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    基于腸道菌群探討保和丸對高脂飲食SD大鼠血脂的作用

    2018-09-10 16:55:59李玉波馬雪玲李志更賈海驊梁媛郝改梅
    世界中醫(yī)藥 2018年9期
    關(guān)鍵詞:保和丸腸道菌群血脂

    李玉波 馬雪玲 李志更 賈海驊 梁媛 郝改梅

    摘要 目的:觀察保和丸對高脂飲食SD大鼠血脂和腸道菌群的影響,為臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。方法:將60只大鼠隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、高脂飲食保和丸組(簡稱“高保組”)、正常飲食保和丸組(簡稱“正保組”),Elisa法檢測大鼠血清血脂含量,基于16SrDNA基因測序技術(shù)分析大鼠腸道菌群。結(jié)果:高保組大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量與模型組比較明顯減少但仍高于正常組和正保組,正保組與正常組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腸道菌群分析結(jié)果顯示正保組與正常組大鼠比較,其糞便樣本微生物菌群數(shù)量無明顯差異。高保組與模型組比較能顯著增加綱雙歧桿菌目、梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細(xì)菌目菌群數(shù)量,但仍低于正常組和正保組;同時(shí)能顯著減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數(shù)量,但仍高于正常組和正保組。結(jié)論:保和丸可能通過改變腸道菌群多樣性來降低TC、TG和LDL-C。

    關(guān)鍵詞 腸道菌群;保和丸;高脂飲食;血脂

    Abstract Objective:To observe the effects of Baohe Pills on blood lipid and intestinal microbiota in SD rats with a high-fat diet to provide reference for clinical application and experimental research.Methods:A total of 60 rats were randomly divided into 4 groups:normal group,model group,high-fat diet with Baohe pills group (HB group) and the normal diet with Baohe pills group (NB group).The serum lipid level was detected by Elisa method,and the intestinal microbiota of rats was analyzed based on 16S rDNA gene sequencing technique.Results:the contents of serum cholesterol (TC),triglyceride (TG) and low-density lipoprotein (LDL-C) in the rats of HB group were decreased more significantly than those of the model group,but less than those of the normal group and the NB group.There was no statistically significant difference between the normal group and the NB group.The results of intestinal microbiota analysis showed no significant difference in number of fecal microbial flora between the NB group and the normal group.Compared with the model group,the numbers of Bifidobacteriales,Clostridiales,Desulfovibrionales,and RF9 bacteria of HB group decreased more than that of the normal group and the NB group.In the meantime,compared to the model group,the HB group experienced a significantly reduction in the number of Coriobacteriales,Bacteroidales,Bacillales,Lactobacillales,Erysipelotrichales,Burkholderiales,Aeromonadales,Verrucomicrobiales,etc.,but the number was still higher than that of the normal group and the NB group.Conclusion:Baohe pills may reduce TC,TG and LDL-C by altering the diversity of intestinal microbiota.

    Key Words Intestinal microbiota; Baohe Pills; High-fat diet; Blood lipid

    中圖分類號(hào):R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.003

    當(dāng)前諸多研究顯示,長時(shí)間的高脂飲食可以長期而持續(xù)的改變腸道微生態(tài)[1-3],腸道菌群失調(diào)可以引起脂代謝紊亂,導(dǎo)致高脂血癥[4-8]。而保和丸為消食劑,具有消食、導(dǎo)滯、和胃之功效,臨床上具有降低血脂的作用[9-11]。本研究采用高脂飲食長期喂養(yǎng)SD大鼠,觀察保和丸對其血脂和腸道菌群的影響,探討保和丸消食作用的現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)涵。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠60只,SPF級(jí),6周齡,體重范圍(250±10)g,購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司,按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分成4組,即模型組、正常組、高脂飲食保和丸組(簡稱“高保組”)、正常飲食保和丸組(簡稱“正保組”),每組15只,飼養(yǎng)高保組和模型組小鼠所需的高脂飼料也購買自北京維通利華生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的許可。

    1.1.2 藥物 保和丸(水丸)(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z11020921),用法用量:1次1袋,2次/d。人(70 kg)與大鼠(0.2 kg)間藥量折算系數(shù)為6.3,若70 kg成人1次的用藥劑量為6 g,則轉(zhuǎn)化為0.25 kg大鼠1次的用藥量為0.135 g。將6 g保和丸溶于22 mL生理鹽水,得到0.27 g/mL的保和丸溶液,給藥體積為0.5 mL。

    1.2 方法

    1.2.1 分組與模型制備 高保組高脂飼料飼養(yǎng),正保組普通飼料飼養(yǎng),每組每只每日灌胃0.5 mL保和丸溶液2次,早8:00和晚20:00各1次;模型組大鼠高脂飼料飼養(yǎng),正常組大鼠普通飼料飼養(yǎng),每組每只每日灌胃0.5 mL生理鹽水2次,早8:00和晚20:00各1次。

    1.2.2 收集樣本(糞便和血清) 實(shí)驗(yàn)7周后取材,取材前1天7:00—23:00,間隔8 h收集4組大鼠的新鮮正常糞便,每次每組收集10個(gè)大小、質(zhì)地相同的糞便,總共收集到120個(gè)樣本。取材當(dāng)天用10%水合氯醛麻醉大鼠(根據(jù)每只大鼠的體重計(jì)算水合氯醛的使用量),用一次性滅菌注射器腹主動(dòng)脈取血2~3 mL,置于黃色采血管中離心,抽取血清,共計(jì)40個(gè)樣本。所有樣本均保存于-80 ℃恒溫冰箱。

    1.2.3 糞便樣本DNA提取和PCR擴(kuò)增 DNA快速提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,解凍糞便樣本后提取細(xì)菌DNA,吸取5 μL,通過紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度、分析DNA質(zhì)量和數(shù)量。

    PCR擴(kuò)增的范圍為16SrDNA V3~V4可變區(qū),引物由北京奧維森基因科技有限公司合成,序列為5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′/5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),2%瓊脂糖凝膠電泳檢測同一樣本的PCR混合產(chǎn)物,AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(購自AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物。

    1.2.4 熒光定量、Miseq文庫構(gòu)建和上機(jī)測序 此步驟由北京奧維森基因科技有限公司完成。

    1.2.5 Elisa法檢測4組大鼠血脂水平 大鼠血脂4項(xiàng)指標(biāo)具體為:血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C),Elisa試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用隨機(jī)區(qū)組方差分析大鼠血脂水平。采用R語言工具、抽平分析、秩和檢驗(yàn)和Anosim相似性分析腸道細(xì)菌群落。

    2 結(jié)果

    2.1 4組大鼠飼養(yǎng)7周后血脂水平 模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量明顯高于正常組,HDL-C含量明顯低于正常組。正保組大鼠TC、TG、LDL-C含量與正常組比較略有減少,HDL-C含量略有增加,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高保組TC、TG、LDL-C含量與模型組比較明顯減少但仍高于正常組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),HDL-C含量與模型組比較略有增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但仍低于正常組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 腸道菌群多樣性分析

    2.2.1 OTU分布 利用R語言工具統(tǒng)計(jì)分析(選用相似水平為97%)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目,并繪制Venn圖。

    2.2.2 Alpha多樣性指數(shù) 抽平分析最低序列數(shù)的樣本數(shù),4組大鼠腸道菌群多樣性指數(shù)。見表2。模型組腸道菌群多樣性明顯少于正常組,正保組與正常組腸道菌群數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高保組腸道菌群多樣性明顯多于模型組,但仍略低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2.3 Anosim相似性分析結(jié)果 4組大鼠腸道菌群比較,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(兩兩比較R值均大于0),正常組與正保組大鼠腸道菌群比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

    2.2.4 群落結(jié)構(gòu)分析 經(jīng)過Anosim相似性分析,將4組大鼠糞便樣本中存在差異的菌群進(jìn)行了聚類,模型組菌群數(shù)量主要集中在放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門等,與正常組比較存在顯著性差異,其中雙歧桿菌目、梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細(xì)菌目菌群數(shù)量模型組明顯減少,其余明顯增加。正保組與正常組大鼠比較,其糞便樣本微生物菌群數(shù)量無明顯差異。高保組與正常組、正保組、模型組比較,糞便樣本微生物菌群數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高保組與模型組比較能顯著增加綱雙歧桿菌目、梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細(xì)菌目菌群數(shù)量,但仍低于正常組和正保組;同時(shí)能顯著減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數(shù)量,但仍高于正保組和正常組。具體如表4、圖2所示。

    3 討論

    從4組大鼠飼養(yǎng)7周后血清血脂含量來看,高保組能明顯降低TC、TG、LDL-C含量,說明保和丸具有一定的降低血脂的作用。中醫(yī)學(xué)臟象理論中的“脾”的內(nèi)涵與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所指的消化系統(tǒng)相似,而腸道菌群在消化過程中發(fā)揮著重要的作用,本研究表明保和丸對高脂飲食大鼠的腸道菌群有明顯的改變,這或許是保和丸降低血脂的作用機(jī)制之一。

    大多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為痰濁、瘀血為血脂異常的主要致病因素[12]。《臨證指南醫(yī)案》曰:“濕為重濁有質(zhì)之邪,若從外而受者,皆由地中之氣升騰;從內(nèi)而升者,皆由脾陽之不足。亦有外不受濕,而但從內(nèi)生者,必其人膏粱酒醴過度,或嗜飲茶湯太多,或食生冷瓜果及甜膩之物”。又《世補(bǔ)齋醫(yī)書》云:“自逸病之不講,而世但知有勞病,不知有逸病。然而逸之為病,正不小也……安逸所生病與勞相反……夫逸之病,脾病也”。可見過逸少勞可致脾氣虛弱,水谷精微化生乏力,清濁混淆而發(fā)為高脂血癥。保和丸是消食劑的代表方,方中山楂消油膩肉積;神曲消酒食陳腐之積;萊菔子消面食痰濁之積;陳皮、半夏、茯苓理氣和胃,燥濕化痰;連翹散結(jié)清熱;諸藥合用,有消食導(dǎo)滯,理氣和胃之功。

    人類的腸道菌群豐富度超過3 500種[15],其中厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占了95%以上[16]。

    許多循證醫(yī)學(xué)研究指出:高脂血癥患者腸道菌群失衡,主要表現(xiàn)為雙歧桿菌等益生菌菌群數(shù)量減少,而大腸桿菌、幽門桿菌等菌群數(shù)量明顯增加[17-20]。本研究從腸道菌群分析結(jié)果來看,保和丸能促進(jìn)雙歧桿菌目菌群數(shù)量,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。同時(shí)保和丸還能促進(jìn)梭菌目、脫硫弧菌目、產(chǎn)氫細(xì)菌目菌群數(shù)量,減少紅蝽菌目、擬桿菌目、芽孢肝菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目、伯克氏菌目、氣單胞菌目、疣微菌目菌群數(shù)量。

    生物與環(huán)境的統(tǒng)一論是微生態(tài)學(xué)的基本觀點(diǎn),這與中醫(yī)學(xué)基本觀點(diǎn)整體觀具有統(tǒng)一性,機(jī)體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng),是正常微生物群與宿主和環(huán)境相互依賴、相互作用的統(tǒng)一有機(jī)整體[21]。具體而言,微生態(tài)學(xué)與中醫(yī)學(xué)都講究平衡與調(diào)節(jié),微生態(tài)學(xué)有平衡理論對應(yīng)中醫(yī)學(xué)有陰陽五行學(xué)說、微生態(tài)學(xué)有微生態(tài)調(diào)節(jié)論對應(yīng)中醫(yī)學(xué)有扶正祛邪理論[22],因此,腸道微生態(tài)原理可以成為中西醫(yī)結(jié)合的一個(gè)切入點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示中醫(yī)經(jīng)典古方保和丸具有一定的降低血脂的作用,并且一直以來臨床上無不良反應(yīng)報(bào)道,因此在臨床降脂用藥方面,保和丸的應(yīng)用或許能一定程度的減少他汀類等降脂化學(xué)藥物的使用從而減少他汀類藥物的不良反應(yīng)。

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    (2018-06-04收稿 責(zé)任編輯:張文婷)

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