川蔓藻內(nèi)生及根際細(xì)菌多樣性與抑菌活性研究

李菲　高程?！∮酂挕±罴意∫紫孳?/p>

摘要： 該研究采用稀釋涂布法結(jié)合形態(tài)觀察、16S rRNA基因序列分析，對廣西北海川蔓藻（Ruppia maritima）內(nèi)生及根際細(xì)菌的物種多樣性進(jìn)行了研究，并采用瓊脂擴(kuò)散法和光度計(jì)法分析了其粗提物抑制馬爾尼菲青霉菌活性。結(jié)果表明：從川蔓藻中分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌26株，根際可培養(yǎng)細(xì)菌31株。分別將內(nèi)生細(xì)菌歸屬為10科12屬13種，根際分離出細(xì)菌歸屬為9科14屬19種，其中5株根際細(xì)菌可能為潛在新種。獲得8株細(xì)菌對馬爾尼菲青霉菌有抑制活性，總陽性率為25.0%。其中，菌株BGMRC 2015、BGMRC 2059、BGMRC 2043的粗提物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制馬爾尼菲青霉菌效果，其MIC分別為（1.800±0.045）、（1.881±0.061）、（1.604±0.021）mg·mL-1。川蔓藻中可培養(yǎng)細(xì)菌具有較高的物種多樣性，蘊(yùn)藏著豐富的新物種資源，且富含抑菌活性良好的菌株。

關(guān)鍵詞： 川蔓藻， 細(xì)菌， 物種多樣性， 馬爾尼菲青霉菌， 抑菌活性

中圖分類號： Q939.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0924-10

Abstract： The purpose of this study was to investigate the diversity of endophytic and rhizospheric bacteria of Ruppia maritima collected from Beihai City and antifungal activities against Penicilliosis marneffei. The endophytic and rhizosphere bacteria isolated from Ruppia maritima were analyzed by method of dilution butteron on plate. 16S rRNA gene sequencing was employed to explore species diversities and the effects of the crude extract from bacteria against Penicilliosis marneffei with agar diffusion method and spectrophotometer method. Total of 26 strains of endophytic bacteria and 31 strains of rhizosphere bacteria were isolated from Ruppia maritina. Thirteen species of endophytic bacteria were obtained and classified into twelve genera and ten families. Nineteen species of bacteria were isolated from rhizosphere and belonging to fourteen generas and nine families. And five strains in the rhizosphere were potential new genera. Crude extracts of eight strains showed inhibition effect against Penicilliosis marneffei， three of which had strong antifungal activities， and their MIC50 were （1.800 ± 0.045）， （1.881 ± 0.061） and （1.604 ± 0.021） mg·mL-1. Endophytic and rhizospheric bacteria of Ruppia maritima are genetically diverse and most of them showed strong inhibition effects against Penicilliosis marneffei.

Key words： Ruppia maritima， bacteria， species diversity， Penicilliosis marneffei， antifungal activities

馬爾尼菲青霉菌（Penicilliosis marneffei）是一種獨(dú)特的具有傳染性的二相性真菌，在東南亞地區(qū)的艾滋病患者中最為常見，通常能感染AIDS患者及使用類固醇皮質(zhì)激素的病人，可作為診斷AIDS的一個(gè)輔助指標(biāo)（Huang et al， 2013）。馬爾尼菲青霉菌是一種條件致病菌，容易感染免疫功能低的人群，并引發(fā)播散性的馬爾尼菲青霉病。近年來，激素和免疫抑制劑以及廣譜抗生素使用廣泛，加上介入治療和器官移植的開展，艾滋病病人增加迅速，原發(fā)性和繼發(fā)性免疫功能低的人群逐漸擴(kuò)大，因此馬爾尼菲青霉病不斷增多。若不能及時(shí)獲得確診和有效的抗真菌治療，其死亡率極高（Wong et al，2001）。目前，治療馬爾尼菲青霉菌病的藥物有氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B等，往往都是兩種及兩種以上藥物結(jié)合使用。氟康唑作為首選藥物，其副反應(yīng)小，但治療青霉菌療效差，復(fù)發(fā)率高。因此，尋找到低劑量、高活性及副反應(yīng)小的馬爾尼菲青霉菌抑制劑顯得尤為重要。

川蔓藻是一種分布廣泛的底棲水生維管束植物，是全球溫帶、亞熱帶海域及鹽湖地區(qū)中發(fā)生自然恢復(fù)的先鋒植物，具有強(qiáng)的耐鹽性和去除氮磷能力。據(jù)報(bào)道，川蔓藻中的化學(xué)成分具有很好的生物活性，Dellagreca et al（2000）從川蔓藻中分離到7種具有抑制小球藻和羊角月牙藻活性的半日花烷型二萜類化合物。目前，川蔓藻的研究工作大部分集中在培育、防護(hù)、生態(tài)作用及其內(nèi)在成分影響因素上，而關(guān)于川蔓藻相關(guān)微生物研究未見報(bào)道，且馬爾尼菲青霉菌體外活性篩選的研究也鮮有報(bào)道。對廣西北海灘涂川蔓藻（Ruppia maritima）中可培養(yǎng)內(nèi)生和根際細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，并展開細(xì)菌發(fā)酵粗提物對馬爾尼菲青霉菌的抑制活性研究，以期為廣西北海灘涂川蔓藻開發(fā)利用以及臨床耐藥性馬爾尼菲青霉菌抑制劑的研發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本2015年4月27日直接在廣西北海灘涂（108°50′42″ E，21°55′25″ N）采集川蔓藻。用密封袋裝好，并將根部周邊土壤一起裝在密封袋內(nèi)，帶回處理。

1.1.2 試劑和儀器試劑：培養(yǎng)基原料、TAE緩沖液、2×EasyTaq SuperMix、引物（27f和1492r）、DNA Marker、GoldView核酸染料等購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Chelex-100樹脂購自美國BioRad公司；其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)的分析純試劑。儀器：SW-CJ-2F型超凈工作臺（杭州佳濾設(shè)備有限公司），HH.B11-BS-II型恒溫培養(yǎng)箱（東莞市恒宇儀器有限公司），恒溫振蕩器（美國CRYSTAL），VB-55型高壓滅菌鍋（德國SYSTEC），MINIB-100型金屬?。ê贾菝讱W儀器有限公司），MINI-6k型迷你離心機(jī)（常州市國旺儀器制造有限公司），Tgradient型PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra），電泳儀（美國BioRad），N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA），凝膠成像儀（Carestream），VCX750細(xì)胞破碎儀（美國Sonics）。

1.1.3 培養(yǎng)基（1）分離培養(yǎng)基：2216E，M10，M7，M9和AGG，詳情見表1。（2）純化培養(yǎng)基為改良的ISP2固體培養(yǎng)基。其中，酵母提取物為2.0 g，麥芽提取物為2.0 g，葡萄糖為2.0 g，瓊脂為14.0 g，海水為1 000 mL。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基為改良的ISP2液體培養(yǎng)基。（4）指示菌培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基和RPMI 1640液體培養(yǎng)基。

1.1.4 指示菌馬爾尼菲青霉菌，購買于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株的分離純化

1.2.1 植物組織預(yù)處理參照溝葉結(jié)縷草表面滅菌方法（王棟等，2008），先將川蔓藻用無菌水清洗，再用75%的酒精溶液浸泡2 min，最后用無菌水沖洗3遍以去除酒精。收集川蔓藻的最后1次漂洗液（表面消毒后的），并涂布在ISP2平板上，28 ℃培養(yǎng)72 h后若未見菌落生長，說明川蔓藻表面消毒徹底。取樣品0.5 g進(jìn)行研磨，先在研磨好的樣品中加入1 mL的無菌水，混合均勻后，制成10-1的植物懸液，然后依次制成10-2、10-3稀釋度的樣液，待用。

1.2.2 根際預(yù)處理用滅菌的竹簽輕輕撥開川蔓藻根部土壤，使其根系暴露出來，收集根須表面附著的土壤（距離根須5 mm以內(nèi)），先稱取2.0 g土壤樣品裝于20 mL無菌水（內(nèi)有玻璃珠）的錐形瓶中，手動搖勻，使其充分均質(zhì)即可，然后依次制成10-2、10-3稀釋度的樣液，盡快涂布處理。

1.2.3 接種分別取各梯度稀釋后的樣液0.2 mL，接種于5種分離培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度梯度平行接種于2個(gè)平板，28 ℃培養(yǎng)21 d后觀察形態(tài)變化，并挑選不同的菌落進(jìn)行純化，同時(shí)記錄菌落數(shù)和形態(tài)特征。將純化后的菌株制成凍干牛奶管于4 ℃中保存，同時(shí)制成20%（v/v）甘油管保存于-80 ℃中。

1.3 16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

用chelex-100樹脂提取菌種的DNA（周雙清等，2010），PCR擴(kuò)增參照Walsh et al（1991）的方法進(jìn)行。擴(kuò)增和測序引物均為細(xì)菌通用引物，即27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性8 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸維持10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。將5株潛在新種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶切膠回收，連接pEASY-T1克隆載體后，轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白篩選，挑取陽性克隆子，采用PCR法驗(yàn)證克隆的片段大小并送上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司測序。將測序結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行整理，用EzTaxon服務(wù)器（http：//www.eztaxon.org/）進(jìn)行在線比對；選取同源性最高的菌株序列作為參比對象，用MEGA5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)樹，用Boostrap 1 000次檢測各分支的置信值，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析（Tamura et al， 2011）。

1.4 細(xì)菌粗提物對馬爾尼菲青霉菌的敏感性

1.4.1 瓊脂擴(kuò)散法篩選活性菌株采用改良的瓊脂擴(kuò)散法（韋高和李菊裳，2005）測定馬爾尼菲青霉菌擴(kuò)散區(qū)域大小。挑取少量菌體，接種于RPMI 1640液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、180 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)24 h，制備菌懸液。將1%菌懸液（v/v）加入滅菌后的PDA固體培養(yǎng)基（冷卻至55 ℃左右）中混勻，將15 mL培養(yǎng)基倒入滅菌平皿中。待培養(yǎng)基凝固，然后將培養(yǎng)好的馬爾尼菲青霉菌打成直徑為6 mm的菌餅（初始菌餅）貼于平皿中，使有菌絲面朝下貼于每個(gè)含待測菌的PDA固體培養(yǎng)基中，每個(gè)板4塊菌餅，陰性對照為PDA固體培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)。隔天觀察一次結(jié)果，并用游標(biāo)卡尺測定馬爾尼菲青霉菌擴(kuò)散區(qū)域大小，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4.2 光度計(jì)法確定MIC值根據(jù)真菌藥物敏感試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化文件中的M38-A2（絲狀真菌稀釋法藥物敏感試驗(yàn)的參考方法-第二版）說明，設(shè)計(jì)體外抑制馬爾尼菲青霉菌活性測定實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.1 陽性對照組濃度值的確定參照體外抗真菌藥敏實(shí)驗(yàn)微量稀釋（Morace et al， 2002）、酶標(biāo)儀測定抗菌物質(zhì)抑菌活性（周子雄等，2014）和氣絲狀真菌吸光度測定（Kajimura & Kaneda， 1996）。在無菌條件下，使用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以馬爾尼菲青霉菌作為目的菌株，將菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基配制孢子懸浮液，使得培養(yǎng)液中孢子濃度為0.4～5×104 cfu·mL-1。將100 μL孢子懸浮液加入96孔板中，用少量DMSO溶解兩性霉素B（AMB）和酮康唑（KET），分別加入96孔板中，使其終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1及10 μg·mL-1。平衡5 min后，測定540 nm波長的OD值，記為OD1值；將96孔板放置25 ℃培養(yǎng)3 d后，測定540 nm波長的OD值，記為OD2值。以DMSO作為空白對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，確定兩性霉素AMB的MIC100（完全抑制真菌的最小抑制濃度的MIC，下同）和酮康唑KET的MIC80（抑制80%真菌最小抑制濃度的MIC，下同），重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定兩性霉素B（AMB）和酮康唑（KET）對馬爾尼菲青霉菌最低抑制濃度MIC值。

計(jì)算公式：

抑制率=△OD空白組-（OD1-OD2）△OD空白組×100%。

1.4.2.2 細(xì)菌粗提物的制備將活性好的細(xì)菌置于ISP2固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取生長于對數(shù)期后的菌株接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，每株菌接種6瓶，180 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液用細(xì)胞破碎儀處理20 min，將處理后的發(fā)酵液用1∶1（v/v）乙酸乙酯萃取3次，每次間隔至少20 min。濃縮干燥后，置于干燥器中保存，備用。

1.4.2.3 菌株發(fā)酵粗提物的最小抑制濃度MIC50將馬爾尼菲青霉菌接種于PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基配制孢子懸浮液，使得培養(yǎng)液中孢子濃度為0.4～5×104 cfu·mL-1。用DMSO和RPMI 1640液體培養(yǎng)基將菌株發(fā)酵粗提物配制一系列濃度藥液。取100 μL菌懸液和100 μL藥液加入96孔板中，藥液終濃度為1.25、2.5、5.0 mg·mL-1。每濃度設(shè)置3個(gè)平行，以4 μg·mL-1酮康唑?yàn)殛栃詫φ战M，DMSO為空白對照。記錄和計(jì)算數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

2結(jié)果與分析

2.1 川蔓藻中內(nèi)生及根際細(xì)菌多樣性分析

采用5種分離培養(yǎng)基，從川蔓藻組織和根際中分別分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌26株和31株，按照菌落的大小、形態(tài)、顏色和出現(xiàn)時(shí)間等進(jìn)行細(xì)菌排重，選取44株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因序列對比，獲得13種內(nèi)生細(xì)菌及19種根際細(xì)菌，隸屬于14科24屬（表2）。

初步鑒定結(jié)果表明，川蔓藻內(nèi)生細(xì)菌隸屬于3門8科12屬。根據(jù)13株內(nèi)生細(xì)菌及其參比菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。初步鑒定結(jié)果表明，川蔓藻根際細(xì)菌隸屬于4門8科14屬。根據(jù)19株根際細(xì)菌及其參比菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

從川蔓藻根際中分離到5株細(xì)菌的16S rRNA基因序列（約1 500 bp），它們與其最近緣的典型菌株序列相似性低于97%。菌株BGMRC 2019與紅桿菌科的有效發(fā)表菌株Albidovulum xiamenense YBY-7T （HQ709061），BGMRC 2046與Stappia_f科的有效發(fā)表菌株Stappia indica B106T （EU726271），BGMRC 2048與黃桿菌科的有效發(fā)表菌株Hwangdonia seohaensis HD-3T（JX546142），BGMRC 2050與根瘤菌科的有效發(fā)表菌株Rhizobium sphaerophysae CCNWGS0238T（FJ154088），BGMRC 2054與紅桿菌科有效發(fā)表菌株Oceanicola litoreus M-M22T（JX291104）發(fā)育關(guān)系最密切，其相似率分別為93.46%、95.96%、95.27%、96.10%和96.03%?；?6S rRNA基因序列，5株潛在新種與其所在菌科中鄰近菌株構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹，均能與其相似菌株在進(jìn)化樹上聚為一簇，在采用Maximum-Likelihood法和Maximum-Parsimony法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中5株菌種同樣形成了一個(gè)獨(dú)立分枝。由此推測，菌株BGMRC 2019、BGMRC 2046、BGMRC 2048、BGMRC 2050及BGMRC 2054分別為紅桿菌科、Stappia_f科、黃桿菌科、根瘤菌科及紅桿菌科中的一個(gè)潛在新分類單元。

2.2 不同培養(yǎng)基對內(nèi)生及根際細(xì)菌的分離效果

采用5種分離培養(yǎng)基，從川蔓藻組織及其根際中分離到細(xì)菌共57株，其中將44株細(xì)菌進(jìn)行測序比對，它們在不同培養(yǎng)基上的分離效果如圖3所示。從5種分離培養(yǎng)基的分離效果來看，M10培養(yǎng)基（含有水解酪素）分離到的細(xì)菌種類最多，包含12個(gè)菌屬；M9培養(yǎng)基（含有精氨酸、寡營養(yǎng)）分離到的細(xì)菌種類最少。根據(jù)菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，AGG、M10、M7、M9和2216E培養(yǎng)基上菌落數(shù)分別為1.2×105、1.8×105、4.0×104、6.0×104和5.0×104 cfu·mL-1。M10分離培養(yǎng)基獲得13株細(xì)菌，隸屬于12屬，其獲得的菌株數(shù)和多樣性均較高；M9分離培養(yǎng)基獲得5株細(xì)菌，獲得的細(xì)菌數(shù)較少，且多樣性較少。就新穎性而言，16S rRNA基因序列相似性小于97%的菌株共有5株，占分離細(xì)菌總數(shù)的8.77%。其中2株潛在新菌（2048和2054）從M10培養(yǎng)基分離獲得，4株（2019，2046，2048和2050）潛在新菌從2216E培養(yǎng)基分離獲得。

2.3 內(nèi)生及根際細(xì)菌的屬級水平上的韋恩圖分析

在屬級水平上對川蔓藻組織及其根際來源細(xì)菌進(jìn)行venn分析（圖4），從川蔓藻組織來源的13株細(xì)菌，隸屬于12屬，而從根際來源的19株細(xì)菌，隸屬于14屬。韋恩圖顯示，從川蔓藻組織和根際中獲得細(xì)菌種類存在較大的差異，共同含有兩個(gè)屬Pseudomonas sp.和Bacillus sp.。

2.4 細(xì)菌發(fā)酵粗提物對馬爾尼菲青霉菌的抑制活性

2.4.1 活性菌株篩選結(jié)果對分離純化的32株細(xì)菌進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明，有8株細(xì)菌具有抑制效果，總陽性率為25.0%。其中，有3株細(xì)菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制效果（圖6）。馬爾尼菲青霉菌擴(kuò)散的區(qū)域越小，其生長受到抑制作用越大，反之則越小?？瞻讓φ瞻宓鸟R爾尼菲青霉菌擴(kuò)散區(qū)域達(dá)到18～25 mm，實(shí)驗(yàn)組的馬爾尼菲青霉菌擴(kuò)散區(qū)域小于12 mm，含BGMRC 2043菌液板上未觀察到馬爾尼菲青霉菌擴(kuò)散區(qū)。

2.4.2 光度計(jì)法確定MIC值重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩性霉素B（AMB）的MIC100為（3.573±0.121）μg·mL-1，酮康唑（KET）的MIC80為（3.828±0.074）μg·mL-1，DMSO對馬爾尼菲青霉菌無抑制作用。

選取3株活性高的菌株進(jìn)行抑菌活性效果測定。表3結(jié)果顯示，在藥液濃度為1.25 mg·mL-1時(shí)，2015和2059菌對馬爾尼菲青霉菌的抑菌率均很相近，而2043菌株的抑菌率是2015和2059菌的近兩倍；在藥液濃度為2.5和5.0 mg·mL-1時(shí)，2015、2059和2043菌對馬爾尼菲青霉菌的抑菌率均很相近。用SPSS軟件計(jì)算3株細(xì)菌粗提物抑制50%馬爾尼菲青霉菌的藥物濃度，即MIC50。2043菌株粗提物的抑菌效果最佳，其MIC50為（1.604±0.021）mg·mL-1；2015和2059菌的抑菌效果相近，其MIC50值分別為（1.800±0.045）、（1.881±0.061）mg·mL-1。另外，陽性對照選用4 μg·mL-1酮康唑，其抑菌率為0.859 2±0.012。

3討論

存在于潮間帶生態(tài)系統(tǒng)中的微生物類群具有高生產(chǎn)力和多樣性，它們不斷將凋亡的潮間帶生物中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為植物可利用的C、P等，同時(shí)潮間帶植物莖、葉、根的滲出物又為微生物的生長提供養(yǎng)分，使其周圍的微生物多樣性更加豐富（楊雋嫻，2008）。與南方沿海潮間帶生長的紅樹植物相比，近海潮間帶鹽生植物的研究相對較少。圖 5培養(yǎng)1周后馬爾尼菲青霉菌的抑制效果川蔓藻作為一種鹽生植物生存在潮汐帶間，與陸地人工培育的川蔓藻的生存環(huán)境極其不同，其代謝途徑會為了適應(yīng)生存環(huán)境而發(fā)生相應(yīng)改變。為了掌握廣西北海灘涂上川蔓藻中可培養(yǎng)的內(nèi)生與根際細(xì)菌組成，本研究分別對川蔓藻的組織與根際進(jìn)行采樣，利用5種培養(yǎng)基，從中分離獲得了大量細(xì)菌資源。研究發(fā)現(xiàn)，川蔓藻內(nèi)生及根系呈現(xiàn)出較高的細(xì)菌生物多樣性，從川蔓藻中分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌26株，歸屬為10科12屬13種；根際可培養(yǎng)細(xì)菌31株，歸屬為9科14屬19種，其中5株根際細(xì)菌為潛在新物種。其中，在植物內(nèi)和根際中均分離到優(yōu)勢菌屬Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，其能廣泛分布在動植物內(nèi)部及其生長的環(huán)境，兩者間即存在著相互競爭，又相互產(chǎn)生作用。普遍認(rèn)為，根際土壤細(xì)菌是植物根部內(nèi)生細(xì)菌主要來源，它在植物根系的微生物環(huán)境中對物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化起重要作用（龐欣等，2000）。結(jié)果顯示，在植物內(nèi)和根際中分離到兩個(gè)共同屬，即Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，這一結(jié)果與部分研究報(bào)道大相庭徑。陸松柳等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，植物根際微生物的數(shù)量、類群、優(yōu)勢種等存在很大差異，這主要與植物根系分泌物的種類和數(shù)量有關(guān)系，分泌物會隨植物種類的不同而存在差異。根系分泌物是植物作用于濕地微環(huán)境的重要途徑之一（夏北成等，1998），植物通過根系分泌物的釋放來改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤環(huán)境受到植物生長的影響，使得土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生改變，受植被影響的土壤環(huán)境中土壤微生物群落多樣性比其他未受植被影響土壤環(huán)境中的微生物群落多樣性要高很多。

對這32株細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性研究，發(fā)現(xiàn)有8株細(xì)菌對馬爾尼菲青霉菌有抑制作用，總陽性率為25.0%；其中，有3株細(xì)菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌活性。該3株細(xì)菌為BGMRC 2015、BGMRC 2059和BGMRC 2043，分別與Bacillus vietnamensis 15-1T、Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42T和Pseudomonas mosselii CIP 105259T相似性最高。其中，BGMRC2043的MIC50為（1.604±0.021）mg·mL-1。多種芽孢桿菌屬的細(xì)菌通過競爭營養(yǎng)空間、產(chǎn)生脂肽類抗生素、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等，具有抗菌、抗腫瘤和抗炎癥等生物活性（唐金山等，2008）。對于菌株P(guān). mosselii CIP 105259T，Nishanth et al（2016）系統(tǒng)地進(jìn)行了該菌代謝產(chǎn)物的活性實(shí)驗(yàn)分析，其代謝產(chǎn)物中有活性小分子Pseudopyronine B，具有很好的抑制革蘭氏陽性細(xì)菌、抗植物病原真菌、抑制細(xì)胞增長及抗癌等活性。本研究發(fā)現(xiàn)，P. mosselii CIP 105259T對馬爾尼菲青霉菌也具有極強(qiáng)的抑制活性，本研究豐富對P. mosselii CIP 105259T菌株抑菌活性的認(rèn)識，也為開發(fā)新的抗生素及活性藥物等下游工作提供很好的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

DELLAGRECA M， FIORENTINO A， ISIDORI M， et al， 2000. Antialgal ent-labdane diterpenes from ruppia maritima [J]. Phytochemistry， 55（8）， 909.

HUANG Z， HU Y， SHOU L， et al， 2013. Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7 [J]. BMC Microbiol， 13（1）： 1-8.

KAJIMURA Y， KANEDA M， 1996. Fusaricidin A， a new depsipeptide antibiotic produced by Bacillus polymyxa KT8. Taxonomy， fermentation， isolation， structure elucidation and biological activity [J]. Cheminform，49（2）：129-135.

LU SL， ZHANG C， XU JW， 2011. Root exudates of wetland plants and the influence on the microbial community in constructed wetlands [J]. Ecol Environ Sci， 20（4）： 676-680. [陸松柳， 張辰， 徐俊偉， 2011. 植物根系分泌物分析及對濕地微生物群落的影響研究 [J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 20（4）： 676-680.]

MORACE G， AMATO G， BISTONI F， et al， 2002. Multicenter comparative evaluation of six commercial systems and the national committee for clinical laboratory standards M27-A Broth microdilution method for Fluconazole susceptibility testing of Candida species [J]. J Clin Microbiol， 40（8）：2953-2958.

NISHANTH KS， ARAVIND SR， JUBI J， et al， 2016. Pseudopyronine B： A potent antimicrobial and anticancer molecule isolated from a Pseudomonas mosselii [J]. Front Microbiol， 7（79）：1-15.

PANG X， ZHANG FS， WANG JG， 2000. Effect of different nitrogen levels on SMB-N and microbial activity [J]. Plant Nutr Fert Sci，6（4）：476-480. [龐欣， 張福鎖， 王敬國， 2000. 不同供氮水平對根際微生物量氮及微生物活度的影響 [J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 6（4）：476-480.]

TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al， 2011. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods [J]. Mol Biol Evol， 28（10）： 2731-2739.

TANG JS， GAO H， DAI Y， et al， 2008. Progress on the studies of cyclic lipopeptides [J]. Acta Pharm Sin， 43（9）：873-883. [唐金山， 高昊， 戴毅， 等， 2008. 環(huán)脂肽類成分研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 43（9）：873-883.]

WALSH PS， METZGER DA， HIGUCHI R， 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material [J]. Biotechniques， 10（4）：506-513.

WANG D， KEYIMU MHMT， YU YX， et al， 2008. Screening of surface sterilization methods in the tissue culture of Zoysia matrella [J]. J Anhui Agric Sci， 36（20）：8560-8561. [王棟， 買合木提·克衣木， 玉永雄， 等， 2008. 溝葉結(jié)縷草組織培養(yǎng)表面滅菌方法的篩選 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 36（20）：8560-8561.]

WEI G， LI JS， 2005. Susceptibility study onmolecular biology and diphasic form of Penicilliosis marneffei to the antifungal agents in vitro [J]. Intern Med Chin， （1）：119-121. [韋高， 李菊裳， 2005. 馬爾尼菲青霉分子生物學(xué)及體外藥敏試驗(yàn)的進(jìn)展 [J]. 中國醫(yī)學(xué)文摘：內(nèi)科學(xué)，2005（1）： 119-121.]

WONG SSY， WONG KH， HUI WT， et al， 2001. Differences in clinical and laboratory diagnostic characteristics of Penicilliosis marneffei in human immunodeficiency virus （HIV）- and non-HIV-infected patients [J]. J Clin Microbiol， 39（12）：4535-4540.

XIA BC， ZHOU JZ， TIEDJE JM， 1998. Effects of overlying vegetation on soil microbial community structures and their activity [J]. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni， 37（3）： 94-98. [夏北成， ZHOU JZ， TIEDJE JM， 1998. 土壤微生物群落及其活性與植被的關(guān)系 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 37（3）： 94-98.]

YANG JX， 2008. The collection and identification of medicine microorganisms in plant habitats of littoral zone [D]. Qing-dao： Qingdao Univ Sci Technol. [楊雋嫻， 2008. 潮間帶植物生境藥用微生物的獲得與鑒定 [D]. 青島： 青島科技大學(xué).]

ZHOU SQ， HUANG XL， HUANG DY， et al， 2010. A rapid method for extracting DNA from actinomycetes by Chelex-100 [J]. Biotechnol Bull， 26（2）：123-125. [周雙清， 黃小龍， 黃東益， 等， 2010. Chelex-100快速提取放線菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 26（2）：123-125.]

ZHOU ZX， HUANG QH， ZHU S， et al， 2014. Establishment of rapid determining method for antibacterial activity by microplate reader [J]. Adv Microbiol， 3：29-35. [周子雄， 黃慶華， 朱爽， 等， 2014. 酶標(biāo)儀快速測定抗菌物質(zhì)抑菌活性方法的建立 [J]. 微生物前沿， 3：29-35.]