基于iTRAQ技術(shù)的慢性心力衰竭氣虛血瘀證及氣陰兩虛證組差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

孟永梅 王 偉

(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特，010110； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

慢性心力衰竭(CHF)是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，也是最為主要的死亡原因之一。CHF是目前唯一發(fā)病率仍在顯著上升的心血管疾病,且醫(yī)療費用比較高[1]。最新研究結(jié)果表明衰弱的心肌從代償期轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斊诎l(fā)生的細(xì)胞改變中，發(fā)現(xiàn)RBFox2減少與心肌衰弱之間的功能聯(lián)系[2]。在人群中心力衰竭的發(fā)病率為1.5% ～5.6%，65歲以上者達(dá)到7.4%，2年死亡率為37%，6年死亡率為82%，5年存活率與惡性腫瘤相仿?？梢娦牧λソ邍?yán)重影響著患者的生命質(zhì)量和壽命，故心力衰竭的防治一直成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界研究領(lǐng)域中的核心問題。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個重要組成部分，它通過比較生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾，揭示其疾病的病理生理過程具有重要意義。iTRAQ技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)2004年開發(fā)的同位素標(biāo)記相對和絕對定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)技術(shù)，它是建立在iTRAQTM試劑的基礎(chǔ)上，可同時對多種樣品進(jìn)行絕對和相對定量的研究方法，該項技術(shù)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域[3-6]。該方法具有較好的精確性和可重復(fù)性，故彌補了DIGE及ICAT的不足。迄今為止多數(shù)方法只能進(jìn)行2個蛋白質(zhì)樣品的同步比較，目前iTRAQ試劑能夠同時進(jìn)行8個樣品的標(biāo)記和同步分析比較。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)、軟件分析系統(tǒng)的不斷的發(fā)展和改進(jìn)，iTRAQ技術(shù)很有可能成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的支撐技術(shù)[7]。

蛋白組學(xué)與證候研究的結(jié)合，可以在一定層面上揭示中醫(yī)證候的內(nèi)涵，對證候的相關(guān)指標(biāo)體系的研究起到了積極的推動作用。我們利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證組的相關(guān)表達(dá)差異蛋白，并為蛋白質(zhì)層面的疾病與證候生物學(xué)基礎(chǔ)提供部分實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年4月至2010年12月內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科、急診心內(nèi)科、蒙醫(yī)科、體檢中心等收治的慢性心力衰竭患者45例，隨機分為CHF氣虛血瘀證組，CHF氣陰兩虛證組，健康對照組，每組15例，性別不限。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，嚴(yán)格遵循流行病學(xué)的原則，采用橫斷面的調(diào)查方法，采集信息以面訪方式進(jìn)行記錄，歸檔。每5例混合為一個樣品，每組3個樣品，共計9個樣品。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 1)診斷依據(jù)慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期依據(jù)(2007年中國慢性心力衰竭診斷治療指南)；2)證候診斷依據(jù)2002年國家食品與藥品監(jiān)督管理局頒布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，且由3名中醫(yī)醫(yī)師盲診，經(jīng)辨證一致者入選。

1.3 試劑與儀器 臺式電動離心機(80-1,杰瑞爾);萬分之一天平(HangPingFA1004,上海);超聲儀(KQ-250DE);數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(HPX-9082ME,上海博訊);飛行質(zhì)譜儀(MALDETOF，Bruker);振蕩器(HY-5型,江蘇省金壇市);高效液相色譜(HPLC)(島津半制備型HPLC系統(tǒng)流動相，A液：10 mM KH2PO4，25% ACN，用H3PO4pH3.0；B液：10 mM KH2PO4，2M KCl，25% CAN，用H3PO4pH3.0，陽離子交換柱：Phenomenex Luna 5u SCX 100A)；制冰機(SIM-F124，sanyo);納升級液相色譜(Nano LC，Proxeon Easy nano-LC，流動相A：H2O，0.1%FA，B：ACN，0.1%FA，色譜柱，C18反相色譜微柱(100 mm×75 μm)，5 micron)；純水機(Milli-Q，Millpore);酶標(biāo)儀(BIO-TEX公司,德國);高壓滅菌器(Labo Autoclave，sanyo)等。實驗材料包括：Triton X-100(Amersham Bioscience)；BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce)；iTRAQ?Reagent-8 Plex Multi-plex Kit(113-119,121)(Applied Biosystems Foster City，CA 94404 USA，批號：1006023)；proteoExtract Albumin/IgG Removal Kit Cat.No.122642(Merck)；疏水性C18柱(StrataTMXPalentpending Polymeric Reversed Phase)(phenomenex)；2D QUANT Kit(GE Healthcare)；Triethylammonium bicarbonate buffer(TEAB)(Sigma-Aldrich)；Trypsin Gold，Mass Spectrometry Grade(promega)；Zip Tip?Pipette Tips(Millipore)；TFA(MERCK)；CHCA(BRUKER)；CAN(fisher scientific)；IAM(CALBIOCHEM)。

1.4 方法 1)樣品制備：在患者入院第2天早晨6:00—8:00取被檢者空腹靜脈血5 mL，裝入血清管，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min，取上清，分裝至凍存管，-80 ℃保存；2)血清高豐度蛋白的去除；3)樣品沉淀及重溶；4)蛋白烷基化；5)2D QUANT Kit(GE)定量及消化；6)蛋白復(fù)溶及標(biāo)記；7)標(biāo)記肽段混合及SCX分離；8)除鹽及凍干；9)樣品復(fù)溶，MALDI檢測及上樣；10)數(shù)據(jù)庫搜索及統(tǒng)計學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 NCBI homan庫；Mascot軟件。得到質(zhì)譜的wjf、xmi文件格式的數(shù)據(jù)用數(shù)據(jù)庫搜索，軟件提取搜索結(jié)果中匹配肽段的保留時間、報告離子的強度等信息進(jìn)行蛋白鑒定及定量。數(shù)據(jù)都遞交至NCBI(homan庫)人數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相應(yīng)的搜索。我們運用david(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異蛋白進(jìn)行富集分析，數(shù)據(jù)分析采用fisher Exact test方法。鑒定到2個以上來自于同一個蛋白的肽段，認(rèn)為此蛋白可信，兩兩比值不等于1的肽段認(rèn)為存在差異。我們在本此實驗中選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且P值<0.05，認(rèn)為二者之間存在顯著差異，正負(fù)值表示該蛋白顯著上調(diào)或顯著下調(diào)。

2 結(jié)果

我們使用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法對健康對照組、CHF氣虛血瘀證組、CHF氣陰兩虛證組的血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，研究設(shè)計每組15例，每5例混合為一個樣品，每組3個樣品，共計9個樣品。比較CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組分別與健康對照組比較，找出各組表達(dá)的差異蛋白，具體結(jié)果及詳細(xì)描述如下。

2.1 流行病學(xué)一般資料 30例CHF患者合并疾病情況分析，所有入組CHF病例基礎(chǔ)病因均為冠心病，其中合并高血壓者14例，合并陳舊心梗者7例，合并糖尿病和高血脂者各3例。見表1。

表1 30例CHF患者合并疾病的構(gòu)成情況[例(%)]

2.2 30例CHF患者性別年齡分布情況 所有入組CHF病例在性別及年齡上比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表2。

表2 30例CHF組性別年齡分布情況

2.3 2與健康對照組比較各組間表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 我們選取以119(或121)標(biāo)記的健康對照組的蛋白質(zhì)作為參照，平行檢測，3次生物學(xué)重復(fù)。那么，3次iTRAQ的結(jié)果如何呢？經(jīng)分析得知，第1組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是387個和34個，第2組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是305個和29個，第3組已鑒定的蛋白質(zhì)和表達(dá)差異蛋白質(zhì)分別是386個和36個。去除冗余，實際得到58個蛋白，這58個蛋白質(zhì)在健康對照組、CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組血清中分別被標(biāo)記了已知的同位素。比較某一蛋白質(zhì)在不同組分之間的表達(dá)差異，我們通過該蛋白在不同標(biāo)記下的峰面積之間的比值來計算。我們選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且同時滿足P<0.05時，我們認(rèn)為該蛋白在相應(yīng)組中明顯上調(diào)或明顯下調(diào)。

2.4 與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 選擇以119(或121)標(biāo)記的健康對照組的蛋白質(zhì)作為參照，保證每一個樣品技術(shù)重復(fù)2次并且在3次iTRAQ實驗中至少2次或3次出現(xiàn)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)作為入選標(biāo)準(zhǔn)，共找到CHF氣虛血瘀證表達(dá)差異蛋白質(zhì)16個，其中11個蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)(向上的箭頭)，5個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)(向下的箭頭)。具體分析結(jié)果見表3。

表3 與健康組比較CHF氣虛血瘀證差異蛋白質(zhì)列表

注：1、差異倍數(shù)≥1.2倍；2、*示：NCBI數(shù)據(jù)庫中未找見的無名蛋白質(zhì)

表4 與健康組比較CHF氣陰兩虛證差異蛋白質(zhì)列表

注：1、差異倍數(shù)≥1.2倍；2、*示：NCBI數(shù)據(jù)庫中未找見的無名蛋白質(zhì)

2.4 與健康對照組比較CHF氣陰兩虛證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì) 選擇以119(或121)標(biāo)記的健康對照組的蛋白質(zhì)作為參照，保證每一個樣品技術(shù)重復(fù)2次并且在3次iTRAQ實驗中至少2次或3次出現(xiàn)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)作為入選標(biāo)準(zhǔn)，共找到CHF氣陰兩虛證表達(dá)差異蛋白質(zhì)15個，其中10個蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)(向上的箭頭)，5個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)(向下的箭頭)。具體分析結(jié)果見表4。

3 討論

本研究擬通過運用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證患者血清樣品，比較并歸類血清表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，篩選及可能做為CHF證候特異性標(biāo)志物。對表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行歸類，試圖尋找可能與CHF中醫(yī)證候有關(guān)聯(lián)的生物學(xué)指標(biāo)或群，進(jìn)而為CHF證型規(guī)范化研究提供實驗依據(jù)，有望更好的指導(dǎo)臨床。

3.1 與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)

3.1.1 表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì) 1)代謝紊亂：物質(zhì)在體內(nèi)的消化、吸收、運轉(zhuǎn)、分解等與生理有關(guān)的代謝過程稱為物質(zhì)代謝。物質(zhì)代謝既有同化作用又有異化作用。提起代謝紊亂CHF氣虛血瘀證組在本實驗中主要涉及到脂質(zhì)代謝紊亂及透明質(zhì)酸代謝異常。前者主要包括載脂蛋白E、載脂蛋白D前體，而后者主要包括ITIH1、IHRP。眾所周知，脂類向身體各部位的運輸是靠脂蛋白(Lipoproteins)來完成的。血漿中的各類脂蛋白都由蛋白質(zhì)和脂類兩部分組成，其蛋白質(zhì)部分主要為載脂蛋白(Apolipoprotein，apo)。目前發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白有20種之多，主要有apoA、apoB、apoC、apoD、apoE、apoJ等類型。主要在肝(部分在小腸)合成，載脂蛋白是運載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)等功能。載脂蛋白D(Apolipoprotein D，apoD)是一個29 kD的糖蛋白，它最初是在人血漿的高密度脂蛋白中被分離出來的。apoD在結(jié)構(gòu)上與其他類型的載脂蛋白存在很大的差異，被歸入脂肪促成素家族。apoD可以與膽固醇、黃體酮、膽紅素等多種疏水性小分子結(jié)合，另外，apoD在多種脊椎動物的各類組織中廣泛表達(dá)，提示apoD在脊椎動物中重要的生理功能。近來研究表明，apoD可作為多種癌癥及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的早期診斷標(biāo)記物而備受關(guān)注[8]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)CHF氣虛血瘀證組有載脂蛋白D前體，并且表達(dá)上調(diào)，可能說明CHF氣虛血瘀證有脂類代謝的變化。除此之外還有ApoE，它是存在于多種脂蛋白顆粒中，是正常人血漿脂蛋白中重要的載脂蛋白成分，主要功能為運輸并介導(dǎo)某些脂蛋白與相應(yīng)的受體。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ApoE參與磷脂及膽固醇的動員和再分布，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持膽固醇平衡，同時還參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷后的修復(fù)過程。ApoE主要由肝臟產(chǎn)生，還有腦、脾、腎上腺等組織和單核巨噬細(xì)胞也合成ApoE(約為總量的10%～20%)[9]。另有文獻(xiàn)指出ApoE可作為肝細(xì)胞癌HCC的一個組織學(xué)標(biāo)記物[10]。間α胰蛋白酶抑制劑(Interatrypsininhibitor，ITI)家族是在人和動物的血液中存在的一種蛋白質(zhì)[11]，ITI包括ITIH1，ITIH2，ITIH3，ITIH4和ITIH5，以及輕鏈bikunin。Bour-guignon對人類健康肺組織和惡性組織中ITI輕鏈和重鏈進(jìn)行免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)不但I(xiàn)TI輕鏈與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，ITI重鏈也與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[12]。本實驗中發(fā)現(xiàn)的此類蛋白質(zhì)有間-α胰蛋白酶抑制劑重鏈(ITIH1)、α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關(guān)蛋白(IHRP)在CHF氣虛血瘀證組均上調(diào)。ITI家族所有成員在惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中均起著不同的重要作用[13]。2)補體相關(guān)：補體是存在于正常人和動物血清與組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。主要承擔(dān)機體調(diào)節(jié)、免疫、炎性反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能。本實驗中CHF氣虛血瘀證組與補體系統(tǒng)相關(guān)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)有C9、補體C5前蛋白原，且在CHF氣虛血瘀證組的表達(dá)均上調(diào)。有研究證明腦出血后補體級聯(lián)激活C9高表達(dá)并有沉積[14-15]。另有研究指出，與良性卵巢腫瘤比較，在卵巢上皮性癌中，銅藍(lán)蛋白、C9蛋白表達(dá)上調(diào)[16]。3)免疫相關(guān)：α-2巨球蛋白前體(Alpha-2-macroglobulin precursor)為α-2巨球蛋白的前體物質(zhì)。α-2巨球蛋白是血漿中一種主要的四聚體糖蛋白，是由肝細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中合成，是所有已知內(nèi)蛋白酶的循環(huán)性抑制劑。對人體許多病理、生理過程發(fā)揮重要作用[17]。它與淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能有密切聯(lián)系。該蛋白在CHF的氣虛血瘀證組中表達(dá)上調(diào)。4)炎性反應(yīng)相關(guān)：與炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)主要是血清淀粉樣蛋白A-4蛋白前體(SAA4)。我們知曉血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)通常被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的主要蛋白之一，SAA家族有4個成員，分別按被發(fā)現(xiàn)的順序命名為SAA1、2、3、4，最近越來越多的報道SAA參與了多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。5)細(xì)胞凋亡相關(guān)：半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白(Galectin-3-binding Protein)為一種β半乳糖苷結(jié)合的凝集素，是脊椎動物半乳糖凝集素家族中的一種亞型，相對分子質(zhì)量為31 000，它可通過與配體的反應(yīng)發(fā)揮很多生物學(xué)效應(yīng)。半乳糖凝集素3在活化的嗜堿性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及一些感覺神經(jīng)元中表達(dá)最多。它主要存在于細(xì)胞漿中，尚可存在于細(xì)胞核、表面或胞外[19]。現(xiàn)已證實半乳糖凝集素3在許多上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中有表達(dá)且參與多種細(xì)胞功能，尤其在mRNA剪接過程中發(fā)揮重要的作用，它還參與細(xì)胞生長，免疫調(diào)節(jié)等。有一項研究證明，惡性腫瘤中半乳糖凝集素3表達(dá)增高可能與它刺激細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[20]。本實驗中半乳糖凝集素-3-結(jié)合蛋白在CHF在氣虛血瘀證組表達(dá)上調(diào)。6)無名蛋白質(zhì)：發(fā)現(xiàn)2個NCBI庫中無名蛋白質(zhì)分別為gi|37138和gi|16553735，前者13個肽段被標(biāo)記，后者2個肽段被標(biāo)記。

3.1.2 表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì) 1)代謝相關(guān)：代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)主要有胰蛋白酶抑制劑、TBPA、載脂蛋白C-Ⅲ前體，下面逐一探討。胰蛋白酶抑制劑(Trypsin Inhibitor)，它抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，從而阻止胰腺中其他活性蛋白酶原的激活及其他的自身激活。本次實驗中CHF氣虛血瘀證組該蛋白表達(dá)下調(diào)。TBPA是甲狀腺素運載蛋白的前體物質(zhì)，有報道稱，肺淀粉樣病變的淀粉樣物的來源主要來自血漿甲狀腺素運載蛋白。本實驗中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組下調(diào)。我們曉得載脂蛋白C是目前所知載脂蛋白中分子量最小的一類，在本實驗中與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組ApoCⅢ前體下調(diào)。50年代Shore等分別報道，VLDL中ApoA和B外，還有第3種載脂蛋白。2)免疫相關(guān)：DBP是一種具有多種功能的蛋白質(zhì)，主要參與維生素D的轉(zhuǎn)運和清除肌動蛋白，并具有免疫調(diào)節(jié)作用[21]。本實驗中CHF氣虛血瘀證組表達(dá)下調(diào)。3)炎性反應(yīng)相關(guān)：我們知道炎性反應(yīng)在冠心病發(fā)病過程中的作用，但是炎性反應(yīng)是否參與CHF的形成機制呢？我們在CHF組中發(fā)現(xiàn)銅藍(lán)蛋白前體(Ceruloplasmin Precursor)，是銅藍(lán)蛋白(CP/CER)的前體物質(zhì)。CP是血清中的含銅蛋白質(zhì)，結(jié)合6或7個銅離子，亮藍(lán)色，在銅解毒和貯存以及鐵代謝中起重要作用，有可能參與清除氧自由基和超氧陰離子。本實驗中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組表達(dá)下調(diào)。

3.2 與健康對照組比較CHF氣陰兩虛證組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)

3.2.1 表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì) 與健康對照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有C 9、IHRP、α-2巨球蛋白前體、ITIH1、SAA4前體、胰蛋白酶抑制劑、TBPA、補體C5前蛋白原、ApoC-II和gi|16553735，以上10個蛋白在前面均已敘述過，在此省略。

3.2.2 表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì) 與健康對照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)有DBP、銅藍(lán)蛋白前體、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白、前血清淀粉樣蛋白P(Pre-serum Amyloid P Component，SAP)、免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region，IgVH)，其中前3者均已在前面敘述過，下面主要詳細(xì)探討后兩者蛋白質(zhì)。

SAP是一種非纖維血漿糖蛋白，屬于pentraxin家庭，系由肝臟合成的糖蛋白，廣泛存在于所有脊椎動物的血液中，人血清中的含量約為30～50 mg/L，它由10個相同的分子量均為25KD的亞基組成，亞基間通過非共價鍵連接而成2個完全相同的環(huán)狀平行五聚體蛋白質(zhì)[22-23]。SAP通過Ca2+依賴性方式與多種配體結(jié)合，包括纖連蛋白、黏多糖、C4b結(jié)合蛋白、補體成分、聚合IgG、C反應(yīng)蛋白(CRP)、淀粉樣原纖維、膠原蛋白等。SAP可能通過激活并調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)干擾脂蛋白代謝，參與淀粉樣蛋白的形成[24]。張鳳珍等報道稱[25]，血漿HDL的生理功能是完成膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，將肝外組織膽固醇轉(zhuǎn)運到肝內(nèi)轉(zhuǎn)化排泄，故HDL有利于降低血膽固醇，將其視為有抗動脈粥樣硬化作用。VLDL可將肝內(nèi)合成的內(nèi)源性TG轉(zhuǎn)運出肝到外周組織，經(jīng)LPL催化降解為脂肪酸和甘油。LDL將肝內(nèi)合成內(nèi)源性膽固醇轉(zhuǎn)運到外周組織，故將其視為致動脈粥樣硬化因子。人血清中，SAP與HDL呈負(fù)相關(guān)，與VLDL呈正相關(guān)。SAP與血漿HDL、VLDL結(jié)合，具有較高親和力，而不與LDL結(jié)合。研究還顯示，SAP的功能與連接脂蛋白相互作用的能力相關(guān)，特別在動脈粥樣硬化和淀粉樣病變的發(fā)病機制中起了重要作用。還發(fā)現(xiàn)，它有助于保持淀粉樣蛋白沉積的穩(wěn)定。與健康對照組比較SAP在CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)，說明有脂類代謝的變化。

免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)，重鏈大小約為輕鏈的2倍。根據(jù)H鏈抗原性的差異將其分為5類：μ、γ、α、δ和ε鏈，不同H鏈和L鏈(κ或λ鏈)組成完整Ig的分子分別稱之為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ鏈上含有4個肽，μ和ε鏈含有5個環(huán)肽。Ig是體液免疫應(yīng)答中，免疫功能最重要的免疫分子。該蛋白質(zhì)在CHF氣陰兩虛證組表達(dá)下調(diào)。

總之，利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測結(jié)果在一定程度上能夠反映CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)，可能更客觀的評價證候特征，有可能為CHF證候的診治提供新的血清標(biāo)志物。但是，機體是一個完整的、相互聯(lián)系的復(fù)雜體系，而證候則是對機體在疾病某一階段的整體狀態(tài)的反應(yīng)。因此，很難簡單地用一個或幾個蛋白質(zhì)的變化來囊括此狀態(tài)。某一個蛋白質(zhì)的上調(diào)或下調(diào)往往會影響上下游幾個蛋白的表達(dá)狀態(tài)。需要從“同病異證”和“異病同證”的蛋白表達(dá)譜差異中尋找證候的共同性和差異性，從而揭示證候的科學(xué)內(nèi)涵。故，我們在將來的研究中，更應(yīng)該深入研究，在中醫(yī)證候?qū)W領(lǐng)域進(jìn)行更廣、更深的研究。