含量為10.53 μg·mg-1，DPPH和·OH自由基清除能力的IC50值分別為91.35和148.76 μg·mL-1；乙醇提取物對金黃葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽抱桿菌均無抑制作用；乙醇提取物在濃度為1 mg·mL-1時，對燕麥鐮刀菌的抑制率為36.11%；乙醇提取物在濃度為200 μg·mL-1時，對BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231腫瘤細胞的抑制率分別為18.87%、17.71%和41.23%。并從乙醇提取物中分離純化到6個化合物，根據理化性質和波譜數據分析，化合物結構分別鑒定為5α，8α-過氧化麥角甾-6，9（11），22-三烯-3β-醇（1）、5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（2）、D-阿拉伯糖醇（3）、L-谷氨酸（4）、麥芽糖（5）和蔗糖（6），以上化合物均為首次從該菌中分離得到。

關鍵詞： 毛咀地星， 抗氧化活性， 抗菌活性， 抗腫瘤活性， 化學成分

中圖分類號： Q946， R284文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0953-07

Abstract： Geastrum fimbriatum is a kind of medicinal mushroom with hemostasis， clearing lung and alexipharmic functions. For the further study on the development and utilization of G. fimbriatum， the antioxidant， antibacterial and anticancer activities and the chemical constituents of the ethanol extract （EE） from G. fimbriatum were evaluated. The present study exhibited that the total phenolic content of EE was 10.53 μg·mg-1 EE DPPH and ·OH radical-scavenging activities with IC50 values of 91.35 and 148.76 μg·mL-1， respectively. EE showed no antibacterial activity on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis. Meanwhile， EE displayed antifungal activity on Fusarium avenaceum with inhibition ratio of 36.11% at the concentration of 1 mg·mL-1. EE displayed anticancer activities against tumor cells BG-803， NCI-H502 and MDA-MB-231 with the inhibition ratio of 18.87%， 17.71% and 41.23% respectively at the concentration of 200 μg·mL-1 （MTT assay）. Six compounds were isolated from EE by the methods of column chromatography， thin layer chromatography， recrystallization and so on. The structures were elucidated by the analysis of spectral data and physical-chemical properties and identified as 5α， 8α-epidioxyergosta-6， 9（11）， 22-triene-3β-ol （1）， 5α， 8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol （2）， D-allitol （3） ， L-glutamic acid （4）， maltose （5）， saccharose （6）. All the six compounds were isolated from G. fimbriatum for the first time.

Key words： Geastrum fimbriatum， antioxidant activity， antibacterial activity， antitumor activity， chemical constituents

毛咀地星（Geastrum fimbriatum）是一種藥用蘑菇，為地星科地星屬的一種，子實體較小，夏末秋初生于林中腐枝落葉層地上，在西藏、云南、河北、青海、河南、湖南、黑龍江等地都有分布。孢子粉有止血、消炎和解毒的作用（袁明生，2013）。目前地星屬的研究主要集中在資源調查和分類學上，Kirk et al（2008）記載全世界有50多個種，韓冰雪和圖力古爾（2016）記載目前中國有地星16種和1變種，其中3個中國地星屬新種和新記錄種。地星屬已有菌種被報道具有抗氧化、抗菌和細胞毒性，如Guerra Dore et al（2007）報道袋形地星（Geastrum saccatun）含有豐富的β葡聚糖，有消炎、抗氧化和細胞毒活性；Kim et al（2012）報道葫蘆地星（G. lageniforme）甲醇提取物有抗氧化活性；Chittaragi et al（2013）報道尖頂地星（G. triplex）的石油醚、氯仿和甲醇提取物有抗菌活性。但目前尚未見有毛咀地星生物活性和化學成分分析的研究報道。筆者首次對毛咀地星子實體的乙醇提取物進行抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性研究，從乙醇浸提物中分離到6個化合物，均為首次從該菌中分離得到，為毛咀地星的開發(fā)利用提供了科學依據。

1材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：毛咀地星（Geastrum fimbriatum）采自內蒙古克什克騰旗，經河北經貿大學張香美教授鑒定，標本放在中央民族大學生命科學與環(huán)境學院。金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）購自中國科學院微生物菌種保藏管理中心；禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、白斑小尾孢（Cercosporella albo-maculans）和燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）由沈陽農業(yè)大學提供；NCI-H502（人肺鱗狀上皮細胞癌）、BG-803（人胃癌細胞）和MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）由中國醫(yī)學科學院基礎所細胞中心提供。

儀器：Bruker DRX 500超導核磁共振波譜儀；Agilent 6890N-5975N質譜儀；Thermo Lab systems全自動酶標儀；VERTEX 70傅立葉紅外光譜儀；Olympus CH普通倒置顯微鏡。試劑：DPPH 為美國Sigma公司生產；抗壞血酸標準對照品為廣東汕頭西隴化工廠生產；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 提取與分離

毛咀地星子實體（干重1.5 kg），用95%乙醇浸提4次，每次7 d，合并減壓蒸干得100 g粗體物，留取10 g粗提物做活性。以石油醚∶丙酮（10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、0∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫，經薄層層析檢測，合并相同部分，得6個組分（Fr.A-Fr.F）。Fr.C組分經硅膠柱層析進行分離，以石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）為洗脫劑進行洗脫，得2個亞組分（Fr.C1和Fr.C2）。Fr.C1亞組分經Sephadex LH-20色譜柱層析，再經TLC制備色譜（GF254，石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，展1次），得化合物1（4.4 mg）。Fr.C2亞組分經重結晶得化合物2（5.7 mg）。Fr.E組分經硅膠柱層析進行分離，以石油醚∶丙酮（2∶1）為洗脫劑進行洗脫，得2個亞組分（Fr.E1和Fr.E2）。Fr.E1組分經Sephadex LH-20色譜柱層析，得化合物3（3.1 mg）。Fr.E2組分經Sephadex LH-20色譜柱層析，硅膠柱層析進行分離，以氯仿∶丙酮（1∶1）為洗脫劑進行洗脫，得化合物4（2.2 mg）。Fr.F組分經硅膠柱層析進行分離，以石油醚∶丙酮（1∶1）為洗脫劑進行洗脫，重結晶得化合物5（4.1 mg）和6（4.7 mg）。

1.3 乙醇提取物體抗氧化活性分析

1.3.1 總酚含量測定參照Liu et al（2013）的方法，根據標準品沒食子酸標準曲線確定的方程計算酚含量， 線性范圍為2～14 μg·mL-1。方程為Y=0.006 2X + 0.064 7， R2=0.999 3。

1.3.2 DPPH自由基清除實驗參照何月秋等（2017）的方法，并稍作改動。配制不同濃度的樣品，分別取100 μL樣品和100 μL 60 μmol·L-1的DPPH乙醇（95%）溶液混合，放入酶標儀中震動搖勻，暗反應30 min。517 nm 下測量吸光度（A）。對照組和處理組都重復3次。

DPPH自由基清除率=（A對照-A樣品）/A對照×100%（1）

式中，A對照為對照的吸光值，A樣品為加樣品反應液的吸光度值?？箟难嶙鳛殛栃詫φ?。

1.3.3 羥自由基清除實驗參照Grymonpré et al（2001）的方法，并稍作改動。200 μL反應體系中含有各種不同濃度的待測化合物100 μL，FeSO4·7H2O（9 mmol·L-1）20 μL，H2O2（8.8 mmol·L-1）20 μL，水楊酸-乙醇溶液（9 mmol·L-1）20 μL，在 37 ℃的恒溫水中反應 30 min 后，用酶標儀在510 nm下測量吸光度（A）。羥自由基清除率同公式（1），抗壞血酸作為陽性對照。

1.4 乙醇提取物體抗菌活性分析

1.4.1 抗細菌試驗抑菌圈采用打孔法進行測定（趙能等，2017）。將活化的供試菌調至濃度為1 × 106～1 × 107 CFU·mL-1的菌懸液。取0.1 mL菌懸液加到平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻。用直徑為0.6 cm打孔器在涂布均勻的平板上打孔。每孔加入50 μL（100 mg·mL-1）樣品，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，每樣品3個平行板。5 mg·mL-1青霉素鈉溶液為革蘭氏陽性菌的對照品，10 mg·mL-1青霉素鈉溶液為革蘭陰性菌的對照品。

1.4.2 抗真菌試驗待測樣品對真菌的抑制作用采用侯穎等（2014）的菌絲生長速率法?？瞻讓φ眨状迹㈥栃詫φ眨嗣惯?，濃度為0.10 mg·mL-1）、加藥處理（乙醇提取物，濃度為1 mg·mL-1），每個處理設3個重復。

相對抑制率 = （加藥處理菌落平均直徑-菌餅直徑）/（空白對照菌落平均直徑-菌餅直徑）

1.5 乙醇提取物體抗腫瘤活性分析

參照汪婷等（2017）的方法（MTT法），研究乙醇提取物體對腫瘤細胞BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231增殖的抑制活性。將計數后腫瘤細胞懸液先用培養(yǎng)基稀釋至1 × 105個·mL-1，再加至96空板，每孔100 mL，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。將不同濃度的樣品加入各個孔中，培養(yǎng)48 h；吸出各孔培養(yǎng)基，每孔先加入100 μL無菌PBS，再加入20 μL MTT（過程避光），培養(yǎng)4 h；吸出上清，各孔加入100 μL DMSO，搖10 min至各孔中澄清，檢測570 nm的OD吸光值。陽性藥物為紫杉醇。所有試劑均用0.2 μm無菌濾器除菌以保證整個實驗過程嚴格無菌。

2結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1白色不定型粉末（甲醇），mp 165～167 ℃。EI-MS：m/z= 426.3。1H NMR（500 MHz，CDCl3，δ，ppm，J/Hz）：0.75（3H，s，H-18），0.84（3H，d，J=7.0，H-26），0.84（3H，d，J=7.0，H-27），0.93 d（3H，d，J=7.0，H-28），1.00（3H，d，J=6.5，H-21），1.10（3H，s，H-19），3.96（1H，m，H-3），5.16（1H，dd，J=15.3，7.5，H-23），5.24（1H，dd，J=15.3，7.5，H-22），5.45（1H，dd，J=4.4，H-11），6.26（1H，d，J=8.5，H-6），6.52（1H，d，J=8.5，H-7）；13C NMR（125 MHZ，CDCl3，δ，ppm）：32.4（C-1），30.9（C-2），65.9（C-3），35.9（C-4），82.6（C-5），135.5（C-6），130.4（C-7），78.2（C-8），142.5（C-9），37.8（C-10），119.6（C-11），41.0（C-12），43.5（C-13）， 48.0（C-13）， 20.8（C-15）， 28.5（C-16），55.7（C-17），12.7（C-18），25.4（C-19），39.7（C-20），20.5（C-21），135.0（C-22），132.3（C-23），42.6（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），19.8（C-27），17.4（C-28）。數據與Kobor et al （2006）的一致，故鑒定為5α，8α-過氧化麥角甾-6，9（11），22-三烯-3β醇。

化合物2白色晶體（甲醇），mp 182～183 ℃。EI-MS： [M]+ m/z= 428.3。1H NMR（500 MHz，CDCl3，δ，ppm，J/Hz）：0.82（3H，S，H-18），0.83（3H，d，J=7.0，H-26），0.83（3H，d，J=7.0，H-27），0.89（3H，S，H-19），0.91（3H，d，J=7.0，H-28），1.00（3H，d，J=6.5，H-21），3.97（1H，m，H-3），5.14（1H，dd，J=15.3，7.5，H-23），5.21（1H，dd，J=15.3，7.5，H-22），6.23（1H，d，J=8.5，H-6），6.49（1H，d，J=8.5，H-7）；13C NMR（125 MHZ，CDCl3，δ，ppm）：34.6（C-1），30.3（C-2），74.02（C-3），36.7（C-4），82.1（C-5），135.4（C-6），130.5（C-7），79.3（C-8），51.0（C-9），36.7（C-10），20.6（C-11），39.2（C-12），44.4（C-13），51.5（C-13），23.2（C-15），28.5（C-16），56.0（C-17），12.7（C-18），18.0（C-19），39.5（C-20），20.7（C-21），135.1（C-22），132.2（C-23，42.6（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），19.8（C-27），17.4（C-28）。數據與甘秀海等（2013）的一致，故鑒定為5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯-3β醇。

化合物3無色棱狀晶體（甲醇），mp 106 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：3.54（1H，dd，J=11.8，2.3，1-Hax），3.53（1H，dd，J=11.9，6.8，1-Heq），3.69（1H，ddd，J=11.9，5.6，2.4，H- 2），3.79（1H，dd，J=12.0，5.6，H-3），3.65（1H，ddd，J=8.5，6.0，2.6，H- 4），3.45（1H，dd，J=11.5，5.68，5-Hax），3.43（1H，dd，J=11.5，8.4，5-Heq）；13C NMR（125 MHz，DMSO，δ，ppm）：63.3（C-1），70.6（C-2），70.8（C-3），71.3（C-4），63.3（C-5）。數據與李元偉（2016）的一致，故鑒定為D-阿拉伯糖醇。

化合物4白色無定型粉末（甲醇），mp 169～172 ℃。EI-MS：M+ m/z= 147.1。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：4.68（1H，ddd，J=15.5，5.6，5.5，H-2），2.63（1H，dd，J=15.5，5.6，H-3a），2.55（1H，dd，J=15.5，5.6，H-3b），3.08（2H，t，J=15.5，6.2，H-4），7.71（2H，d，J=5.5，NH2）；13C NMR（125 MHz，DMSO，δ，ppm）：175.8（C-1），56.4（C-2），26.7（C-3），30.8（C-4），173.8（C-5）。數據與肖皖（2011）的一致，故鑒定為L-谷氨酸。

化合物5無色方晶（甲醇），mp 102～103 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：5.02（1H，d，J=1.6，H-1），4.71（1H，d，J=3.6，H-1′）；13C NMR（125 MHz， DMSO，δ，ppm）：93.7（C-1），71.2（C-2），73.5（C-3），74.7（C-4），74.7（C-5），61.2（C-6），99.8（C-1′），72.7（d，C-2′），72.6（d，C-3′），69.7（C-4′），70.7（C-5′），60.2（C-6′）。數據與參考文獻（黃悅，2002；李小第等，2015）的一致，固鑒定為麥芽糖。

化合物6無色方晶（甲醇），mp 185～186 ℃。1H NMR（500 MHz，D2O，δ，ppm，J/Hz）：4.45（1H，d，J=5.4，H-1），4.61（1H，s，H-6），4.72（1H，d，J=3.6，H-1′）；13C NMR（125 MHz，D2O，δ，ppm）：62.3（C-1），102.9（C-2），81.7（C-3），77.3（C-4），74.3（C-5），62.2（C-6），91.9（C-l′），71.9（C-2′），72.5（C-3′），69.4（C-4′），74.4（C-5′），70.1（C-6′）。數據與張文靜等（2016）的一致，故鑒定為蔗糖。

2.2 乙醇提取物活性研究

2.2.1 抗氧化活性毛咀地星乙醇提取物的多酚含量為（10.53 ± 0.53）μg·mg-1，DPPH和·OH自由基清除活性呈濃度正相關關系（圖 2）。當濃度為200 μg·mL-1時DPPH和·OH自由基清除率分別為（65.27 ± 0.71）%和（49.34 ± 0.44）%。IC50是清除率為50%時對應的樣品濃度，值越大，表明清除活性越弱，反之，越強。毛咀地星乙醇提取物DPPH和·OH自由基清除能力的IC50分別為（91.35 ± 1.93）和（148.76 ± 1.60）μg·mL-1與抗壞血酸的IC50[（5.00 ± 0.31）和（20.55 ± 0.25）μg·mL-1]差異顯著（P<0.05）。表明毛咀地星乙醇提取物有一定的DPPH和·OH自由基清除活性但低于抗壞血酸。目前已有同屬菌的抗氧化研究報道，Guerra Dore et al（2007）指出袋形地星多糖提取物在200 μg·mL-1時， ·OH自由基清除率為（64.0±2.92）%，高于毛咀地星乙醇提取物。

2.2.2 抗菌活性毛咀地星乙醇提取物對三種病原圖 2毛咀地星乙醇提取物的DPPH （A）和·OH （B）自由基清除作用細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）均沒有表現出抑制作用，無抑菌圈出現。Chittaragi et al（2013）報道了同屬尖頂地星甲醇提取物的抑菌活性，其抑菌活性與毛咀地星乙醇提取物表現出一致性，濃度為25%、50%和100%的尖頂地星甲醇提取物對大腸桿菌均無抑制活性，12.5%的尖頂地星甲醇提取物對金黃色葡萄球菌也無抑制活性。表1顯示，毛咀地星乙醇提取物對禾谷鐮刀菌和白斑小尾孢的抑制作用較小，差異不顯著（P > 0.05），濃度為1 mg·mL-1時，抑制率分別為（19.10 ± 0.19）%和（20.24 ± 1.12）%。對燕麥鐮刀菌的抑制率相對較高，1 mg·mL-1時為（36.11 ± 1.6）%，但低于陽性對照克霉唑（69.55 ± 2.46）%，且差異顯著（P < 0.05）。

2.2.3 抗腫瘤活性毛咀地星乙醇提取物對BG-803（人胃癌細胞）、NCI-H502（人肺鱗狀上皮細胞癌）和MDA-MB-231（人乳腺癌細胞）都有較低的抑制作用，且呈濃度正相關關系（圖 3）。在濃度為200 μg·mL-1時對BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231細胞的抑制率分別為（18.87±0.62）%、（17.71±0.84）%和（41.23±0.39）%，都低于紫杉醇（98.32±1.4）%、（92.67±1.53）%和（98.11±1.85）%，且差異顯著（P < 0.05）。其中毛咀地星乙醇提取物對MDA-MB-231的抑制性最強但低于紫杉醇。目前還未見到關于毛咀地星抗腫瘤活性研究的其它報道，但Guerra Dore et al（2007）指出袋形地星多糖提取物在0.5～1.5 mg·mL-1時，可抑制PMBC（外周血單核細胞）的存活，這也說明地星屬的菌具有一定細胞毒活性，但活性不高。

3討論與結論

由于地星屬蘑菇種類相對較少，大量采集相對困難，目前地星屬蘑菇的研究主要集中在資源調查和分類學上，關于此屬的生物活性研究僅見幾篇報道。本研究從毛咀地星中首次分離到6個化合物，包括2個甾體、1個氨基酸、1個糖醇、2個糖。其中5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯-3β-醇有抗氧化活性和抗腫瘤活性（劉坤等， 2013， 2014），說明毛咀地星的抗氧化和抗腫瘤活性與這種甾體可能有一定的相關性。毛咀地星乙醇提取物DPPH和·OH自由基清除能力的IC50分別為（270.43 ± 4.52）和（340.95 ± 2.83） μg·mL-1，在200 μg·mL-1時，毛咀地星乙醇提取物·OH自由基清除率為（49.34 ± 0.44）%，低于袋形地星多糖提取物的·OH自由基清除率（64.0±2.92）%（Guerra Dore et al，2007），說明地星菌多糖提取物的抗氧化活性可能要好于乙醇提取物，也可能是袋形地星的抗氧化活性好于毛咀地星，這有待進一步考證。毛咀地星乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌無抑制作用，與Chittaragi et al（2013）的結論基本一致，說明地星屬的蘑菇可能對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性較差。毛咀地星乙醇提取物在濃度為1 mg·mL-1時，對燕麥鐮刀菌的抑制率為（36.11 ± 1.6）%；在濃度為200 μg·mL-1時對MDA-MB-231細胞的抑制率為（41.23 ± 0.39）%，因此有待于進一步研究，純化出活性更高的組分，用于抑制燕麥鐮刀菌和MDA-MB-231細胞的生長。以上研究可為毛咀地星進一步的開發(fā)利用提供參考。

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