補(bǔ)腎健脾方對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)及血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶7表達(dá)的影響

王元惠　馮媛媛　韓植芬

摘要：目的 觀察補(bǔ)腎健脾方對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)及血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）表達(dá)的影響，探討其抗結(jié)腸癌的部分作用機(jī)制。方法 裸鼠腋下接種人結(jié)腸癌細(xì)胞，建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。隨機(jī)分為模型組、5-氟尿嘧啶組和補(bǔ)腎健脾方低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物，連續(xù)3周。各組處死6只荷瘤鼠，測(cè)量瘤體質(zhì)量，計(jì)算相對(duì)抑瘤率；ELISA測(cè)定血清VEGF及MMP-7表達(dá)；剩余荷瘤鼠用于觀察生存時(shí)間。結(jié)果 補(bǔ)腎健脾方各劑量組瘤體質(zhì)量較模型組均明顯降低，荷瘤鼠生存時(shí)間較模型組明顯延長(zhǎng)；與模型組比較，補(bǔ)腎健脾方各劑量組VEGF、MMP-7表達(dá)均明顯下降。結(jié)論 補(bǔ)腎健脾方可抑制人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間，其機(jī)制可能與下調(diào) VEGF、MMP-7表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎健脾方；結(jié)腸癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶7；BALB/c 裸鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.013

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0053-03

Effects of Bushen Jianpi Prescription on Tumor Growth in Subcutaneous Colorectal Cancer Xenografts in Mice and Expressions of VEGF and MMP-7

WANG Yuan-hui1，2， FENG Yuan-yuan2， HAN Zhi-fen2， SUN Xiao-ting2， LIU Xuan2， DENG Wan-li2， LI Qi2

1. Jiangwan Hospital， Hongkou District， Shanghai 200434， China；

2. Shuguang Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Jianpi Prescription on tumor growth in subcutaneous colorectal cancer xenografts in mice and expressions of VEGF and MMP-7； To discuss its mechanism of anti-colon cancer. Methods Nude mice were inoculated subcutaneously into human colon cancer cells to establish human colon cancer xenograft models. Nude mouse models of subcutaneous colorectal cancer xenografts were randomly divided into model group， 5-FU group， Bushen Jianpi low-， medium-， and high-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for three weeks. Six tumor-bearing mice in each group were sacrificed. Tumor mass was measured， and the relative inhibition rate was calculated. The serum levels of VEGF and MMP-7 were measured by ELISA. The remaining tumor-bearing mice were used to observe the survival time. Results Compared with model group， the weight of tumor were reduced and the median survival time of mice were prolonged in Bushen Jianpi groups， as well as the expression levels of VEGF and MMP-7 significantly decreased Bushen Jianpi groups. Conclusion Bushen Jianpi Prescription can inhibit the growth of human colon cancer xenografts in nude mice and prolong the survival time of tumor-bearing mice， which may be related to the down-regulation of the expressions of VEGF and MMP-7.

Keywords： Bushen Jianpi Prescription； colorectal cancer； VEGF； MMP-7； BALB/c nude mice

大腸癌目前治療方法以手術(shù)切除、放化療為主，但仍有高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率及高病死率的特點(diǎn)。中醫(yī)藥在防治腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有一定的療效[1-2]。復(fù)方補(bǔ)腎健脾方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤科臨床經(jīng)驗(yàn)方，有益氣補(bǔ)腎健脾、解毒消腫散結(jié)之功效，臨床療效較好[3]，但其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用補(bǔ)腎健脾方進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的作用，探討其抗結(jié)腸癌的部分機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物

人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo，上海博谷生物有限公司。雄性BALB/c裸鼠80只，SPF級(jí)，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2016-0019。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

補(bǔ)腎健脾方由黃芪、白術(shù)、女貞子、肉蓯蓉、野葡萄藤、石見穿、八月札組成，其提取物由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院制備及質(zhì)量控制。

1.3 主要試劑與儀器

F12K培養(yǎng)基及胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭東海普藥業(yè)有限公司；人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、人基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）ELISA試劑盒，上海博谷生物科技有限公司。雙人垂直流超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO），臺(tái)式低速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），熒光倒置顯微鏡（日本OLMYPUS），CO2培養(yǎng)箱（英國(guó)RSBiotech）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

F12K培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1.5 g/L碳酸氫鈉、1.5 mmol/L L-谷氨酰胺）培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2孵箱。

2.2 人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型建立

將人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞制成濃度為1×107/mL懸液。取3只BALB/c裸鼠，將細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部近右上肢皮膚（其中一只雙側(cè)上肢皮膚），接種量0.2 mL/只。待瘤體生長(zhǎng)直徑達(dá)1～1.2 cm，選擇腫瘤瘤體生長(zhǎng)相對(duì)比較旺盛且無潰破荷瘤鼠作為供瘤鼠，剝?nèi)×鲶w，去除壞死組織及纖維組織，選擇腫瘤邊緣相對(duì)比較新鮮的腫瘤組織，將其剪成約1 mm3，無菌環(huán)境將其接種到裸鼠右側(cè)腋窩的皮下。按上述方法予以傳代2代后，將腫瘤組織大量接種于裸鼠腋窩皮下，構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型。待腫瘤生長(zhǎng)到體積約100～300 mm3，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 分組及給藥

將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、5-FU組和補(bǔ)腎健脾方低劑量（BSJP-L）、中劑量（BSJP-M）、高劑量（BSJP-H）組，每組12只。BSJP-L組、BSJP-M組、BSJP-H組予補(bǔ)腎健脾方提取物250、500、1000 mg/（kg·d）灌胃，5-FU組每2 d腹腔注射5-FU 50 mg/kg，模型組予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積均為5 mL/kg，連續(xù)3周。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間每隔1 d測(cè)量腫瘤直徑并稱定裸鼠體質(zhì)量。給藥3周后將每組6只裸鼠處死后摘除眼球并取血，收集血清，取出移植瘤瘤體，測(cè)量瘤體長(zhǎng)、短徑及質(zhì)量，瘤體用福爾馬林固定，石蠟包埋。計(jì)算腫瘤體積（TV=ab2/2，a、b分別表示腫瘤長(zhǎng)、短徑）和抑瘤率[（l-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量÷對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%]。每組剩余6只裸鼠用于觀察生存時(shí)間，計(jì)算生存延長(zhǎng)率[（治療組平均生存天數(shù)-對(duì)照組平均生存天數(shù)）÷對(duì)照組平均生存天數(shù)×100%]。

ELISA檢測(cè)血清VEGF和MMP-7表達(dá)，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，采用方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 補(bǔ)腎健脾方對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤抑瘤率的影響

隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，各組瘤體體積大小逐漸出現(xiàn)差距，各給藥組瘤體質(zhì)量小于模型組（P<0.05，P<0.01）；各給藥組抑瘤率比較差異明顯（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 補(bǔ)腎健脾方對(duì)荷瘤鼠生存時(shí)間的影響

各給藥組荷瘤鼠中位生存時(shí)間較模型組明顯延長(zhǎng)（P<0.05，P<0.01），各給藥組生存延長(zhǎng)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 補(bǔ)腎健脾方對(duì)荷瘤鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶7表達(dá)的影響

各給藥組VEGF、MMP-7表達(dá)較模型組明顯下降（P<0.05，P<0.01），各給藥組VEGF、MMP-7表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表3。

5 討論

大腸癌屬中醫(yī)學(xué)“腸溜”“腸澼”“積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本虛標(biāo)實(shí)是大腸癌的病機(jī)特點(diǎn)，本虛為脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)為濕熱毒邪積聚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌在脾虛濕熱證的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)移患者多伴有腎虛或者潛在腎虛的特征。因此，治法當(dāng)以益氣補(bǔ)腎健脾為主，兼顧解毒消腫散結(jié)。補(bǔ)腎健脾方中黃芪補(bǔ)氣健脾，肉蓯蓉、女貞子益腎，三者合用為君，以實(shí)補(bǔ)腎健脾之能；白術(shù)功主健脾益氣，是以為臣；石見穿、野葡萄藤二者合用以主清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)之功，八月札功主理氣，共行佐使之責(zé)。諸藥集補(bǔ)脾、益腎、消結(jié)、化瘤之功效為一體。綜觀全方，藥雖簡(jiǎn)，然力專甚，扶正不助邪，驅(qū)邪不傷正。本實(shí)驗(yàn)通過建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用補(bǔ)腎健脾方進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾方可明顯抑制人結(jié)腸癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步觀察荷瘤鼠生存期，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾方可明顯延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間。

腫瘤血管新生或血管生成是實(shí)體瘤生長(zhǎng)非常關(guān)鍵的因素。惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤血管的生成，如無血管生成，原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)不會(huì)超過1～2 mm3，其繼續(xù)生長(zhǎng)必須依賴新血管的形成，以提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧，帶走代謝產(chǎn)物。同時(shí)新生血管管壁不完整，呈高通透狀態(tài)，利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑制因子兩者的有機(jī)調(diào)控：一旦血管生成因子上調(diào)或血管生成抑制因子功能障礙，二者平衡被打破即發(fā)生腫瘤血管新生[4-6]。VEGF是刺激腫瘤血管生成的最強(qiáng)的、特異性最高的促血管生長(zhǎng)因子之一。當(dāng)VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)時(shí)，能明顯刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其快速增殖，進(jìn)而介導(dǎo)大量血管的新生，從而為腫瘤組織的生長(zhǎng)提供所必需的大量營(yíng)養(yǎng)及能量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-7在MMPs家族中與腫瘤的關(guān)系最為密切，是唯一在腫瘤細(xì)胞而非腫瘤間質(zhì)表達(dá)的MMPs。當(dāng)MMP-7被激活后，它不僅能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖來介導(dǎo)腫瘤新生血管的生成，還能通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)補(bǔ)腎健脾方對(duì)裸鼠血清VEGF和MMP-7表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)腎健脾方低、中、高劑量組VEGF、MMP-7表達(dá)明顯下降。

綜上，補(bǔ)腎健脾方能抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間，其機(jī)制可能與下調(diào)VEGF和MMP-7表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2017-10-11）

（修回日期：2017-11-26；編輯：華強(qiáng)）