楤木根皮多糖硫酸酯的制備、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性的研究

楊洋　王一峰　馬詣欣　祁如林　楊亞軍

摘要： 該研究以產(chǎn)自甘肅徽縣太白鄉(xiāng)的楤木根皮多糖（ACP）為材料，通過氯磺酸-吡啶法（CSA-Py）合成了楤木根皮多糖硫酸酯（SACP）。通過響應(yīng)面（RSM）實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)條件：CSA/Py為2.53，反應(yīng)時(shí)間為5.23 h，反應(yīng)溫度為61.25 ℃，DS理論最大值為0.57。通過紅外光譜分析（FT-IR）、X射線光電子能譜（XPS）對產(chǎn)物進(jìn)行表征，SACP結(jié)構(gòu)中已引入硫酸基團(tuán)，S以S6+形式存在。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）檢測顯示，SACP由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。采用體積排阻色譜-激光光散射聯(lián)用法（SEC-LLS）測得的平均分子量（Mw）顯示，酸性反應(yīng)導(dǎo)致Mw降低。 體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，SACP有極好的清除O-2·的能力，有較好的清除DPPH自由基、·OH自由基的能力，還原力很強(qiáng)，對Fe2+有較好的螯合能力，具有濃度依賴性。從構(gòu)效關(guān)系來看，清除DPPH自由基、·OH自由基、O-2·自由基以及還原力的能力均與DS呈正相關(guān)。上述研究表明了ACP及SACP的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及化學(xué)修飾對ACP抗氧化活性的影響。

關(guān)鍵詞： 楤木根皮多糖， 硫酸酯化， 響應(yīng)面法， 結(jié)構(gòu)表征， 抗氧化活性

中圖分類號： Q945.79文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0911-13

Abstract： Aralia chinensis stem-bark polysaccharides （ACP） were from Hui County of Longnan City in Gansu Province， China. Chemical modified A. chinensis stem-bark polysaccharide （ACP） was prepared， and the structure-activity relationship was studied. By chlorosulfonic acid pyridine method （CSA/Py）， A. chinensis root-bark polysaccharide sulfation （SACP） was synthesized. The optimum reaction conditions determined by the response surface （RSM） experiments were as follows： the ratio of CSA/Py was 2.53， the reaction time was 5.23 h， and the reaction temperature was 61.25 ℃. Under such conditions， the sulfated polysaccharides with the degree of substitution （DS） of 0.57 were obtained， which was in accordance with the expectations of the model. The result of infrared spectroscopy（FT-IR） and X ray photoelectron spectroscopy （XPS） showed that sulfuric acid groups had been introduced into SACP， and S existed in the form of S6+. The average molecular weight （Mw） which was texted by size exclusion chromatography with laser light scattering method （SEC-LLS） showed that acidic reaction conditions caused the reduction of Mw. Gas chromatography mass spectrometry （GC-MS） analysis showed that monosaccharide composition of SACP were arabinose， glucose， galactose and mannose. The results of antioxidant activities of SACP and ACP in vitro showed scavenging ability on DPPH radical， hydroxyl radical， superoxide radical in a dose dependent manner， and good potential for reducing power. The free radicals scavenging ability of SACP was higher than that of ACP， which indicated that the introduction of sulfuric acid groups could enhance antioxidant ability of ACP. The above study revealed the structure of ACP and ACSP， and the effect of chemical modification on the antioxidant activity of ACP.

Key words： Aralia chinensis root-bark polysaccharides， sulfation， response surface methodology， structural characteristics， antioxidant activity

近些年對多糖活性的研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有良好的抗氧化酶活性、清除自由基等生物活性，并且多糖的結(jié)構(gòu)能直接或間接的影響多糖活性。對多糖進(jìn)行硫酸化修飾后，多糖的抗氧化活性得到了進(jìn)一步的提高（靳文娟和魯曉翔，2012；許春平等，2015）。因而多糖的硫酸酯化修飾逐漸成為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)之一。我國地大物博，多糖的資源極其豐富，尤其是類似于中草藥的植物多糖具有很大的開發(fā)潛力。近年來我國對靈芝、香菇、川穹、茯苓等中草藥多糖進(jìn)行了大量研究，并取得了巨大的進(jìn)展（戴則林和董昌武，2005；呂國英和范雷法，2009；楊鐵虹等，2003）。但是，對楤木的相關(guān)研究卻較為少見。

楤木（Aralia chinensis），系五加科（Araliaceae）楤木屬植物。主要分布于甘肅、陜西、河北中部、山西、云南， 楤木以根皮和莖皮入藥，具有鎮(zhèn)痛消炎（肖本見等，2006）、抗腫瘤（任美萍等，2009）、抗衰老的功效（裘名宜和馮龍飛，2006），可以用來治療糖尿病、跌打損傷等。趙博等（2015）研究了中國楤木粗多糖對糖尿病大鼠的降血糖作用，ACP能夠有效降低糖尿病大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三脂水平，提高高密度脂蛋白水平，有效調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血脂代謝紊亂。本課題組前期對楤木根皮多糖（ACP）的提取進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示ACP是由Ara、Glc、Gal三種單糖組成，重均分子量為Mn=5.259×105 g·mol-1。確定了ACP的一級化學(xué)結(jié)構(gòu)。雖然關(guān)于多糖硫酸化的研究較多，但與蛋白質(zhì)和核酸相比還是有一定的差距。因此，對于多糖在生物體內(nèi)的作用機(jī)制、多糖復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關(guān)系等方面的問題需要我們更加深入地研究。本研究對合成楤木根皮多糖硫酸酯的工藝優(yōu)化，結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為今后楤木資源的保護(hù)及合理利用提出理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：經(jīng)純化后的楤木根皮多糖（產(chǎn)自甘肅徽縣太白鄉(xiāng)）常規(guī)熱水浸提的楤木根皮多糖ACP。取代度為0.71的SACPM-DS（M-DS），取代度為0.34的硫酸化后的楤木根皮多糖SACPL-DS（L-DS），取代度為1.18的硫酸化后的楤木根皮多糖SACPH-DS（H-DS）。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），無水乙醇，抗壞血酸Vc，H2O2，水楊酸，HCl，鄰苯三酚，Tris-HCl，硫酸亞鐵，三氯乙酸，氯化亞鐵，鐵氰化鉀，甲酰胺，吡啶（3A分子篩除水），氯磺酸（CSA），無水乙醇，氫氧化鈉（NaOH）。

儀器：燒杯，三頸燒瓶，鐵架臺，攪拌器，冷凝管，滴液漏斗，pH試紙，透析袋等。設(shè)備：Labtech UV1000紫外可見分光光度計(jì)，LGJ-18S真空冷凍干燥機(jī)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，TDL5M臺式冷凍離心機(jī)，SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA），LGJ-18S冷凍干燥機(jī)，BL320H電子分析天平，Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，UV-2000紫外可見分光光度計(jì)，SHB循環(huán)水式真空泵。

1.2 方法

1.2.1 氯磺酸/吡啶法（CSA/Py）合成SACP取無水吡啶置于三口瓶中，經(jīng)冰鹽浴冷卻后，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加氯磺酸，40 min內(nèi)滴完得到酯化試劑，存放備用。精密稱取純化的楤木根皮多糖（ACP）300 mg，室溫下用60 mL甲酰胺溶解5 h，待溶解后移至恒壓滴液漏斗中，緩慢加入上述酯化試劑，攪拌10 min后將按照設(shè)計(jì)好的反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用飽和NaOH調(diào)pH至7.5后，放入透析袋中用蒸餾水透析48 h。透析袋內(nèi)液體50 ℃減壓濃縮后，加入少量無水乙醇沉淀，冷凍干燥得到楤木根皮多糖硫酸酯（SACP）。

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，依據(jù)不同因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，選取CSA/Py（A）、時(shí)間（B）和溫度（C）三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。采用Design expert 9.0 軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 總糖、糖醛酸、蛋白含量及溶解度的測定

1.2.3.1 溶解度和總糖含量的測定在恒溫保溫桶中加入適量的蒸餾水，25 ℃下加入多糖樣品，每隔30 min測定一次溶液中多糖的含量，當(dāng)結(jié)果穩(wěn)定時(shí)達(dá)到溶解平衡。當(dāng)沒有溶解的多糖沉于底部后，抽取部分上清液，過濾，從濾液中取樣分析多糖含量（苯酚-硫酸法），計(jì)算此溫度下的溶解度。總糖含量采用苯酚-硫酸法測定。

1.2.3.2 蛋白含量測定精確配制1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白液，搖勻，分別取0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mL于帶塞試管中，均以蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，然后各加5 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，放置2 min后，在595 nm波長處測定各試管溶液的吸光值（張惟杰，1999）。

1.2.4 SACP的表征

1.2.4.1 紅外光譜分析（FT-IR）在瑪瑙研缽內(nèi)放入干燥后的待測多糖樣品1 mg，干燥的溴化鉀粉末100～200 mg，研磨成均勻粉末進(jìn)行壓片，用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀進(jìn)行分析。

1.2.4.2 X射線光電子能譜（x-ray photoelectron spectrometry，XPS）XPS（PHI-5702，USA），激發(fā)源為Mg Kα線，能量為29.35 eV，樣品的倉壓力為2×10-9 Torr（2.67×10-7 Pa），電壓值15 kV，功率為200 W。結(jié)合能精度為0.3 eV，Multipak6.1a軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.4.3 分子量測定多糖樣品的分子量采用體積排阻色譜（size-exclusion chromatograph，SEC）-光散射聯(lián)用進(jìn)行測定。多角度激光光散射儀（multi-angle laser photometer， MALLS） λ=690 nm （DAWN EOS， Wyatt Technology Co.， USA）。色譜柱（UltrahydrogelTM column， 7.8 mm × 300 mm，Waters， USA）。示差折光檢測器（Optilabrefractometer） （Dawn， Wyatt Technology Co.， USA）（宋坤，2014）。

1.2.4.4 單糖組成10 mg SACP加入4 mL 4 mol·L-1的三氟乙酸，120 ℃油浴水解8 h（N2作保護(hù)），60 ℃條件下進(jìn)行減壓濃縮后，加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，在油浴條件下反應(yīng)30 min （90 ℃），加入0.5 mL的乙酸酐，乙?；磻?yīng)30 min （90 ℃），進(jìn)行減壓濃縮（60 ℃）。氯仿萃取后的衍生物用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，取 0.2 μL樣品，GC-MS分析。

GC條件：進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃，柱箱起始溫度設(shè)置為160 ℃，保留3 min，然后以2 ℃·min-1的速度升至210 ℃，保持1 min，載氣是氦氣，流速設(shè)置為1.0 mL·min-1。

標(biāo)準(zhǔn)單糖為鼠李糖（Rha）、來蘇糖（Lyx）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）。標(biāo)品單糖做同上處理（宋坤，2014）。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 對DPPH自由基的清除作用 分別取2 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的SACP溶液及Vc溶液與0.5 mL的DPPH（2×10-4 mol·L-1）搖勻， 30 min后測各樣品吸光值A(chǔ)i。分別取DPPH溶液與70%的乙醇2 mL置于待測試管充分混合測得其吸光值A(chǔ)0。分別取2 mL待測液與70%的乙醇振蕩搖勻測吸光值A(chǔ)j，70%乙醇做空白。ACP的DPPH自由基清除能力測量方法同上。以Vc為對照品（Wang et al，2009）。依據(jù)式（2）來計(jì)算ACP、SACPHDS、SACPMDS、SACPLDS對DPPH自由基的清除率。

清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%（2）

1.2.5.2 對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除作用待測試管內(nèi)分別加入4.5 mL的pH8.20的Tris-HCl緩沖液（50 mmol·L-1）、4.2 mL蒸餾水和5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液 0.3 mL充分混合，在325 nm處測5次吸光值，30 s為一次，計(jì)算其吸光值與反映時(shí)間的變化率（△A0）。分別取濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液及Vc溶液2 mL加入3.2 mL蒸餾水混勻，在325 nm 處測定含樣品的鄰苯三酚溶液的吸光值，計(jì)算其吸光值隨時(shí)間的變化率（△A）。蒸餾水作空白。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以濃度對清除率的平均值作圖（Wang et al，2010）。依據(jù)式（3）計(jì)算樣品對O-2·的清除率。

清除率=[（△A0-△A）/△A0]×100%（3）

1.2.5.3 對Fe2+的螯合能力分別量取濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的SACP溶液及EDTA-2Na溶液1 mL，以及0.05 mL的FeCl2（2 mmol·L-1）充分混合，加入0.2 mL的5 mmol·L-1菲洛嗪（ferrozine）混勻， 10 min后，用蒸餾水調(diào)零，在562 nm處測吸光值A(chǔ)1。同樣操作以水代替多糖溶液為對照實(shí)驗(yàn)測定吸光值A(chǔ)0，同樣操作以水代替FeCl2溶液為樣品干擾實(shí)驗(yàn)測吸光值A(chǔ)2，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用（Wang et al，2010）。以式（4）計(jì)算對Fe2+螯合能力。

螯合率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（4）

1.2.5.4 對羥自由基（·OH）的清除作用在待測試管中分別加入2 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液、Vc溶液、水楊酸-乙醇溶液（9 mmol·L-1）、 FeSO4溶液（9 mmol·L-1）及H2O2（6 mmol·L-1），充分混合，水浴鍋加熱30 min溫度設(shè)定為37 ℃，510 nm處測得其吸光值A(chǔ)1。不加H2O2時(shí)的溶液吸光值為A2。不加樣時(shí)的溶液測得吸光值A(chǔ)0。蒸餾水作為參比。測量ACP 清除羥自由基·OH的方法同上。用 Vc 作為實(shí)驗(yàn)對照。重復(fù)3次，取濃度對清除率的平均值作圖（Zhao et al，2013）。用式（5）計(jì)算 SACPHDS、SACPMDS、SACPLDS對羥自由基·OH 的清除率。

清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（5）

1.2.5.5 還原力在試管中加入 1 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液、Vc溶液，2.5 mL的0.2 mol·L-1，pH6.6的磷酸鹽緩沖液（PBS）和K3Fe（CN）6溶液（1%），置于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，立即冷卻，加入2.5 mL TCA （10%），充分混合，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水， FeCl3溶液1 mL（0.1%），搖勻后，蒸餾水調(diào)零，700 nm處測定吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。還原能力和吸光值呈正相關(guān)關(guān)系（Qi et al，2006）。

2結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面結(jié)果

參數(shù)的最佳化分析采用Design Expert軟件進(jìn)行，結(jié)果見表2。對數(shù)學(xué)模型方程求一階偏導(dǎo)數(shù)為零，求出極點(diǎn)值轉(zhuǎn)換為酯化反應(yīng)，得到最佳測定條件：CSA/Py為2.53，反應(yīng)時(shí)間為5.23 h，反應(yīng)溫度為61.25 ℃，DS理論最大值為0.57。

以DS為響應(yīng)值，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合后建立數(shù)學(xué)模型為Y=0.85-0.035A+0.069B+3.75E-0.03AB-0.015AC+0.017BC-0.055A2-0.087B2-0.077C2（6）

這說明方程的擬合程度較好，通過方程可以很好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。模型的Prob>F，失擬項(xiàng)不顯著，表明在回歸方程中沒有失擬的因素存在，回歸式擬合較好，模型可信度高，可以通過該模型優(yōu)化制備SACP的工藝條件。

利用Design Expert軟件對CSA/Py、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表3。

2.1.1 因素間交互作用從圖1：A和圖1：B可以看出，隨著酯化時(shí)間增加，SACP的DS逐漸升高，但酯化時(shí)間過長，會引起多糖的部分降解。隨著反應(yīng)溫度的升高，DS呈先上升后下降的趨勢，由此發(fā)現(xiàn)溫度太低影響酯化反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)溫度太高多糖又會在高溫下降解。

從圖1：C和圖1：D可以看出，隨著時(shí)間的增加，DS明顯升高，但在高酸性條件下，酯化時(shí)間過長會引起多糖部分降解；CSA/Py的體積比小，CSA含量少，SACP的取代度較低；CSA的含量太高，高酸性條件會使得部分多糖降解，降低硫酸化的效果。

從圖1：E和圖1：F可以看出，溫度過高以及酸性太強(qiáng)都不利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。

根據(jù)實(shí)際操作的方便情況，選擇CSA/Py=2.5∶1，反應(yīng)溫度61 ℃，反應(yīng)時(shí)間5 h進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，具有較好的重復(fù)性，當(dāng)楤木根皮多糖鏈中伯羥基上的氫被硫酸基團(tuán)取代時(shí)，此條件下硫酸根取代度為0.56，證明了響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化SACP的可行性。

2.2 SACP的理化性質(zhì)

ACP能溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿和正丁醇。SACP能溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿和正丁醇。從表4可以看出，SACP總糖含量，蛋白含量均有所下降，這是由于多糖發(fā)生降解導(dǎo)致的。對多糖進(jìn)行改性目的之一，是為了提高多糖的溶解性。從表4看出，SACP的溶解性比ACP強(qiáng)很多。這是由于硫酸基團(tuán)的引入，使多糖溶解性增強(qiáng)。

2.3 SACP的表征

2.3.1 FT-IR從圖2可以看出，硫酸化前后多糖母體特征吸收未發(fā)生變化。新的吸收峰出現(xiàn)在1 242.11 cm-1和808.14 cm-1處，分別為S=O不對稱伸縮振動，及C-O-S的伸縮振動（劉琴等，2014）。這說明硫酸酯化反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生了，且隨著DS升高， 1 242.11 cm-1和808.14 cm-1處的吸收峰隨之增高。

800～850 cm-1之間的區(qū)域可用來推測出硫酸基的取代位置。845 cm-1、830 cm-1和810 cm-1分別對應(yīng)3位、2位和6位取代（Maciel et al，2008）。由此可知， SACP的C-6位發(fā)生了取代。這可能是因?yàn)镾ACP結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間位阻使得C-2、C-3的羥基很難發(fā)生反應(yīng)。

2.3.2 XPSXPS為一種物質(zhì)表面組成及結(jié)合狀態(tài)的表征手段。從圖3：A可以看出，SACP中出現(xiàn)了S 2p峰，這說明S已經(jīng)引入到SACP中，而樣品ACP中無S 2p峰的存在。從表5可以看出ACP和SACP的表面元素組成，發(fā)現(xiàn)SACP中出現(xiàn)了含量不同的S元素。由此可以確定SACP中有S的存在。從XPS測定的表面元素組成來看，SACP樣品中的S含量各不相同，這與我們之前測的元素分析結(jié)果有偏差，是因?yàn)閄PS測定的只能是SACP表面元素的相對含量，僅用于半定量，無法準(zhǔn)確定量， 且XPS的取樣深度小于100。因此， 對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子內(nèi)部，無法掃描。XPS主要為了表征S的價(jià)態(tài)，會和體相分析出的硫含量不同（王建祺，1992）。

從圖3：B可看出，C存在至少兩種以上的能態(tài)。圖 1溫度、時(shí)間及比例與取代度之間的交互作用我們根據(jù)譜峰的形狀特征對其進(jìn)行曲線擬合得到圖4。結(jié)合能在284.5 eV處為C-H，在286.1 eV處為C-OH。硫酸化后C 1s結(jié)合態(tài)的比例發(fā)生了較大變化，286.1 eV的峰減弱了，說明部分-OH發(fā)生取代。根據(jù)表面元素組成結(jié)果得到ACP的C/O為1.61，SACP的C/O為1.27。這說明-SO3-的引入使O的比例增加，導(dǎo)致SACP中C/O降低。圖3：C為ACP和SACP的O 1s譜，反應(yīng)前ACP的O 1s在535.5 eV處，反應(yīng)后O 1s移動了約0.2 eV，反應(yīng)前后出現(xiàn)位移情況說明取代基對O產(chǎn)生了影響。圖3：D為ACP和SACP的S 2p譜，在ACP中沒有S 2p， 在SACP中出現(xiàn)了明顯的S 2p信號峰，結(jié)合能為170.6 eV，S 2p的結(jié)合能在170 eV左右說明S為S6+，由此可以得到SACP中的S以-SO3-的形式存在。在制備酯化試劑的過程中，CSA的S為S6+，不存在其他氧化還原反應(yīng)，由此所得SACP圖 2CSA/Py 合成的SACP的紅外圖譜中的S為S6+。

2.3.3 分子量SACP的SEC-LLS色譜圖如圖5所示，圖5顯示為單一對稱峰值，表明SACP的均勻性，與ACP相比SACP的出峰時(shí)間晚于ACP。根據(jù)體積排阻色譜原理，分子量越小出峰時(shí)間越晚。ACP的分子量：重均分子量Mw=1.308×106 g·mol-1，數(shù)均分子量Mn=4.373×105 g·mol-1，分子量分布指數(shù)Mw/Mn=2.991。SACP的分子量：重均分子量Mw=1.96×105 g·mol-1，數(shù)均分子量Mn=6.06×104 g·mol-1，分子量分布指數(shù)Mw/Mn=3.234。通過數(shù)據(jù)可以得到，硫酸化后多糖分子量比硫酸化前小很多。這可能是在制備SACP的過程中，強(qiáng)酸對分子鏈發(fā)生了降解， 導(dǎo)致分子量變小（Yang et al，2005）。多糖的降解可能是由于多糖在酸性條件下不穩(wěn)定發(fā)生了水解反應(yīng)，所以在多糖硫酸化的反應(yīng)中去除殘留水是至關(guān)重要的一個(gè)步驟（Zou et al，2008）。

2.3.4 單糖組成從圖6和表6可以看出，ACP和SACP中4個(gè)峰的保留時(shí)間與單糖標(biāo)品中Ara、Man、Glc、Gal的色譜峰相吻合， 說明SACP的組成圖 5ACP和SACP的SEC-LLS檢測結(jié)果圖與未反應(yīng)前基本一致。從Ara、Man、Glc、 Gal幾種單糖組成可以看出，酯化反應(yīng)僅對取代基產(chǎn)生了影響，但是組成SACP單糖的摩爾比卻發(fā)生了較大變化。Ara由反應(yīng)前的11.58變?yōu)?.65，Man由反應(yīng)前的4.85變?yōu)?.24，Glc由反應(yīng)前的53.08變?yōu)?2.87，Gal由反應(yīng)前的16.87變?yōu)?0.08。這說明在進(jìn)行酯化反應(yīng)時(shí)，酯化試劑對多糖鏈進(jìn)行了降解。由于Ara、Glc、Gal比例的明顯降低，可推測出ACP的分子鏈在酯化反應(yīng)中降解的很厲害，導(dǎo)致了Ara、Glc、Gal單糖片段在整個(gè)反應(yīng)中的大量損失。

2.4 抗氧化活性測定

2.4.1 對DPPH自由基的清除作用以Vc作為陽性對照。樣品ACP和SACP都具有良好的清除DPPH自由基作用，測定結(jié)果如圖7所示。在整個(gè)有效濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，對DPPH的清除能力都呈現(xiàn)增長趨勢，具有濃度依賴性。高DS的多糖硫酸酯顯示出較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，其半抑制濃度IC50為 1.219 mg·mL-1。中等DS和低DS的清除DPPH自由基能力較弱，其半抑制濃度IC50分別為3.268 mg·mL-1和2.364 mg·mL-1。SACP對DPPH的清除能力都遠(yuǎn)高于ACP（IC50=3.902 mg·mL-1），濃度為1 mg·mL-1 時(shí)，差異增大。這說明硫酸化修飾可以顯著增強(qiáng)SACP對DPPH自由基清除活性，DS越高清除能力越強(qiáng)。多糖抗氧化活性的作用主要是由于其苯酚結(jié)構(gòu)的供氫質(zhì)子的能力，可使有 高度氧化性的自由基還原（Wang et al ，2014）。本研究中，H-DS具有最強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力， 可能是由圖 6GC-MS色譜圖于DS高的樣品具有更強(qiáng)的活化異頭碳?xì)湓拥哪芰?，其氫原子分解能力較強(qiáng)。

2.4.2 對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除作用ACP和SACP對超氧自由基的清除作用效果如圖8所示。SACP和ACP均具有清除O-2·能力，但不同濃度的樣品對超氧自由基的清除能力是不同的，隨著濃度增加清除O-2·效果逐漸增強(qiáng)。由圖8可知，在0.1 mg·mL-1時(shí)H-DS、M-DS、L-DS和ACP對O-2·的清除率分別為76.59%、70.32%、72.43%、34.29%，而在5 mg·mL-1時(shí)H-DS、M-DS、L-DS和ACP對O-2·的清除率分別為92.76%、88.56%、84.45%、80.33%。由此可以得到在有效濃度范圍內(nèi)，清除率與濃度呈正相關(guān)。在0.02～0.5 mg·mL-1范圍內(nèi)，改性后樣品清除O-2·的能力要強(qiáng)于Vc和ACP，所有改性后的樣品清除O-2·的效果優(yōu)于未改性前，隨著硫酸基含量升高多糖對O-2·的清除作用越強(qiáng)。Wang et al（2008）的研究表明DS較高的樣品顯示出更強(qiáng)的清除超氧自由基的作用，與本研究結(jié)果一致。因此，從DS角度分析，清除O-2·能力與DS呈正相關(guān)，DS越高，清除O-2·能力越強(qiáng)。

2.4.3 對Fe2+的螯合能力從圖9可以看出，ACP、H-DS、M-DS、L-DS都具有一定的金屬螯合能力，且隨著濃度不斷增大，對金屬的螯合能力不斷增強(qiáng)，所有樣品Fe2+的螯合能力與濃度呈依賴的關(guān)系。從圖9看出硫酸化前后多糖對Fe2+螯合能力都不是很強(qiáng)，并沒有明顯的DS依賴關(guān)系。姚磊等（2012）對豆渣纖維多糖進(jìn)行了改性，之后測定其對亞鐵離子的螯合能力，發(fā)現(xiàn)其樣品的亞鐵離子螯合能力和濃度呈劑量性依賴，和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4.4 對羥自由基（·OH）的清除作用 由圖10可知，ACP和SACP對·OH自由基都具有較好的清除作用。在0.01～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)，僅H-DS對·OH 的清除略高于ACP，而M-DS和L-DS 對·OH 的清除作用與ACP差別很小。濃度大于0.1 mg·mL-1時(shí)，硫酸基含量和多糖清除·OH 自由基的能力呈正相關(guān)。濃度為5 mg·mL-1時(shí)，H-DS、M-DS、L-DS和ACP對OH·的清除率分別為43.33%、39.31%、35.51%、30.13%。SACP、ACP 對·OH 的清除能力均低于同濃度的Vc。說明這些樣品中H-DS對·OH的清除能力最好，可能與樣品的分子量有關(guān)。Zou et al （2008）發(fā)現(xiàn)，分子量最低的樣品（1.27 × 104）具有最好的清除·OH的能力。說明樣品清除·OH自由基能力與DS、濃度呈正相關(guān)，DS越高濃度越大，清除·OH自由基能力越強(qiáng)。由此可以推斷出硫酸基和樣品的分子量對·OH 的清除起到重要作用。這與Qi et al（2005）的研究結(jié)果一致，其機(jī)理可能是由于高取代度樣品分子中一部分的-OH被-OSO3H取代了，從而提高了·OH清除能力。

2.4.5 還原力還原能力是潛在抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖11可知，在所選濃度范圍內(nèi)，ACP及不同DS的SACP都具有還原能力，總還原能力和濃度呈正相關(guān)關(guān)系，SACP的總還原力大于ACP，且這種趨勢在取代度增大的情況下越加明顯。Wang et al（2008）制備了海帶多糖硫酸酯，并測定其還原力，發(fā)現(xiàn)改性后的海帶多糖的還原力明顯提高，與本研究結(jié)果一致。這說明硫酸基的引入能提高SACP的還原力，可能是由于SACP較強(qiáng)的供氫能力。多糖的分子量是影響其抗氧化活性的一個(gè)重要參數(shù)，本研究結(jié)果顯示，DS較高而分子量較低的多糖樣品的還原力較好。因此，多糖抗氧化能力的強(qiáng)弱不是由單個(gè)因素決定的，而是多種因素共同作用的結(jié)果。

3結(jié)論

本研究采用氯磺酸-吡啶法（CSA-Py）合成了楤木根皮多糖硫酸酯（SACP），通過響應(yīng)面（RSM）實(shí)驗(yàn)確定了最佳反應(yīng)條件：CSA/Py為2.53，反應(yīng)時(shí)間為5.23 h，反應(yīng)溫度為61.25 ℃。采用紅外光譜（FT-IR）、X射線光電子能譜（XPS）、體積排阻色譜-激光光散射聯(lián)用法（SEC-LLS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對SACP進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過紅外光譜分析得知（FT-IR），新的吸收峰出現(xiàn)在1 242 cm-1和808 cm-1處。通過X射線光電子能譜（XPS）從全譜中可以很明顯的看出，SACP中出現(xiàn)了S 2p峰，S 2p的結(jié)合能在170.6 eV左右說明S為S6+。因此可以得到，SACP中的S以-SO3-的形式存在。采用體積排阻色譜-激光光散射聯(lián)用法（SEC-LLS）測得的平均分子量（Mw）顯示，酸性反應(yīng)導(dǎo)致Mw降低。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）檢測顯示SACP由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。通過實(shí)驗(yàn)檢測修飾前后產(chǎn)物抗氧化活性的變化，發(fā)現(xiàn)SACP有極好的清除O-2·的能力，有較好的清除DPPH自由基、·OH自由基的能力，還原力也很強(qiáng)，對Fe2+也有較好的螯合能力，具有濃度依賴性。這說明經(jīng)硫酸化修飾后，引入的硫酸根基團(tuán)使得多糖活性得到提高。這為今后楤木根皮多糖（ACP）的利用和藥理機(jī)制提供了進(jìn)一步的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

DAI ZL，DONG CW， 2005. Advances on the research of Ganoderma lucidum polysaccharides biological activities [J]. J Anhui Univ Chin Med， 24（5）：60-62. [戴則林， 董昌武， 2005. 靈芝多糖的生物活性研究進(jìn)展 [J]. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 24（5）：60-62.]

JIN WJ， LU XX， 2012. Antioxidant activity of sulfating Cantharellus cibarius polysaccharide in vitro [J]. Food Sci Technol， （10）：177-181. [靳文娟， 魯曉翔， 2012. 硫酸化雞油菌多糖的體外抗氧化作用研究 [J]. 食品科技， （10）：177-181.]

L GY， FAN LF， 2009. Development of research on lentinan [J]. Acta Agric Zhejiang， 21（2）：183-188. [呂國英， 范雷法， 2009. 香菇多糖研究進(jìn)展 [J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 21（2）：183-188.]

LIU Q， SONG K， YIN ZX， et al， 2014. Study on preparation， chemical structure and antioxidant activity of polysaccharide sulfate from watermelon [J]. Sci Technol Food Ind， 35（14）：107-113. [劉琴， 宋珅， 殷振雄， 等， 2014. 籽瓜多糖硫酸酯的制備工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性研究 [J]. 食品工業(yè)科技， 35（14）：107-113.]

MACIEL JS， CHAVES LS， BWS S， et al， 2008. Structural characterization of cold extracted fraction of soluble sulfated polysaccharide from red seaweed Gracilaria birdiae [J]. Carbohyd Poly， 71（4）：559-565.

QI H， ZHANG Q， ZHAO T， et al， 2005. Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa （Chlorophyta） in vitro [J]. Intern J Biol Macromol， 37（4）：195-199.

QI H， ZHANG Q， ZHAO T， et al， 2006. In vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa （Chlorophyta） [J]. Bioorg Med Chem Lett， 16（9）：2441-2445.

QIU MY， FENG LF， 2006. Reserch on the anti-aging effect of saponin of Aralia deceisneana Hance [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 17（2）：2480-2481. [裘名宜， 馮龍飛， 2006. 黃毛楤木皂苷的抗衰老作用研究 [J]. 時(shí)珍國醫(yī)藥， 17（12）：2480-2481.]

REN MP， LIU MH， CHEN Y， et al， 2009. Research on antitumor activity of Aralia saponins [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 20（1）：2480-2481. [任美萍， 劉明華， 陳怡， 等， 2009. 楤木皂苷抗腫瘤活性研究 [J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 20（1）：2417-2418.]

SONG K， 2014. Study on extraction， purification， monosaccharide composition， sulfation and hypoglycemic effect of Sphallerocarpus gracilis polysaccharide [D]. Lanzhou：Northwest Normal University：54-59. [宋珅， 2014. 黃參多糖的提取、分離純化、單糖組成、硫酸化修飾和降血糖作用研究 [D]. 蘭州：西北師范大學(xué)：54-59.]

WANG J， NIU S， ZHAO B， et al， 2014. Catalytic synthesis of sulfated polysaccharides Ⅱ： Comparative studies of solution conformation and antioxidant activities [J]. Carbohydrate Polymers， 107（1）：221-231.

WANG JL， ZHANG J， WANG XF， et al， 2009. A comparison study on microwave-assisted extraction of Artemisia sphaerocephala polysaccharides with conventional method：Molecule structure and antioxidant activities evaluation [J]. Intern J Biol Macromol， 45（5）： 483-492.

WANG JL， ZHANG J， ZHAO BT， et al， 2010. A comparison study on microwave-assisted extraction of Potentilla anserina polysaccharides with conventional method： Molecule structure and antioxidant activities evaluation [J]. Carbohyd Poly， 80（1）：84-93.

WANG J， ZHANG QB， ZHANG ZS， et al， 2008. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica [J]. Intern J Biol Macromol， 42（2）：127-132.

WANG JQ， 1992. Electronspectroscopy（XPS/XAES/UPS）introduction [M]. Beijing： National Defence Industry Press：38-98. [王建祺， 1992. 電子能譜學(xué)（XPS/XAES/UPS）引論 [M]. 北京：國防工業(yè)出版社：38-98.]

XIAO BJ， TAN ZX， LIANG WM， 2006. Studies on anti-inflammatory and immune effect of root bark of Aralia echinocaulis [J]. Chin J Mod Appl Pharm， 23（6）：438-440. [肖本見， 譚志鑫， 粱文梅， 2006. 刺莖楤木根皮抗炎和免疫作用的研究 [J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志， 23（6）：438-440.]

XU CP， ZHAO SS， YANG CC， et al， 2015. Sulfation and antioxidative activity of polysaccharide from flue-cured tobacco leaves [J]. Tobacco Sci Technol， 48（7）：41-45. [許春平， 趙珊珊， 楊琛琛， 等， 2015. 烤煙多糖的硫酸化修飾及抗氧化活性 [J]. 煙草科技， 48（7）：41-45.]

YANG J， DU Y， HUANG R， et al， 2005. The structure-anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide：Effect of carboxyl group and position of sulfation [J]. Intern J Biol Macromol， 36（1-2）：9.

YAO L， WANG ZY， ZHAO HT， et al， 2012. Antioxidant activities of polysaccharides from soil bean meal [J]. J NE Agric Univ， 43（11）：16-19. [姚磊， 王振宇， 趙海田， 等， 2012. 豆渣纖維改性多糖的抗氧化活性研究 [J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 43（11）：16-19.]

YANG TH， JIA M， MEI QB， 2003. Immunoloregulation effect of angelica polysaccharide isolated from Angelica sinensis [J]. Chin Pharma Bull， 19（4）：448-450. [楊鐵虹， 賈敏， 梅其炳， 2003. 當(dāng)歸多糖對小鼠免疫功能的影響 [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 19（4）：448-450.]

ZHAO B， WANG YF， HOU HH， 2015. Hypoglycemic effect of crude polysaccharide extract from Aralia chinensis on diabetic rice [J]. Food Sci， 36（13）：211-214. [趙博， 王一峰， 侯宏紅， 2015. 中國楤木粗多糖對糖尿病大鼠的降血糖作用 [J]. 食品科學(xué)， 36（13）：211-214.]

ZHAO BT， ZHANG J， GUO X， et al， 2013. Microwave-assisted extraction， chemical characterization of polysaccharides from Lilium davidii var. unicolor Salisb and its antioxidant activities evaluation [J]. Food Hydrocolloid， 31（2）：346-356.

ZOU C， DU Y， LI Y， et al， 2008. Preparation of lacquer polysaccharide sulfates and their antioxidant activity in vitro [J]. Carbohyd Poly， 73（2）：322-331.

ZHANG WJ， 1999. Saccharide complex biochemical research technology [M]. Hangzhou： Zhejiang University Press：7-126. [張惟杰， 1999. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù) [M]. 浙江：浙江大學(xué)出版社：7-126.]